《酶聯(lián)免疫試劑盒檢測通則》編制說明

國家標(biāo)準(zhǔn)《酶聯(lián)免疫試劑盒檢測通則》編制說明

一任務(wù)來源

根據(jù)國家化標(biāo)準(zhǔn)管理委員會(huì)文件[2019]22號《國家化標(biāo)準(zhǔn)管理委員會(huì)關(guān)于下達(dá)

2019年第二批推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃的通知》，項(xiàng)目編號為：20192274-T-424的“酶聯(lián)

免疫分析試劑盒檢測通則”列入2019年推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)的制修訂計(jì)劃。

本標(biāo)準(zhǔn)由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)由江南大學(xué)、中國計(jì)量大學(xué)、中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院等單位起草。

二標(biāo)準(zhǔn)制定的目的和意義

酶聯(lián)免疫試劑盒，是指能完成酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinkedimmunosorbent

assay，ELISA）必需試劑和器材的集合，其檢測原理是將一定濃度的抗原或者抗體

通過物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待檢標(biāo)本，通過酶標(biāo)物顯色

的深淺間接反映被檢抗原或者抗體的存在與否或者量的多少。其具有檢測通量高、

操作簡單、快速等特點(diǎn)，適于現(xiàn)場檢測使用，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品、農(nóng)業(yè)、生

化等檢測領(lǐng)域，市場上常用的有細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子ELISA試劑盒、免疫

腫瘤學(xué)ELISA試劑盒、神經(jīng)生物學(xué)ELISA試劑盒、牛孕酮ELISA試劑盒、葡萄糖-6-

磷酸酶活性檢測ELISA試劑盒以及抗生素殘留、農(nóng)藥殘留、真菌毒素等各類ELISA試

劑盒等。

隨著ELISA檢測技術(shù)的普遍應(yīng)用，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定也隨之增多。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)

的檢索結(jié)果可知，現(xiàn)有采用ELISA檢測方法的國家標(biāo)準(zhǔn)共有20項(xiàng)（表1），行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

34項(xiàng)，地方標(biāo)準(zhǔn)35項(xiàng)；主要是針對某種特定目標(biāo)物（真菌毒素、農(nóng)獸藥、微生物等）

ELISA檢測方法的規(guī)定。此外，有《酶免疫檢測抗體檢測通則》（GB/T40265-2021）

規(guī)定了酶免疫檢測抗體檢測的一般要求、檢測過程和結(jié)果表述，適用于酶免疫檢測

用抗體的檢測控制，不適用于具有標(biāo)記物的酶免疫檢測用抗體的檢測控制。另有1項(xiàng)

《酶聯(lián)免疫分析試劑盒通則》（GB/T33411-2016），其規(guī)定了酶聯(lián)免疫分析試劑盒

的技術(shù)要求、檢驗(yàn)方法、使用說明書和標(biāo)簽，適用于小分子化合物檢測用的酶聯(lián)免

疫分析試劑盒；該標(biāo)準(zhǔn)屬于ELISA試劑盒產(chǎn)品通則，除適用范圍不適用于大分子化合

物檢測的試劑盒外，其主要對試劑盒的組成及要求、標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性、靈敏度、定

量限、精密度以及正確度等進(jìn)行了規(guī)定，缺乏對檢測樣品、檢測過程以及參比方法

一致性等檢測要求相關(guān)的規(guī)定。此外，衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)WS/T124-1999《臨床化學(xué)體外

診斷試劑盒質(zhì)量檢驗(yàn)總則》對臨床用化學(xué)體外診斷試劑盒質(zhì)量規(guī)定了技術(shù)要求；2005

2

年，我國農(nóng)業(yè)部對獸藥殘留檢測的免疫試劑盒有官方注冊（備案）管理要求，出臺(tái)

了《關(guān)于加強(qiáng)獸藥殘留檢測試劑（盒）管理的通知》（農(nóng)辦醫(yī)[2005]3號），制定了

《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑（盒）備案審查技術(shù)資料要求》和《獸藥殘留試劑（盒）

備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)》，對獸藥殘留檢測試劑（盒）進(jìn)行管理。國家食品藥品管理局

標(biāo)準(zhǔn)YY/T1183-2010《酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑》對在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室用酶聯(lián)免疫試劑盒

規(guī)定了通用技術(shù)要求；2011年，原國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布了SN/T2775-2011

《商品化食品檢測試劑盒評價(jià)方法》規(guī)定了用于食品檢測的商業(yè)化檢測試劑盒評價(jià)

方法的通用要求，適用于商品化食品檢測試劑盒生產(chǎn)企業(yè)、用戶及第三方機(jī)構(gòu)在生

產(chǎn)或使用商品化食品檢測試劑盒對相關(guān)技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)，其中對商品化食品試劑

盒的包裝、評價(jià)實(shí)驗(yàn)室以及評價(jià)方法給出了具體要求；評價(jià)指標(biāo)包括線性和范圍、

檢測限、定量限、正確度、特異性、精密度、耐變形以及與參考檢測方法的比較，

具體評價(jià)方法中將與參考檢測方法的比較納入正確度的指標(biāo)中。食藥監(jiān)辦械函

[2013]3號公示了《酶聯(lián)免疫法檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》，主要針對酶聯(lián)免

疫類檢測試劑的主要原材料、生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系、產(chǎn)品質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)提出指導(dǎo)

性技術(shù)要求。

表1.現(xiàn)有關(guān)于ELISA檢測方法的國家標(biāo)準(zhǔn)

序號標(biāo)準(zhǔn)編號標(biāo)準(zhǔn)名稱

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定

1GB5009.22-2016

（第四法酶聯(lián)免疫吸附篩查法）

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素M族的測定

2GB5009.24-2016

（第三法酶聯(lián)免疫吸附篩查法）

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中赭曲霉毒素A的測定

3GB5009.96-2016

（第四法酶聯(lián)免疫吸附測定法）

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中T-2毒素的測定

4GB5009.118-2016

（第二法間接ELISA法，以及第三法直接ELISA法）

5GB/T40368-2021植物代謝產(chǎn)物胰蛋白酶抑制因子測定酶聯(lián)免疫吸附法

紡織品生物化學(xué)分析方法第2部分：擬除蟲菊酯類農(nóng)藥

6GB/T40175.2-2021

（酶聯(lián)免疫法）

紡織品生物化學(xué)分析方法第3部分：有機(jī)磷類農(nóng)藥

7GB/T40175.3-2021

（酶聯(lián)免疫法）

8GB/T40220-2021植物代謝產(chǎn)物大豆凝集素測定酶聯(lián)免疫吸附法

9GB/T40223-2021植物代謝產(chǎn)物游離棉酚測定酶聯(lián)免疫吸附法

犬科動(dòng)物感染細(xì)粒棘球絳蟲糞抗原的抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試

10GB/T32948-2016

驗(yàn)檢測技術(shù)

11GB/T17999.6-2008SPF雞微生物學(xué)監(jiān)測第6部分：SPF雞酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

12GB/T17480-2008飼料中黃曲霉毒素B1的測定酶聯(lián)免疫吸附法

3

食品中沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157及單核細(xì)胞增生

13GB/T22429-2008

李斯特氏菌的快速篩選檢驗(yàn)酶聯(lián)免疫法

14GB/T21330-2007動(dòng)物源性食品中鏈霉素殘留量測定方法-酶聯(lián)免疫法

15GB/T21329-2007動(dòng)物源性食品中慶大霉素殘留量檢驗(yàn)方法酶聯(lián)免疫法

16GB/T21319-2007動(dòng)物源食品中阿維菌素類藥物殘留的測定酶聯(lián)免疫吸附法

17GB/T18932.28-2005蜂蜜中四環(huán)素族抗生素殘留量測定方法酶聯(lián)免疫法

18GB/T18932.27-2005蜂蜜中泰樂菌素殘留量測定方法酶聯(lián)免疫法

19GB/T18932.21-2003蜂蜜中氯霉素殘留量的測定方法酶聯(lián)免疫法

20GB/T14926.50-2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

國外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)也主要以特定分析物的ELISA檢測技術(shù)應(yīng)用指南為主，如XP

V03-147:2020《食品.真菌毒素的測定.酶免疫試劑盒微孔板(ELISA試劑盒)的使用指

南（Foodstuffs-Determinationofmycotoxins-Guideofuseofimmunoenzymatickits

microplateformat(kitsELISA)）》、NFV03-814*NFEN17254:2019《食品.酶聯(lián)免疫

吸附試驗(yàn)測定谷蛋白的最低性能要求（Foodstuffs-Minimumperformancerequirements

fordeterminationofglutenbyELISA）》、NFV03-054:2011《食品.用于食物過敏原

檢測的ELISA技術(shù)實(shí)施的良好實(shí)踐指南（Foodproducts-Goodpracticeguidanceon

implementationofELISAtechniquesforfoodallergensdetection）》、BSENISO

18330-2003《牛奶和奶制品.抗菌劑殘留物檢測用免疫分析或受體分析的標(biāo)準(zhǔn)化描述

指南》和NFU47-019-2010《動(dòng)物健康分析方法.酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)技術(shù)應(yīng)用

的良好實(shí)施指南（Animalhealthanalysismethods-Guideofgoodpracticesfor

implementationofELISAtechniques）》。2003年，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織發(fā)布了《食品和

飼料中微生物檢測可替代方法驗(yàn)證規(guī)范》（ISO16140：2003），是針對微生物快檢

方法的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，為市場上的微生物相關(guān)快檢產(chǎn)品的評價(jià)認(rèn)證提供了非常好的依據(jù)；

法國標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)在ISO16140：2003的基礎(chǔ)上增加了實(shí)用性評價(jià)。1989年，國際分析

化學(xué)師協(xié)會(huì)（AOAC）出臺(tái)了針對檢測試劑盒的指南：AOACResearchInstituteTestKit

DefinitionsandModificationsGuideline，對檢測試劑盒做了定義，沒有形成評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

ELISA試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)也發(fā)展迅速，但在各類檢測試劑盒的品種多樣的情況

下，并沒有對適用于所有酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的檢測技術(shù)要求進(jìn)行具體規(guī)定。因?yàn)?/p>

ELISA測定過程中影響因素較多，對其操作中有一定的技術(shù)要求，在檢測過程中除正

常反應(yīng)外，有時(shí)常見到一些錯(cuò)誤的結(jié)果。引起ELISA測定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有：①

標(biāo)本因素，如血清樣本稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確，可能產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng)，造成假陰

性或假陽性的結(jié)果；②試劑因素，ELISA檢測的核心試劑為生物制品，如抗原、抗體、

4

酶標(biāo)底物等，不同批次的生物制品質(zhì)量有差異，同一批生物制品在不同保存時(shí)間和

不同保存條件下的質(zhì)量是不同的，即生物制品的性質(zhì)具有可變性和易變性，易受各

種因素的影響，如貯存溫度以及恢復(fù)室溫的時(shí)間等；③操作因素，如溫育時(shí)間、比

色時(shí)間、比色波長的選擇等。如果沒有完善的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和方法，即使上等的ELISA

試劑盒也有可能得出錯(cuò)誤的結(jié)果，因此，需要對ELISA試劑盒檢測的具體操作過程以

及結(jié)果處理進(jìn)行相關(guān)規(guī)定，這對于保證ELISA試劑盒適用對象進(jìn)行正確的ELISA操作

以及保證ELISA結(jié)果的準(zhǔn)確度，具有重要的指導(dǎo)意義。

三標(biāo)準(zhǔn)編制過程

1、2019年7月8日，國家化標(biāo)準(zhǔn)管理委員會(huì)文件[2019]22號《國家化標(biāo)準(zhǔn)管理委

員會(huì)關(guān)于下達(dá)2019年第二批推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃的通知》，項(xiàng)目編號為：

20192274-T-424的“酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測通則”列入2019年推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)的

制修訂計(jì)劃。隨后成立了標(biāo)準(zhǔn)研制小組。開始了標(biāo)準(zhǔn)方法的研究工作。

2、2020年1月至2020年12月，在前期的工作基礎(chǔ)上，對不同檢測對象的同類試

劑盒以及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行調(diào)研，確定ELISA試劑盒的檢測指標(biāo)，進(jìn)一步完善標(biāo)準(zhǔn)文

本。

3、2021年1月至2021年12月，選取不同類型的ELISA試劑盒，對相關(guān)的檢測指標(biāo)

進(jìn)行測試。

4、2022年1月至2022年11月，選取5家驗(yàn)證單位，分別對相應(yīng)的檢測指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)

證測試，并根據(jù)檢測指標(biāo)的測試結(jié)果，形成征求意見稿。

四標(biāo)準(zhǔn)編制原則和編制依據(jù)

在標(biāo)準(zhǔn)的制定過程中，嚴(yán)格貫徹國家有關(guān)方針、政策、法律和規(guī)章等，嚴(yán)格執(zhí)

行強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。與相關(guān)的各種基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)相銜接，遵循了政策性和協(xié)

調(diào)同一性的原則。

本標(biāo)準(zhǔn)的格式按GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫

規(guī)則》要求，其技術(shù)內(nèi)容參照WS/T124-1999《臨床化學(xué)體外診斷試劑盒質(zhì)量檢驗(yàn)

總則》、GBT33411-2016《酶聯(lián)免疫分析試劑盒通則》、GBT40369-2021《免疫層

析試紙條檢測通則》、GB/T40265-2021《酶免疫檢測抗體檢測通則》、

GBT20001.4-2015《標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則編寫-試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)》、GB/T27417-2017《合格評定化

學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》、農(nóng)業(yè)部的獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑（盒）備案參考評

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判標(biāo)準(zhǔn)等要求，并結(jié)合酶聯(lián)免疫分析試劑盒產(chǎn)品的特性進(jìn)行編寫的。在標(biāo)準(zhǔn)制訂過

程中力求技術(shù)內(nèi)容的敘述正確無誤；文字表達(dá)準(zhǔn)確、簡明、易懂；標(biāo)準(zhǔn)的構(gòu)成嚴(yán)謹(jǐn)

合理；內(nèi)容編排、層次劃分等邏輯與符合規(guī)定。

五標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容的確定

1.適用范圍

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表

面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，

又保留酶的活性。在測定時(shí)，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面

的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中

的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。

此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底

物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢林璐物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根

據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反

應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。

ELISA測定可具有多種形式，大致分為四種主要的不同類型：直接法、間接法、

競爭法、夾心法，如圖1所示。①直接ELISA。將抗原固定于多孔板表面，用特定于

該抗原并且直接偶聯(lián)到HRP或其他檢測分子的抗體檢測。②間接ELISA。與直接

ELISA測定相似，將抗原固定于多孔板表面。但是，檢測需要兩步過程，通過該過程

先將特定于該抗原的一抗結(jié)合到靶標(biāo)，然后將針對一抗的宿主物種的標(biāo)記二抗與一

抗結(jié)合進(jìn)行檢測。該方法還可用于通過血清代替一抗來檢測血清樣品中的特定抗體。

③夾心ELISA。夾心ELISA式最常用的形式。這種形式需要特定于該抗原的不同表位

的兩種抗體。這兩種抗體通常被稱為匹配抗體對。其中一種抗體包被于多孔板表面

上并用作捕獲抗體以促進(jìn)抗原的固定。另一種抗體被偶聯(lián)并促進(jìn)抗原的檢測。④競

爭ELISA。該方法通過檢測信號干擾測量抗原濃度。前三種形式都適用于競爭形式。

樣品抗原與參考抗原競爭結(jié)合到特定量的標(biāo)記抗體。參考抗原預(yù)包被于多孔板上。

將樣品用標(biāo)記抗體預(yù)孵育并加入孔中。根據(jù)樣品中抗原的量，將有更多或更少的游

離抗體可用于結(jié)合參考抗原。樣品中的抗原越多，檢測到的參考抗原就越少，信號

就越弱。也有一些競爭ELISA試劑盒使用標(biāo)記抗原代替標(biāo)記抗體。標(biāo)記抗原和樣品抗

原（未標(biāo)記）競爭結(jié)合到一抗。樣品中抗原的量越少，則因孔中的更多標(biāo)記抗原產(chǎn)

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生的信號就越強(qiáng)。

圖1.四種不同類型的ELISA

在商品化試劑盒中用的比較多的是雙抗體夾心法和間接競爭法，其中雙抗體夾

心法多用于大分子化合物檢測，如致敏蛋白、細(xì)胞因子、病毒等；間接競爭法多用

于小分子化合物檢測，如農(nóng)獸藥、抗生素等。

收集整理不同類型ELISA試劑盒說明書及標(biāo)準(zhǔn)，了解不同ELISA試劑盒的組成要

求、外觀、貯存條件等一般要求、以及樣品處理、檢測步驟、檢測指標(biāo)、結(jié)果計(jì)算

等檢測過程等；同時(shí)，解讀不同類型ELISA檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)，從方法學(xué)的角度分析不

同類型ELISA的技術(shù)要求。通過分析總結(jié)，綜合性地提出ELISA試劑盒檢測的相關(guān)要

求。

本文件規(guī)定了ELISA試劑盒的一般要求、檢測過程和檢測報(bào)告，適用于ELISA試

劑盒的檢測。

2、檢測指標(biāo)的選擇

商業(yè)化的ELISA試劑盒均附有產(chǎn)品說明書，小分子化合物以25羥基維生素D檢測

試劑盒（酶聯(lián)免疫法）說明書（附件1）為例，說明書文件內(nèi)容包括以下幾個(gè)部分：

（1）產(chǎn)品名稱；（2）包裝規(guī)格；（3）概要說明；（4）檢測原理；（5）試劑盒的

主要組成成分：酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品等；（6）儲(chǔ)存條件及有效期；（7）樣本要求；（8）

檢驗(yàn)方法：自備材料、試劑制備、操作步驟；（9）參考值；（10）檢測結(jié)果的解釋：

樣本分析數(shù)據(jù)、典型標(biāo)準(zhǔn)曲線；（11）產(chǎn)品性能指標(biāo)：精確度、靈敏度、精密度、

回收率、線性、特異性；（12）參考文獻(xiàn)；（13）生產(chǎn)企業(yè)及售后服務(wù)單位、批準(zhǔn)

號等。大分子化合物以人TNF-αELISA試劑盒為例（附件2），該說明書內(nèi)容包括：

（1）產(chǎn)品名稱；（2）儲(chǔ)存和穩(wěn)定性；（3）試劑盒提供的材料；（4）試劑盒未提

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供但需用到的材料：酶標(biāo)儀、去離子水等；（5）試劑制備：洗液、抗體稀釋、標(biāo)準(zhǔn)

品等；（6）樣品制備；（7）酶標(biāo)板準(zhǔn)備；（8）測定步驟；（9）方法特異性；（10）

交叉反應(yīng)；（11）物種特異性；（12）標(biāo)準(zhǔn)曲線、計(jì)算以及典型標(biāo)曲數(shù)據(jù)；（13）

典型樣本值：靈敏度、回收率、線性稀釋、精密度（包括批內(nèi)和批間）。

由上可知，ELISA試劑盒應(yīng)附產(chǎn)品說明書，或等同的指導(dǎo)性文件。文件內(nèi)容應(yīng)至

少包括以下部分：（1）品種名稱（中英文）；（2）測定原理；（3）適用范圍，

提及檢測的目標(biāo)物和適用的基質(zhì)范圍；（4）適用單位需自備的設(shè)備和試劑：酶標(biāo)儀、

去離子水等；（5）提供的材料和試劑：酶標(biāo)板、樣本稀釋液、洗滌緩沖液、底物、

終止液、質(zhì)控樣品等；（6）溶液配制方法；（7）樣品前處理方法；（8）詳細(xì)的檢

測步驟或操作指南；（9）結(jié)果判定；（10）分析質(zhì)量參數(shù)：靈敏度、檢測范圍、回

收率、精密度、特異性；（11）保存條件和有效期。

根據(jù)上述ELISA試劑盒說明書，ELISA試劑盒的檢測指標(biāo)主要包括標(biāo)準(zhǔn)曲線線

性、靈敏度、精密度、回收率、特異性；另外為保證食品快速檢測方法評價(jià)工作科

學(xué)合理、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，我國于2017年發(fā)布了《食品快速檢測方法評價(jià)技術(shù)規(guī)范》，除

靈敏度、特異性外，參比方法的一致性分析也作為其中一項(xiàng)評價(jià)指標(biāo)?；厥章室约?/p>

與參比方法的一致性均屬于定量方法的正確度指標(biāo)。因此，本文件中的ELISA試劑盒

的檢測指標(biāo)為：曲線線性、靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度、特異性，其中與參考方法的

一致性包含在正確度指標(biāo)中。

3、檢測過程

3.1檢測樣本的選擇和制備

檢測樣本需使用盲樣進(jìn)行，檢測用盲樣涉及空白、陰性、陽性樣品，其中空白

或陰性樣本為與待測物具有同源性和同質(zhì)性但不含有或方法學(xué)靈敏度未能檢出待分

析物的樣品，陽性樣本為在陰性樣品中添加待分析物的方式制備或自身含有待分析

物的實(shí)際樣品。這些樣本均需選擇適宜的儀器檢測方法測定樣品中的目標(biāo)分析物含

量，可使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、參考物質(zhì)或質(zhì)量控制品進(jìn)行溯源參考，測定完成后的各

類樣品應(yīng)進(jìn)行隨機(jī)編號處理，形成盲樣，可自行制備。應(yīng)符合以下要求：

（1）陰性樣品與待分析樣品應(yīng)來源于同一物種，并具有相似的結(jié)構(gòu)特性，包

括不含有或方法學(xué)未能檢出目標(biāo)分析物的樣品，以及含有或添加其他與目標(biāo)分析物

結(jié)果類似物質(zhì)（易產(chǎn)生交叉反應(yīng)）的樣品，按酶聯(lián)免疫試劑盒說明書的步驟進(jìn)行前

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處理。

（2）陽性樣品為通過在陰性樣品中添加目標(biāo)分析物所制備的樣品，按酶聯(lián)免疫

試劑盒說明書的步驟進(jìn)行前處理。

（3）陰性樣品和陽性樣品應(yīng)具有基質(zhì)符合性，以及與實(shí)際樣品所含除目標(biāo)分析

物外其他成分的相似性，重點(diǎn)考慮典型樣品基質(zhì)或相似基質(zhì)，綜合考慮蛋白、脂肪、

水分、糖分、高聚物或多聚體物質(zhì)、色澤、酸堿性等影響檢測的組分進(jìn)行區(qū)分選擇。

（4）對于多種目標(biāo)分析物的檢測，盡可能對全部目標(biāo)分析物進(jìn)行檢測，若因客

觀條件限制不能檢測全部目標(biāo)分析物，宜對所有目標(biāo)分析物進(jìn)行分類（如結(jié)構(gòu)類似

程度、危害程度等），每一類至少選擇一種目標(biāo)分析物進(jìn)行檢測。

3.2試劑準(zhǔn)備

ELISA試驗(yàn)的原材料主要有抗原、抗體以及酶標(biāo)抗體等生物活性物質(zhì)，故市場

上的大部分ELISA試劑盒的儲(chǔ)存條件為2-8℃。溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因

素。為了使所有樣本在一致的溫度下反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)前務(wù)必將所有試劑包括檢測樣本，

從冷藏環(huán)境中取出，放置15-30分鐘平衡至室溫，以避免因溫度的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)差異而

導(dǎo)致ELISA檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。

部分標(biāo)準(zhǔn)品如腫瘤壞死因子超家族15等蛋白類需要保存在-20℃，恢復(fù)室溫后，

還需要采用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，進(jìn)行梯度稀釋，配制成系列測定使用的濃度，未用完的標(biāo)

準(zhǔn)品應(yīng)按照一次用量分裝后，將其放在-20℃貯存，一次性使用，避免反復(fù)凍融。

抗體工作液需要按照一次計(jì)算所需使用的量，采用抗體稀釋液進(jìn)行稀釋，現(xiàn)用

現(xiàn)配；酶結(jié)合物工作液用酶結(jié)合物稀釋液進(jìn)行稀釋配制；洗滌液通常需要用蒸餾水

進(jìn)行稀釋。

3.3操作準(zhǔn)備

按照3.2中準(zhǔn)備工作配制好各種溶液，根據(jù)待測樣本數(shù)量、系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的數(shù)量

決定所需的酶標(biāo)板板條數(shù)，并增加空白對照孔；分別將樣本和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加

入相應(yīng)孔中（零孔中只加樣本稀釋液），然后按照ELISA試劑盒說明書，依次進(jìn)行孵

育、洗板、顯色、終止、測試等步驟進(jìn)行操作。為確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度，每個(gè)樣

本及標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測定2次或3次，并記錄實(shí)際加樣情況。

此外，一般ELISA試劑盒中有以下操作要點(diǎn)提示：（1）配制各種試劑時(shí)要充分

混勻，以避免加樣時(shí)加入大量氣泡，產(chǎn)生加樣誤差；（2）為避免交叉污染，在加入

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不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、不同樣品、不同試劑時(shí)及時(shí)更換吸頭；（3）在每次孵育前需使

用新封板膠紙封住反應(yīng)孔；（4）顯色劑在添加之前，應(yīng)確保無色，不能使用已經(jīng)變

色的顯色溶液；（5）每次檢測均需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品待測因子的含量，適當(dāng)

稀釋或濃縮樣本，做好預(yù)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行規(guī)范操作，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.4結(jié)果計(jì)算

3.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

ELISA試劑盒定量分析的結(jié)果計(jì)算是建立在標(biāo)準(zhǔn)曲線基礎(chǔ)上。已知系列標(biāo)準(zhǔn)品

的濃度以及對應(yīng)濃度下酶標(biāo)儀測定的吸光度值，通過曲線擬合得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲

線，外推標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分計(jì)算樣品中目標(biāo)物的濃度。

在ELISA檢測中允許使用四種模型繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（1）線性圖的一個(gè)坐標(biāo)軸表

示抗原的濃度，另一個(gè)表示讀數(shù)。R2值在此通常用于確定擬合，數(shù)值大于0.99表

示擬合非常好。然而，線性圖往往會(huì)壓縮曲線下端上的數(shù)據(jù)點(diǎn)，導(dǎo)致計(jì)算結(jié)果不準(zhǔn)；

（2）半對數(shù)圖即將濃度值取對數(shù)值，然后再和對應(yīng)的OD值進(jìn)行直線回歸，理想的

狀態(tài)下，在半對數(shù)坐標(biāo)中是一條直線，常用于濃度隨著OD值的增加或者減低呈對數(shù)

增加或者減少的情況，即濃度的變化比OD值的變化更為劇烈。在ELISA實(shí)驗(yàn)中較常

用（有很多用EXCEL畫圖時(shí)，也常使用半對數(shù)），擬合函數(shù)方程式為：y=alg(x)+b，

半對數(shù)圖可以幫助抵消線性圖引起的下端壓縮。半對數(shù)圖使用濃度的對數(shù)與讀數(shù)的

關(guān)系。這種方法通常會(huì)得到數(shù)據(jù)點(diǎn)分布更均勻的s形曲線。（3）對數(shù)/對數(shù)圖即log-log

擬合回歸方程，與半對數(shù)相似，只是將OD值和對應(yīng)的濃度值均取對數(shù)，然后再進(jìn)行

直線回歸，擬合函數(shù)方程式為：lg(y)=alg(x)+b；該擬合可以為低到中濃度范圍提

供良好的線性，但范圍的高端則容易失去線性。（4）log—logit直線圖擬合，可用于

競爭法。Logit變換源于數(shù)學(xué)中的Logistic曲線，在ELISA中，當(dāng)競爭性反應(yīng)物為0

時(shí)結(jié)合率為100%，如果某一濃度下結(jié)合率為B，B=OD/OD0，在對B進(jìn)行Logit變

換：y=ln[B/(1-B)]，之后y與濃度的對數(shù)成線性關(guān)系，即：y=a+blg(x)，擬合函數(shù)

方程式為：lg(y)=alg(x)+b就得到了Logit-log直線回歸模型，這個(gè)模型一般適用

于競爭法的擬合，所以擬合時(shí)要求只有少有一個(gè)零濃度測試的OD值，并且此值為整

個(gè)反應(yīng)的最大值(也就是我們常說的至少要做一個(gè)空白對照)。（5）四參數(shù)擬合回歸

不僅限于競爭法,實(shí)際上夾心法也可以用它。根據(jù)情況,可能是一個(gè)單調(diào)上升的類似

指數(shù),對數(shù),或雙曲線的曲線,也可能是一個(gè)單調(diào)下降的上述曲線,還可以是一條S

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形曲線。它要求X值不能小于0（因?yàn)橹笖?shù)是實(shí)數(shù),故有此要求）。在很多情況

下它都可以擬合ELISA的反應(yīng)曲線,也是目前國際上最流行的免疫檢測擬合方式。

較其他擬合方式，四參數(shù)擬合對曲線的全部都有較好的適用性，因此在本標(biāo)準(zhǔn)中推

薦使用。

根據(jù)GBT32465-2015《化學(xué)分析方法驗(yàn)證確認(rèn)和內(nèi)部質(zhì)量控制要求》和GB/T

27147-2017《合格評定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》，校正標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度應(yīng)均勻

布置6個(gè)及以上，每個(gè)濃度測定次數(shù)不少于2次，最好是3次或更多，對于準(zhǔn)確定量的

方法，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)不低于0.99。采用ELISA試劑盒說明書進(jìn)行測定，得

到對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度的吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，采

用軟件進(jìn)行四參數(shù)擬合，四參數(shù)方程的擬合函數(shù)表達(dá)式為：

………………….（1）

在這個(gè)方程中，“a”和“d”分別表示吸光度的最大值和最小值，代表S型曲線

的上漸近線?！癱”為吸光度增長速度開始發(fā)生變化的濃度值，即半效反應(yīng)濃度，表

示拐點(diǎn)即曲線的中點(diǎn)，“b”為吸光度增加速率參數(shù)，相當(dāng)于曲線在“c”處的斜率。

根據(jù)這個(gè)方程，我們現(xiàn)在可以反算出一個(gè)樣本的未知濃度。

隨著計(jì)算機(jī)軟件的不斷發(fā)展，采取合適的匹配的軟件來對數(shù)據(jù)進(jìn)行四參數(shù)擬合變

得更為重要。如大多數(shù)的中高端酶標(biāo)儀都會(huì)配備帶有數(shù)據(jù)收集和處理軟件，如

SoftmaxPro，只需編制好相應(yīng)的模板，即可自動(dòng)獲得擬合圖和計(jì)算結(jié)果，更新版的

軟件還可以完成平行性檢驗(yàn)等更高階的功能。但這些相應(yīng)軟件的授權(quán)需要購買，且

價(jià)格較高。因此，在日常數(shù)據(jù)的處理中，也會(huì)使用一些統(tǒng)計(jì)軟件如Origin、GraphPad

Prism來進(jìn)行四參數(shù)擬合，但這些軟件不具備常用的96孔板布局功能，需要前期在

Excel中計(jì)算吸光度平均值、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品和樣品濃度等，因此在使用上是存在一定的

限制。

而在定量分析中，可以推薦使用國產(chǎn)分享軟件mELISA進(jìn)行處理，其具有96孔板

的排布方式，對于含量計(jì)算、平行樣變異系數(shù)計(jì)算、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和質(zhì)控樣品回收

率計(jì)算都有著極好的效果。另外一些國產(chǎn)的免費(fèi)軟件也可以實(shí)現(xiàn)四參數(shù)擬合和計(jì)算

功能，如ELISACalc，但其也需要前期在Excel中進(jìn)行平均值計(jì)算、標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度設(shè)

置等工作。但這些軟件在應(yīng)用于通過多條曲線比較（如EC50比較來計(jì)算相對活性等）

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的工作中操作較為繁瑣。

3.4.2數(shù)據(jù)計(jì)算

由未知樣的吸光值和標(biāo)準(zhǔn)曲線可換算得出相應(yīng)的濃度。如果樣本的吸光度值超

出標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)前適當(dāng)稀釋樣本以獲得精確結(jié)果。在分析數(shù)據(jù)時(shí)，樣

本實(shí)際濃度應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得的濃度乘以稀釋倍數(shù)。

3.4.3靈敏度

GB/T27147-2017《合格評定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》中定義3.16種指

出靈敏度是測量系統(tǒng)的示值變化除以相應(yīng)被測量的量值變化所得的商。靈敏度可表

示為檢出限（LOD）和定量限（LOQ），LOD是指由給定測量程序獲得的測得的量

值，其對物質(zhì)種不存在某種成分的誤判概率為β，對物質(zhì)中存在某種成分誤判概率為

α，國際理論化學(xué)和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)推薦α和β的默認(rèn)值為0.05，檢出限往往分為方

法檢出限和儀器檢出限。LOQ是指分析方法可定量測定樣品中待測組分的最低濃度

或最低量，應(yīng)滿足一定的精密度和準(zhǔn)確度的要求。與LOD相類似，LOQ也可以分為

兩個(gè)部分，儀器定量限和方法定量限，該指標(biāo)體現(xiàn)了分析方法是否具備靈敏的定量

檢測能力，以保證含量很少的成分能夠被準(zhǔn)確測出。LOQ的確定主要從其可信性考

慮，通常建議將空白值加上10倍的重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)偏差作為LOQ，也可以3倍的LOD或高于

方法確認(rèn)中使用最低加標(biāo)量的50%作為LOQ，如為增加數(shù)據(jù)的可信性，也可用10倍

的LOD來表示。特定的基質(zhì)和方法，其LOQ可能在不同實(shí)驗(yàn)室之間或在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)

室內(nèi)由于使用不同設(shè)備、技術(shù)和試劑而有差異。

檢測限的計(jì)算和表達(dá)方法較多，包括空白標(biāo)準(zhǔn)偏差法、信噪比法、逐步稀釋法、

儀器靈敏度法、方法分辨率法、檢測能力計(jì)算法等，同一個(gè)檢測指標(biāo)不同的檢出限

表達(dá)結(jié)果差異可能會(huì)達(dá)到幾個(gè)數(shù)量級。根據(jù)大多數(shù)市售ELISA試劑盒說明書，ELISA

定量分析方法通常采用空白標(biāo)準(zhǔn)偏差法評估檢出限，即通過分析大量的樣品空白或

加入最低可接受濃度的樣品空白來確定LOD，獨(dú)立測試的次數(shù)應(yīng)不少于10次，通過

標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出檢測結(jié)果的平均值（x0）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（s）。試劑盒的檢出限確證，

可用95.4%可信限計(jì)算。結(jié)合ELISA試劑盒說明書描述，對于競爭ELISA試劑盒，分

別以x0-2s和x0-10s表示LOD和LOQ；對于夾心ELISA試劑盒，分別以x0+2s和

x0+10s表示LOD和LOQ。由于每一品種中的關(guān)鍵試劑抗原、抗體或標(biāo)記物的不同，

在產(chǎn)品的開發(fā)測試中加以優(yōu)化，其具體檢測試劑盒的靈敏度會(huì)有不同。本標(biāo)準(zhǔn)通過

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計(jì)算10份空白基質(zhì)測定均值加減2倍（或3倍）標(biāo)準(zhǔn)差表述，以此數(shù)值通過標(biāo)準(zhǔn)曲線

計(jì)算出相對應(yīng)的濃度，確認(rèn)大于或等于標(biāo)準(zhǔn)曲線中最低濃度，即為LOD（LOQ）。

3.4.4精密度

根據(jù)GB/T6379.1-2004/ISO5725-1:1994《測量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精

密度）第1部分：總則與定義》，精密度通常是指在規(guī)定條件下互相獨(dú)立的測試結(jié)果

之間的一致程度，表示測量的重復(fù)性和再現(xiàn)性，是保證準(zhǔn)確度的先決條件，但是高

的精密度不一定能保證高的準(zhǔn)確度。檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)中，用標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)表示測定

的精密度。變異系數(shù)（CV）被定義為標(biāo)準(zhǔn)差與其均值的比值，以百分?jǐn)?shù)表示，變異

系數(shù)越大的樣本，其測定值的精密度越低。依據(jù)測定值與分析的關(guān)系，精密度可分

為批內(nèi)精密度和批間精密度，分別以批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)表示。批內(nèi)變異

系數(shù)指同一次分析中同一樣品平行測定值的重復(fù)性，批間變異系數(shù)指同一樣品在不

同批次分析中測定值的再現(xiàn)性。因此精密度是考察試劑盒對同一樣本重復(fù)測定時(shí)能

否得到相同實(shí)驗(yàn)結(jié)果的指標(biāo)，是評價(jià)試劑盒質(zhì)量控制的重要內(nèi)容。批內(nèi)精密度是指

在同一實(shí)驗(yàn)室，由同一操作員使用相同的設(shè)備（在同一塊微孔板上），按相同的測

試方法，在短時(shí)間內(nèi)對同一被測對象相互獨(dú)立測定結(jié)果間的一致程度。批間精密度

是指在不同實(shí)驗(yàn)室，由不同的操作員使用不同的設(shè)備，按相同的測試方法，對同一

被測對象進(jìn)行獨(dú)立測定結(jié)果間的一致程度；批間精密度包含內(nèi)容有：同一試劑盒，

不同批次之間；同一試劑盒，同一批次，不同實(shí)驗(yàn)室之間；同一試劑盒，同一批次，

同一實(shí)驗(yàn)室，不同操作者之間；同一試劑盒，同一批次，同一操作者，有效期內(nèi)不

同時(shí)間之間等的重復(fù)檢測結(jié)果。

根據(jù)GB/T27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》，對于食品中的禁

用物質(zhì)，精密度實(shí)驗(yàn)應(yīng)在方法測定低限、兩倍方法測定低限和十倍方法測定低限進(jìn)

行三水平試驗(yàn)；對于已制定MRL的，精密度實(shí)驗(yàn)應(yīng)在法測定低限、MRL、選一合適

點(diǎn)進(jìn)行三水平試驗(yàn)；對于未制定MRL的，精密度實(shí)驗(yàn)應(yīng)在方法測定低限、常見限量

指標(biāo)、選一合適點(diǎn)進(jìn)行三水平試驗(yàn)。重復(fù)測定次數(shù)至少為6。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的變異系數(shù)

參考范圍見表1。

表1.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)

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被測組分含量實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)（CV）/%

0.1μg/kg43

1μg/kg30

10μg/kg21

100μg/kg15

1mg/kg11

10mg/kg7.5

100mg/kg5.3

1000mg/kg3.8

1%2.7

10%2.0

100%1.3

GB/T26124-2011《臨床化學(xué)體外診斷試劑盒》規(guī)定臨床化學(xué)體外診斷試劑盒規(guī)

定批間差和批內(nèi)差應(yīng)符合生產(chǎn)企業(yè)規(guī)定的要求。北京市食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的

《化學(xué)發(fā)光免疫類體外診斷試劑（盒）產(chǎn)品技術(shù)審評規(guī)范》（2017版）中，（1）重

復(fù)性：用控制物質(zhì)或人源樣本（高、低濃度）測試試劑（盒），重復(fù)測試至少10次

（n≥10），分別計(jì)算測量值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算變異系數(shù)，變異系數(shù)應(yīng)不大于

10%。（2）批間差：用三個(gè)不同批號試劑（盒），對不同濃度的樣本分別重復(fù)測定

10次，計(jì)算每份樣本10次測定結(jié)果的變異系數(shù)，變異系數(shù)應(yīng)不大于15%。

綜上，本標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定對ELISA試劑盒的精密度的要求如下：使用同一批次的試劑

盒，選取低、中、高3個(gè)濃度水平陽性樣本重復(fù)測定10次，按照下列公式計(jì)算得到批

內(nèi)變異系數(shù)。使用不同批次的同一試劑盒，選取低、中、高3個(gè)濃度水平陽性樣本重

復(fù)測定10次，按照下列公式計(jì)算得到批間變異系數(shù)。

CV=S/×100%……..…………(2)

式中：

CV—變異系數(shù)；

s—標(biāo)準(zhǔn)偏差；

—10次重復(fù)測定的平均值。

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3.4.5正確度

測量結(jié)果的正確度用于表述無窮多次重復(fù)性測定結(jié)果的平均值與參考值之間的

接近程度，正確度差意味著存在系統(tǒng)誤差，通常用偏差表示。而測量結(jié)果的偏差則

通過回收試驗(yàn)進(jìn)行評估。

評估正確度的樣品應(yīng)盡可能包括天然存在樣品、含有殘留物質(zhì)或受污染的樣品進(jìn)

行回收率測定。最理想的偏差評估是利用樣品的基質(zhì)匹配且濃度相近的有證標(biāo)準(zhǔn)物

質(zhì)（CRMs）進(jìn)行測試，如果合適的CRMs無法獲得，也可采用分析參考物質(zhì)（RM）

來進(jìn)行評估；特別是對于目標(biāo)分析物以結(jié)合態(tài)形式存在待測物中（如克倫特羅與動(dòng)

物基體結(jié)合）。對于穩(wěn)定性高且以原藥自身形式存在的目標(biāo)分析物，也可通過在已

確認(rèn)的空白樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)品。若無法獲得空白樣品，也可向含有痕量分析物的樣

品中加入標(biāo)樣，亦可通過加標(biāo)樣品前后之差進(jìn)行計(jì)算。

根據(jù)GB/T27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》，控制樣品中被

測組分的含量應(yīng)盡量與被測樣品相近，若被測樣品為未檢出，則控制樣品中被測組

分的含量應(yīng)在方法測定低限附近。測定結(jié)果的回收率應(yīng)符合以下要求：（1）對于食

品中的禁用物質(zhì)，回收率應(yīng)在方法測定低限、兩倍方法測定低限和十倍方法測定低

限進(jìn)行三水平試驗(yàn)；（2）對于已制定最高殘留限量（MRL）的，回收率應(yīng)在法測定

低限、MRL、選一合適點(diǎn)進(jìn)行三水平試驗(yàn)；（3）對于未制定MRL的，回收率應(yīng)在方

法測定低限、常見限量指標(biāo)、選一合適點(diǎn)進(jìn)行三水平試驗(yàn)?；厥章实膮⒖挤秶姳?。

另外，在《食品快速檢測方法評價(jià)技術(shù)規(guī)范》中指出實(shí)驗(yàn)中測試樣品的“測試水平

一般應(yīng)包括標(biāo)準(zhǔn)方法檢出水平（或者標(biāo)準(zhǔn)限量值）的0.5、1、2倍水平或者其他可檢

測區(qū)分的水平（不少于3個(gè)）；或者方法標(biāo)稱檢出限0.5、1、2倍水平或者其他可檢測

區(qū)分的水平（不少于3個(gè)）”。由此可知，回收率的測試水平應(yīng)至少包含低、中、高

三個(gè)濃度水平。

表2.回收率范圍

濃度水平范圍回收率范圍

mg/kg%

>10095-105

1-10090-110

0.1-180-110

<0.160-120

綜上，本標(biāo)準(zhǔn)文本中分為與參比方法一致性、采用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、以及回收率三

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部分進(jìn)行評估。分別如下表述。

（1）與參比方法的一致性

采用試劑盒與已知的國際或國家認(rèn)可的參考方法對同一份樣本進(jìn)行至少6次的

測試，按GB/T4889中的F檢驗(yàn)和T-檢驗(yàn)進(jìn)行評價(jià)。

首先按照公式（3）進(jìn)行F檢驗(yàn)，考察酶聯(lián)免疫試劑盒與已知的國際或國家認(rèn)可

的參考方法所取得的兩組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差是否一致；若不一致，說明兩組方法檢測

結(jié)果不一致；若一致，再按照公式（4）采用配對T檢驗(yàn)，考察兩組數(shù)據(jù)的平均值是

否存在顯著性差異，若不存在顯著性差異，說明兩種方法測定結(jié)構(gòu)具有較好的一致

性。

……..………………..(3)

式中：

S大—兩組數(shù)據(jù)中標(biāo)準(zhǔn)偏差大的數(shù)值；

S小—兩組數(shù)據(jù)中標(biāo)準(zhǔn)偏差小的數(shù)值；

……..………………..(4)

式中：

x1—第1組測定結(jié)果的平均值；

x2—第2組測定結(jié)果的平均值；

s—兩組等精度測定結(jié)果的合并實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差；

n1—第1組測定的平行測定次數(shù)；

n2—第2組測定的平行測定次數(shù)。

其中，兩組等精度測定結(jié)果的合并實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差s按公式（5）算：

…….…(5)

式中：

s1—第1組測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

s2—第2組測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

（2）采用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

對有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行6次重復(fù)檢測，計(jì)算6次重復(fù)檢測的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和

變異系數(shù)，按照公式（6）計(jì)算正確度。

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正確度（%）=檢測值/認(rèn)定值×100…………………(6)

（3）回收率

選用試劑盒適用的每種基體，添加低、中、高3個(gè)濃度水平的目標(biāo)分析物，每個(gè)

水平至少測定6次，計(jì)算檢測結(jié)果的平均值與理論值的偏差。3個(gè)濃度水平偏差的參

考范圍見表2。

3.4.6特異性

特異性是指在樣品中存在相關(guān)干擾物質(zhì)的情況下，分析方法能夠準(zhǔn)確、專一地測

定分析物的能力。ELISA試劑盒的檢測是基于抗原抗體的反應(yīng)進(jìn)行的。由于被測樣本

中存在的某些與待測抗原/抗體有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)或抗原表位的分子，如易共存的其他

抗原抗體、某些激素、易使用的藥物等，可能與試劑中的單克隆抗體發(fā)生交叉反應(yīng)

而影響檢測結(jié)果，因此，特異性也是ELISA試劑盒必不可少的檢測指標(biāo)。

特異性一般用交叉反應(yīng)率表示。對于夾心ELISA的檢測，交叉反應(yīng)率一般是指一

定濃度的結(jié)構(gòu)類似物在該試劑盒上的測定結(jié)果（物質(zhì)的量）與該類似物的量的比值

的百分率，比如1000pmol/L的結(jié)構(gòu)類似物，在某試劑盒上的測定結(jié)果是5pmol/L，

其交叉反應(yīng)率為5除以1000再乘以100%，即0.5%。其特異性包括種屬特異性和方法

特異性，種屬特異性指ELISA試劑盒中的抗體只對某一物種的組織、細(xì)胞、血清、體

液、或分泌物發(fā)生特異反應(yīng)的特性，而對其他種屬動(dòng)物的蛋白均不發(fā)生反應(yīng)，如人

源p21ELISA試劑盒與鼠源p21的交叉反應(yīng)率應(yīng)小于3%，

對于競爭法ELISA的檢測，通常采用競爭抑制試驗(yàn)測定，按照3.4.1，用不同濃度

的結(jié)構(gòu)類似物和標(biāo)準(zhǔn)品分別做競爭抑制曲線，計(jì)算得到相應(yīng)的IC50（半數(shù)抑制濃度），

按照公式（3）計(jì)算交叉反應(yīng)率。

CR=…………(3)

式中：

CR—交叉反應(yīng)率，%；

EC50—半數(shù)抑制濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到。

六應(yīng)用試驗(yàn)

選取不同類型的ELISA試劑盒，按方法可為間接法和夾心法，按檢測化合物種類

可分小分子物質(zhì)和大分子物質(zhì)。分別選取卡那霉素ELISA試劑盒和牛乳鐵蛋白ELISA

試劑盒，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作（附件3和附件4），對標(biāo)準(zhǔn)曲線線性、靈

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敏度、精密度、正確度、特異性等檢測指標(biāo)進(jìn)行考察，以證明該標(biāo)準(zhǔn)草案適用于酶

聯(lián)檢測試劑盒的檢測。

1、小分子化合物應(yīng)用示例卡那霉素ELISA試劑盒

所有試驗(yàn)按產(chǎn)品說明書進(jìn)行檢驗(yàn)操作，所有試驗(yàn)方案按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定執(zhí)行。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線線性

按照卡那霉素說明書，將6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度，各平行測定3次，得到表3。

表3.卡那霉素試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線

ng/mL123平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差

01.3731.2581.2831.3050.061

0.51.0891.0120.8830.9950.104

1.50.7930.6870.7990.7600.063

4.50.5540.5570.5900.5670.020

13.50.4210.4060.3680.3980.027

40.50.2770.2660.2510.2640.013

使用origin軟件進(jìn)行l(wèi)ogistic四參數(shù)曲線擬合，得到如下標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。

圖2.卡那霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

（2）檢出限和定量限

市場上購買奶粉樣本，并經(jīng)LC-MS/MS鑒定為氨基糖苷類（卡那霉素、新霉素、

潮霉素B和慶大霉素）陰性樣本，詳細(xì)測定結(jié)果見附件5。

將空白奶粉樣本按照ELISA說明書的操作程序，平行測定10次，分別計(jì)算平均值

和標(biāo)準(zhǔn)偏差，平均值加3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差即為檢出限，平均值加10倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差即為定

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量限。具體數(shù)據(jù)如表4所示。

表4.卡那霉素試劑盒的檢出限和定量限

乘以30倍

由標(biāo)曲得到得到奶粉中

的計(jì)算濃度KAN的濃平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差檢出限定量限

測定次數(shù)吸光值（ng/mL）度（μg/kg）（μg/kg）（μg/kg）(μg/kg)(μg/kg)

10.9570.51615.466

20.9530.55016.489

30.9590.51715.507

40.9520.54816.431

50.9570.52115.644

16.0220.44117.3520.43

60.9560.52315.704

70.9510.53416.025

80.9600.52915.885

90.9500.55116.543

100.9530.55116.529

（3）精密度

選取卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品的添加濃度分別為25、50、150μg/kg。

A.批內(nèi)精密度

在同一測定中，平行測定10次，分別計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差以及變異系數(shù)。如

表5所示。

表5.卡那霉素試劑盒的批內(nèi)精密度

添加濃度12345平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差

（μg/kg）（μg/kg）（μg/kg）變異系數(shù)(%)

20.9727.2625.7820.5925.02

24.703.06412.40

2524.7528.1529.5522.8922.03

43.4756.3051.4250.2447.59

49.855.29310.62

5047.7042.3858.6446.9253.85

141.21149.83149.94169.09145.29

152.259.5196.25

150145.68153.67143.84166.72157.28

B.批間精密度

在三次測試中，每次測試3個(gè)平行，分別計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差以及變異系數(shù)。

如表6所示。

表6.卡那霉素試劑盒的批間精密度

添加濃度平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差

123

(μg/kg)(μg/kgL)(μg/kg)變異系數(shù)(%)

2527.5030.4024.0924.893.3613.48

19

21.9725.6226.44

26.7820.6320.53

43.4756.3051.42

54.3553.8847.8550.535.8311.54

5044.8843.5059.13

141.21149.83149.94

156.64149.81155.19155.7011.517.39

150174.48174.57149.59

（4）正確度

通過添加回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行準(zhǔn)確度測試，卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品的添加濃度分別為10、50、

150μg/kg，平行測定10次，分別計(jì)算平均值和回收率。具體數(shù)據(jù)見表7。

表7.卡那霉素試劑盒的正確度測試

添加濃度12345平均值

（μg/kg）（μg/kg）回收率(%)

20.9727.2625.7820.5925.02

24.7098.80

2524.7528.1529.5522.8922.03

43.4756.3051.4250.2447.59

49.8599.70

5047.7042.3858.6446.9253.85

141.21149.83149.94169.09145.29

152.25101.50

150145.68153.67143.84166.72157.28

（5）特異性

選取氨基糖苷類抗生素包括鏈霉素、潮霉素B、新霉素和慶大霉素，按照公式

（3）計(jì)算交叉反應(yīng)率，結(jié)果表8所示。

表8.卡那霉素試劑盒的特異性

化合物IC50（ng/mL）CR，%

卡那霉素2.23100

潮霉素B>1000<0.5

新霉素>1000<0.5

慶大霉素>1000<0.5

2、大分子化合物應(yīng)用示例牛乳鐵蛋白ELISA試劑盒

所有試驗(yàn)按產(chǎn)品說明書進(jìn)行檢驗(yàn)操作，所有試驗(yàn)方案按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定執(zhí)行。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線線性

按照ELISA試劑盒的說明書，配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度平行測定3次，

具體如表9所示。

表9.乳鐵蛋白試劑盒的標(biāo)曲線性

20

標(biāo)準(zhǔn)品濃度

123平均值（ng/mL）標(biāo)準(zhǔn)偏差

（ng/mL）

00.1390.1360.1310.1350.004

6.250.2860.3640.3910.3470.055

12.50.4960.4880.4670.4840.015

250.9080.9430.8590.9030.042

501.5621.5791.5371.5590.021

1002.1612.2522.2852.2330.064

2002.6382.6762.6082.6410.034

使用origin軟件進(jìn)行l(wèi)ogistic四參數(shù)曲線擬合，得到如下標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。

圖3.乳鐵蛋白試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線

（2）檢出限和定量限

乳鐵蛋白是母乳的核心免疫蛋白，人乳中乳鐵蛋白濃度約為1.0~3.0mg/L，是牛

乳中的10倍（牛乳中含量為0.02~0.35mg/mL）。為提高嬰幼兒的免疫力，市場上的

配方奶粉大多有乳鐵蛋白的添加，經(jīng)調(diào)查可知絕大部分品牌奶粉的乳鐵蛋白含量在

30~50mg/100g，美贊臣的藍(lán)臻系列中乳鐵蛋白含量明顯要高出其他的8-10倍。另外，

皇家美素佳兒的乳鐵蛋白含量與藍(lán)臻相當(dāng)。

由圖3標(biāo)曲可知，該試劑盒的檢測靈敏度（EC20）為22.05ng/mL。一般全脂奶粉

和水的比例大約是1:6兌成純牛奶，經(jīng)過換算可知，乳粉中乳鐵蛋白的檢測范圍約為

6.17~69.43mg/100g。故在實(shí)際乳粉需要稀釋至少2倍進(jìn)行檢測。

在中國乳品工業(yè)2019年第47卷第4期《不同類型熱處理方式對牛乳品質(zhì)的影響》

中顯示，巴氏殺菌中乳鐵蛋白含量最低為12mg/L、最高為38mg/L，即巴氏殺菌乳中

21

乳鐵蛋白含量約為1.2~3.8mg/100g，故巴氏殺菌乳可用作乳鐵蛋白的空白樣本，考察

乳粉樣本的檢出限和定量限，具體測定結(jié)果見表10。

表10.乳粉樣本中乳鐵蛋白的檢出限和定量限

根據(jù)標(biāo)曲計(jì)

測定次算濃度稀釋400倍平均值標(biāo)準(zhǔn)偏檢出限定量限

數(shù)吸光值（ng/mL）（ug/mL）（ug/mL）差（ug/mL）（ug/mL）

10.2886.5802.63

20.2846.4382.58

30.2846.4432.58

40.2826.3872.55

50.2936.7382.70

60.2886.5702.63

70.2916.6782.67

80.29