醫(yī)學(xué)課題開題

11

開題(kāití)報(bào)告共四十二頁(yè)中性粒細(xì)胞誘捕網(wǎng)在支氣管肺發(fā)育不良的作用及胞外組蛋白拮抗劑對(duì)其保護(hù)機(jī)制(jīzhì)探討共四十二頁(yè)

目錄(mùlù)研究背景研究?jī)?nèi)容研究方案(fāngàn)預(yù)期結(jié)果共四十二頁(yè)研究(yánjiū)背景共四十二頁(yè)支氣管肺發(fā)育不良（BPD）是早產(chǎn)兒尤其是極低出生體重兒最常見(jiàn)的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響(yǐngxiǎng)其生長(zhǎng)發(fā)育及生存質(zhì)量。共四十二頁(yè)支氣管肺發(fā)育不良（BPD）的最新定義[1]：任何氧依賴(>21％)超過(guò)28天的新生兒。病理特征：肺泡數(shù)量減少，體積(tǐjī)增大；肺血管形態(tài)改變，微血管發(fā)育不良；呼吸道平滑肌輕度增厚，肺纖維化少見(jiàn)共四十二頁(yè)2010年NICHD發(fā)布的報(bào)告顯示，2003～2007年美國(guó)20個(gè)中心出生體重(tǐzhòng)在401～1500g和胎齡在22～28周的早產(chǎn)兒68％患有BPD[2]，輕度27％，中度23％，重度18％。一項(xiàng)中國(guó)10個(gè)新生兒重癥監(jiān)護(hù)室的調(diào)查顯示，12351個(gè)<37周早產(chǎn)兒中1.26％發(fā)生BPD，胎齡≤28周的早產(chǎn)兒BPD的發(fā)生率為19．3％[3]。發(fā)病率高美國(guó)(měiɡuó)中國(guó)共四十二頁(yè)死亡率高，呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)(xúnhuánxìtǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)都有影響，生長(zhǎng)發(fā)育受限預(yù)后(yùhòu)差共四十二頁(yè)早產(chǎn)和宮內(nèi)發(fā)育遲緩遺傳易感性機(jī)械通氣(tōngqì)高濃度氧營(yíng)養(yǎng)動(dòng)脈導(dǎo)管開放（PDA）及室間隔缺損（VSD）感染發(fā)病機(jī)制和高危(ɡāowēi)因素共四十二頁(yè)BPD患兒氣管抽吸液中眾多炎性標(biāo)志物證實(shí)炎癥反應(yīng)是BPD發(fā)生啟動(dòng)(qǐdòng)的一個(gè)中心環(huán)節(jié)。Landry等[4]在對(duì)1192例早產(chǎn)兒的回顧性分析中發(fā)現(xiàn)，新生兒肺炎／膿毒癥與BPD密切相關(guān)(OR1.9，95％CI[1.1～3.2])OR1.9，95％CI[1.1～3.2]新生兒肺炎(fèiyán)/膿毒癥BPD感染因素共四十二頁(yè)在高氧致肺損傷模型中均存在(cúnzài)大量中性粒細(xì)胞（PMN）浸潤(rùn)及中性粒細(xì)胞誘捕網(wǎng)（NETs）過(guò)度形成，并通過(guò)釋放大量細(xì)胞因子、蛋白酶等破壞肺泡上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，最終引起肺損傷；通過(guò)減少PMN及NETs形成可改善肺損傷程度。高氧致肺損傷(sǔnshāng)模型

中性粒細(xì)胞

（PMN）中性粒細(xì)胞誘捕網(wǎng)（NETs）肺損傷共四十二頁(yè)NETs是由PMN釋放到胞外的包含有DNA、組蛋白、髓過(guò)氧化物酶、中性(zhōngxìng)粒細(xì)胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。Brinkmann等[5]發(fā)現(xiàn)，NETs能殺滅病原微生物。而Saffarzadeh等[8]證實(shí)組蛋白是NETs發(fā)揮作用的關(guān)鍵物質(zhì)。PMNNETSNDA組蛋白髓過(guò)氧化物(ɡuòyǎnɡhuàwù)酶中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶組織蛋白酶G捕獲并殺滅病原菌共四十二頁(yè)機(jī)體局部出現(xiàn)高濃度NETs，NETs相關(guān)效應(yīng)分子將會(huì)導(dǎo)致組織損傷、器官功能失調(diào)或衰竭。Saffarzadeh【8】等研究發(fā)現(xiàn)NETs可直接導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞死亡，其細(xì)胞毒性呈劑量依賴性；給予外源性組蛋白，可致肺損傷:肺水腫，肺泡間隔增寬，中性(zhōngxìng)粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肺出血。[11]而肝腎等器官損傷不明顯。[10]PMN/NETS過(guò)度(guòdù)動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫性疾病、血管炎、血栓以及腫瘤性、膿毒癥囊性肺纖維化、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、急性肺損傷（ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）、肺氣腫、輸血相關(guān)性急性肺損傷可直接導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞死亡共四十二頁(yè)抗組蛋白抗體可結(jié)合血液中循環(huán)組蛋白肝素、硫酸乙酰肝素可結(jié)合循環(huán)組蛋白[12]，肝素因?yàn)楦叨攘蛩峄缓?fù)電荷，組蛋白富含帶正電荷的精氨酸和賴氨酸，肝素特異性低但高親和力的靜電相互作用可能(kěnéng)導(dǎo)致肝素對(duì)組蛋白的中和作用。抗組蛋白抗體(kàngtǐ)肝素組蛋白減少改善NETs引起的細(xì)胞毒性髓過(guò)氧化物酶抑制劑共四十二頁(yè)組蛋白是真核生物細(xì)胞(xìbāo)中染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4由細(xì)胞(xìbāo)凋亡或壞死時(shí)染色質(zhì)發(fā)生降解，釋放到外周血中產(chǎn)生由PMN釋放NETs產(chǎn)生共四十二頁(yè)組蛋白引起細(xì)胞毒性的作用機(jī)制：補(bǔ)體激活細(xì)胞外組蛋白的完全釋放需C5aR和C5L2受體的參與導(dǎo)致C5a受體破壞作用通過(guò)鈣離子內(nèi)流引發(fā)了細(xì)胞毒性(dúxìnɡ)誘導(dǎo)髓過(guò)氧化物酶（MPO）共四十二頁(yè)

高氧致BPD發(fā)病機(jī)制中有PMN過(guò)度浸潤(rùn)及NETs的過(guò)度形成NETs通過(guò)胞外組蛋白、髓過(guò)氧化物酶等破壞肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，使肺發(fā)育受阻，最終導(dǎo)致BPD發(fā)生。本課題(kètí)擬通過(guò)檢測(cè)高氧致BPD模型中NETs及胞外組蛋白含量進(jìn)一步明確其發(fā)病機(jī)制，并通過(guò)胞外組蛋白拮抗劑（抗組蛋白抗體、肝素）阻斷胞外組蛋白來(lái)破壞NETs結(jié)構(gòu)，從而干擾其對(duì)肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的破壞作用，最終改善BPD，為BPD發(fā)病機(jī)制及臨床治療提供一定的理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)(shíyàn)構(gòu)想高氧致BPD模型NETs胞外組蛋白抗組蛋白抗體肝素破壞治療BPD共四十二頁(yè)研究(yánjiū)內(nèi)容共四十二頁(yè)1）建立高氧致BPD模型。2）共聚焦成像技術(shù)識(shí)別NETs結(jié)構(gòu)。3）檢測(cè)胞外組蛋白水平。4）通過(guò)組蛋白拮抗劑（抗組蛋白抗體、肝素）破壞(pòhuài)NETs結(jié)構(gòu)，觀察肺組織病理變化。共四十二頁(yè)研究(yánjiū)方案

共四十二頁(yè)

新生(xīnshēng)SD大鼠空氣(kōngqì)組BPD組BPD+外源性組蛋白BPD+抗組蛋白抗體BPD+肝素組4、7、14、21d評(píng)價(jià)指標(biāo)肺組織形態(tài)NETs、細(xì)胞外組蛋白機(jī)制探討、治療研究空白對(duì)照組共四十二頁(yè)①外源性組蛋白：（1）給予8-9周的Wister大鼠注入(zhùrù)30mg/kg、50mg/kg、80mg/kg牛胸腺組蛋白，2-24小時(shí)觀察肺病理，提示肺損傷呈劑量依賴性。[11]，規(guī)格：濃度25ug/ml。[12]（2）給予75mg/kg，逐漸出現(xiàn)呼衰、心衰，2小時(shí)后死亡。[10]劑量(jìliàng)共四十二頁(yè)②抗組蛋白抗體：（1）急性肺損傷模型中，小劑量(2．5—5mg／kg)中和抗體保護(hù)作用不明顯，大劑量中和抗體(10～20mg／kg)可明顯降低病死率。[14]（2）給予10mg/kg，可糾正使用相同劑量外源性組蛋白后引起的肺損傷。[10]③肝素、硫酸(liúsuān)乙酰肝素:10mg/kg，保護(hù)作用；20mg/kg，硫酸乙酰肝素保護(hù)作用，肝素加重肺損傷。[13]④人體組蛋白水平：正常中位數(shù)2.3ug/ml，四分位數(shù)間距0.5-3.6；外傷性肺損傷中位數(shù)28.6ug/ml，四分位數(shù)間距13.7-58.9ug/ml。組蛋白大于50ug/ml，損傷明顯。[10]⑤鼠組蛋白水平：外傷性肺損傷后4小時(shí)可達(dá)到190ug/ml；[10]劑量(jìliàng)共四十二頁(yè)1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、器材和試劑動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已得到溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物管理和應(yīng)用委員會(huì)的許可SD大鼠：雌性16只（體重(tǐzhòng)220-240g），雄性8只（體重300-310g），購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心氧箱（規(guī)格）、24hHBO-2B型控氧儀（浙江建德梅域電化分析儀器廠）、測(cè)氧裝置（德國(guó)EnviteC-Wismar）、二氧化碳檢測(cè)儀、電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司檢測(cè)分度值0.001g）、氧氣（購(gòu)買于歐源氣體公司）刀片、組織剪、線剪、鑷子、膠布、100ul胰島素針、10ml注射器、凍存管、EP管、離心機(jī)、移液槍、酒精、4%多聚甲醛、水合氯醛、無(wú)水氯化鈣外源性組蛋白（ug/ml）、抗組蛋白抗體()、組蛋白檢測(cè)試劑盒(ELISA法)、蛋白定量試劑盒、硫酸乙酰肝素

材料(cáiliào)與方法共四十二頁(yè)2動(dòng)物(dòngwù)分組和模型制備配鼠：按雌雄比為2:1進(jìn)行配種，即2只雌鼠與1只雄鼠共同放進(jìn)一個(gè)鼠籠，通過(guò)陰道涂片找精子細(xì)胞作為雌鼠受孕成功的參考依據(jù)。及時(shí)清潔鼠籠、補(bǔ)充食物和水。雌鼠約孕3周生產(chǎn)，選取子鼠168只，體重6-8g進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組：空氣組（A組）、BPD組（B組）、BPD+外源性組蛋白組（C組）、BPD+抗組蛋白抗體組（D組）、BPD+肝素組（E組）、空白對(duì)照組（F組）A、B每組各設(shè)3小組，每小組12只，C、D、E、F每組各設(shè)2小組，每小組12只

共四十二頁(yè)空氣組（A組）：置于空氣中飼養(yǎng)BPD組（B組）：置于氧箱（91%氧濃度、0.5%二氧化碳濃度）BPD+外源性組蛋白組（C組）：處理方法(fāngfǎ)同BPD組，于生后第四天內(nèi)眥靜脈注射外源性組蛋白BPD+抗組蛋白抗體組（D組）：處理方法同BPD組，于生后第四天內(nèi)眥靜脈注射抗組蛋白抗體BPD+肝素組（E組）：處理方法同BPD組，于生后第四天內(nèi)眥靜脈注射肝素空白對(duì)照組（F組）：處理方法同BPD組，于生后第四天內(nèi)眥靜脈注射非特異性IgG氧箱內(nèi)母鼠需每天更換代乳母鼠，防治母鼠氧中毒

共四十二頁(yè)A組、B組生后第4、7、10、14、21天，每次取6只鼠的血標(biāo)本、肺標(biāo)本；C、D、E、F組第7、10、14、21天，每次取6只鼠血標(biāo)本、肺標(biāo)本；予4%水合氯醛腹腔注射麻醉，用100ul針頸靜脈取血，5000r/min離心(líxīn)10min，留取上清液,置于4℃冰箱保存；取肺標(biāo)本，3只10%多聚甲醛肺灌注后置于盛有多聚甲醛液的EP管內(nèi)，置于4℃冰箱保存；3只取肺取后于凍存管，置于-80℃冰箱保存。

標(biāo)本(biāoběn)留取及保存方法共四十二頁(yè)動(dòng)物一般狀態(tài)：毛發(fā)顏色、呼吸、精神及反應(yīng)。死亡及生長(zhǎng)情況：死亡率、死亡時(shí)間、體重增長(zhǎng)等。肺組織形態(tài)學(xué)觀察(guānchá)不同組肺組織病理變化：取自小鼠左肺葉的組織浸泡在10％甲醛溶液中24h，用石蠟包埋，乙醇梯度脫水，切成4um的切片，采用HE染色后于光鏡下觀察肺組織形態(tài)。RAC（放射肺泡計(jì)數(shù)）：自終末細(xì)支氣管中心到最近的纖維隔或肺邊緣作垂直線，該線上的肺泡個(gè)數(shù)。

計(jì)劃觀察(guānchá)指標(biāo)共四十二頁(yè)共聚焦成像技術(shù)識(shí)別NETs結(jié)構(gòu)：分別用中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抗體(kàngtǐ)、DAPI及組蛋白H1抗體進(jìn)行免疫組化染色，并采用共聚焦成像技術(shù)觀察NETs結(jié)構(gòu)。檢測(cè)胞外組蛋白水平：以ELISA法檢測(cè)SD大鼠外周血胞外組蛋白水平變化，主要是H3、H4變化。通過(guò)組蛋白拮抗劑（抗組蛋白抗體、肝素）破壞NET結(jié)構(gòu)，觀察肺組織病理變化。肺組織PCR/WB

計(jì)劃觀察(guānchá)指標(biāo)共四十二頁(yè)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以x±s表示，采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0．05為差異(chāyì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

統(tǒng)計(jì)分析共四十二頁(yè)實(shí)驗(yàn)室、設(shè)備、器材、試劑(shìjì)、動(dòng)物準(zhǔn)備充分91%氧濃度下BPD造模成功、穩(wěn)定制取血、肺標(biāo)本成功

可行性分析(fēnxī)共四十二頁(yè)32

國(guó)內(nèi)外目前尚無(wú)NETs在高氧致BPD模型中的作用研究，同時(shí)亦無(wú)胞外組蛋白在BPD中的作用研究。通過(guò)研究，可以為防治(fángzhì)BPD找到新的方法，為臨床治療BPD提供新的思路。特色(tèsè)與創(chuàng)新之處共四十二頁(yè)血是否(shìfǒu)需非特異性的IgG抗體或生理鹽水作為對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)中外源性組蛋白、抗組蛋白抗體、肝素是否可以設(shè)置濃度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；除了測(cè)定血液中的組蛋白濃度，是否還需測(cè)定其它的一些指標(biāo)：髓過(guò)氧化物酶（MPO）,IL-6,IL-8,血漿游離NDA(cf-DNA)空氣組、高氧組已經(jīng)做過(guò)實(shí)驗(yàn)，是否可以用之前實(shí)驗(yàn)的材料；目前可用的氧箱最多只能容納4組，因此需高氧造模的子鼠需分批進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；組蛋白引起的急性肺損傷會(huì)導(dǎo)致凝血功能障礙、肺血栓、肺出血，而BPD不會(huì)。共聚焦技術(shù)還未掌握存在(cúnzài)的問(wèn)題共四十二頁(yè)預(yù)期(yùqī)結(jié)果共四十二頁(yè)血組蛋白測(cè)定結(jié)果，同一日齡，BPD+外源性組蛋白組>BPD組>空氣組，BPD+抗組蛋白抗體組<BPD組，BPD+肝素組<BPD組；BPD+抗組蛋白抗體組、BPD+肝素組、空氣組對(duì)比？？得出組蛋白對(duì)細(xì)胞及肺血管內(nèi)皮的毒性作用作為BPD的發(fā)生發(fā)展中的因素抗組蛋白抗體、肝素的應(yīng)用(yìngyòng)能夠阻止BPD的發(fā)生發(fā)展預(yù)期(yùqī)結(jié)果共四十二頁(yè)36年度計(jì)劃2015年7月-2015年9月完成空氣組、高氧組標(biāo)本獲取。2015年10月-2015年12月完成實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組標(biāo)本獲取。2016年1月-2016年2月完成血漿組蛋白測(cè)定、肺組織病理切片(bìnɡlǐqiēpiàn)、PCR、WB。2016年3月-2016年6月數(shù)據(jù)整理分析，論文撰寫。共四十二頁(yè)

共四十二頁(yè)參考文獻(xiàn)[1]JobeAH，BancalariE．Brenchopulmonarydysplasia[J]．AmJRespirCritCareMed，2001，163(7)：1723—1729．[2]StollBJ，HansonNI，BellEF，eta1．EuniceKennedyShriverNationalInstituteofChildHealthandHumanDevelopmentNeonatalResearchNetwork．NeonataloutcomesofextremelypreterminfantsfromtheNICHDNeonatalResearchNetwork[J]．Pediatrics，2010，126(3)：443-456．[3]早產(chǎn)兒支氣管肺發(fā)育不良調(diào)查協(xié)作組．早產(chǎn)兒支氣管肺發(fā)育不良發(fā)生率及高危因素的多中心回顧(huígù)調(diào)查分析[J]．中華兒科雜志，201l，49(9)：655-662．共四十二頁(yè)[4]LandryJS，MenziesD．Occurrenceandseverityofbrenchopulmonarydysplasiaandrespiratorydistresssyndromeafterapretermbirth[J]．PaediatrChildHealth，201l，16(7)：399-403．[5]BrinkmannV，ReichardU，GoosmannC，eta1．Neutrophilextraeellulartrapskillbacteria[J]Science，2004，303(5663)：532—1535．[6]vonKSckritz—BlickwedeM，Goldmann0，ThulinP，eta1．Phagocytosis—independentantimicrobialactivityofmastcellsbymeansofextracellulartrapformation[J1．Blood，2008，111(6)：3070—3080．[7]KawasakiH，1wamuroS．Potentialrolesofhistoriesinhostdefenseasantimicrobialagents[Jj．InfectDisordDrugTargets。2008，8(3)：195—205．共四十二頁(yè)[8]SaffarzadehM，JuenemannC，QueisserMA，eta1．Neutrophilcxtraeellulartrapsdirectlyinduceepithelialandendothelialcelldeath：8predominantroleofhistones[J]．PLoSOne，2012，7(2)：e32366．[9]ZeerlederS，ZwartB，WuilleminWA，eta1．Elevatednueleosomelevelsinsystemicinflammat