DB32T-粳稻品種真實性和純度SSR分子標記檢測法編制說明

《粳稻品種真實性和純度SSR分子標記檢測法》編制說明一、目的意義DNA指紋鑒定是農(nóng)作物品種真實性鑒定重要手段。通過對品種進行DNA鑒定進而構(gòu)建DNA指紋庫，有利于加強種子管理、保障種子市場公平競爭、保護農(nóng)民合法權(quán)益以及保障品種審定的公平公正、提升品種創(chuàng)新能力。2015年4月，農(nóng)業(yè)部從戰(zhàn)略角度印發(fā)了《農(nóng)作物品種DNA身份鑒定體系構(gòu)建實施方案》（農(nóng)辦種[2015]18號），要求“各省級農(nóng)業(yè)行政主管部門高度重視，積極支持，提前謀劃并做好相關(guān)準備工作，加快推進品種DNA身份鑒定體系構(gòu)建及推廣應用”?！吨饕r(nóng)作物品種審定辦法》（中華人民共和國農(nóng)業(yè)部令2016年第4號）明確DNA指紋檢測是區(qū)域試驗必選項之一。農(nóng)業(yè)部先后于2007和2014年發(fā)布了《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標記法》（NY/T1433-2007，NY/T1433-2014）農(nóng)業(yè)行業(yè)標準，2021年發(fā)布了國家標準《主要農(nóng)作物品種真實性和純度SSR分子標記檢測稻》（GB/T39917-2021）。然而，由于江蘇水稻大多數(shù)為粳稻，地域性明顯，品種間的遺傳基礎相對狹窄，尤其是粳稻品種間的基因組差異明顯不同于秈稻品種間的基因組差異，這預示上述標準可能不完全適用于江蘇粳稻品種鑒定。在連續(xù)多年的檢測實踐中，我們確實發(fā)現(xiàn)，不少農(nóng)藝表型明顯不同的品種無法用《NY/T1433-2014》和《GB/T39917-2021》標準中推薦的48對引物進行鑒別。這表明相關(guān)標準對江蘇粳稻品種的鑒定效率不高，這將造成一些侵權(quán)套牌的違法違規(guī)品種在新品種試驗或種子市場監(jiān)管中得不到及時查處，影響了市場監(jiān)督管理效率和從事品種原始創(chuàng)新的信心。為此，本項目依據(jù)江蘇粳稻品種間的差異，在《GB/T39917-2021》48個SSR標記的基礎上新增了28個對粳稻品種鑒別力強的SSR標記，并研究制定了基于76個SSR標記的“粳稻品種真實性和純度SSR分子標記檢測”標準，證實該標準可有效提高江蘇粳稻品種的鑒定能力。該標準將為江蘇水稻種子市場監(jiān)管和新品種試驗中的品種真實性或特異性鑒定提供更加可靠的檢測依據(jù)，有利于打擊種子市場和品種審定過程中的各種侵權(quán)套牌、徇私舞弊行為，保障江蘇種業(yè)的健康有序發(fā)展，促進品種原始創(chuàng)新能力提升。二、任務來源本任務由江蘇省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出，經(jīng)省市場監(jiān)督管理局立項批準（關(guān)于2022年度江蘇省地方標準立項的公示[01400022-0/2022-00149]），立項文件名稱為《水稻品種真實性鑒定SSR標記法》（項目序號：229），項目承擔單位為揚州大學和江蘇省種子管理站，經(jīng)大量研究，起草了以《粳稻品種真實性和純度SSR分子標記檢測法》為項目名稱的標準文件。三、編制過程（1）成立起草小組。2021年11月《省市場監(jiān)管局關(guān)于組織申報2022年度江蘇省地方標準項目的通知》（蘇市監(jiān)標函[2021]356號）標準編制任務下達后，揚州大學立即聯(lián)合江蘇省種子管理站，組建起草小組，組織相關(guān)技術(shù)人員對標準的格式、條款、涉及的內(nèi)容等進行研討、分工，組織編寫標準草案及項目申報書，按時完成申報，并于2022年5月經(jīng)省市場監(jiān)督管理局立項批準。（2）編制草案。揚州大學前期經(jīng)過大量研究篩選，初步確定了適用于江蘇水稻品種鑒定的79個SSR標記，成立起草小組后，為了進一步驗證初步推薦的79對標記，于2022~2023年，進一步對江蘇近30年審定的230個粳稻品種進行標記基因型檢測分析，基于研究結(jié)果，最終確定了76對推薦標記，起草了《水稻品種真實性和純度SSR分子標記檢測》（草案）。（3）廣泛征求意見。在前期研究的基礎上，起草小組形成《水稻品種真實性和純度SSR分子標記檢測》（征求意見稿）。2024年3月，編制單位廣泛征求省內(nèi)外從事水稻育種工作的企/事業(yè)單位意見，包括江蘇省農(nóng)業(yè)科學院、南京農(nóng)業(yè)大學、江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所、蘇州市農(nóng)業(yè)科學院、江蘇省農(nóng)墾農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司、中國水稻研究所等單位，并以省內(nèi)從事育種工作的事業(yè)單位為主（12個）。共收到17個單位的共20位專家的反饋意見，共收到意見120條，其中采納意見86條、部分采納6條、不予采納28條，部分采納和不予采納意見的理由也在標準征求意見匯總處理表中加以說明。編制單位對收集的有關(guān)建議和意見進行逐條分析與修改，進一步完善標準，于2024年4月形成了《水稻品種真實性和純度SSR分子標記檢測》（送審稿）。（4）標準送審完善。2024年7月27日，省市場監(jiān)督管理局委托江蘇省農(nóng)作物標準化技術(shù)委員會組織專家對《水稻品種真實性和純度SSR分子標記檢測》（送審稿）進行審查。專家組聽取編制組關(guān)于標準編制情況的匯報，提出了修改建議。編制組嚴格按照專家的意見和建議，對標準送審稿進行了修改完善，形成《粳稻品種真實性和純度SSR分子標記檢測法》（報批稿）。四、主要內(nèi)容技術(shù)指標確定（1）用于江蘇水稻品種真實性鑒定標記的初步篩選本項目立項前期利用12個代表性粳稻品種為材料，從714個SSR標記中篩選到121個多態(tài)性標記，連同《NY/T-1433-2014》中的32個多態(tài)性標記共計153個評價了江蘇46個粳稻品種的遺傳多樣性，結(jié)合標記的多態(tài)性及其在染色體上的分布，初步確定了52個核心標記用于江蘇水稻品種鑒定，利用計算機模擬發(fā)現(xiàn)，能夠有效區(qū)分這46個品種的最少標記數(shù)為35個。由表1可知，《NY/T-1433-2014》中的48個標記在46個供試品種共檢測到77個等位基因，平均為1.94個，各標記檢測到的等位基因數(shù)在1~5之間，其中有16個標記在供試品種間沒有多態(tài)性，均只有1個等位基因，PIC值超過0.3的標記有18個，超過0.5的標記只有5個。然而，篩出的52個核心標記累計檢測到132個等位基因，明顯高于2014行標中的48個標記檢測到的等位基因數(shù)，各標記檢測到的等位基因數(shù)為2~4個，平均為2.54，有32個標記PIC在0.3以上，其中13個在0.5以上（表2）。根據(jù)Botstein等的方法界定：當PIC>0.5時，該位點為高度多態(tài)性位點，0.25≤PIC≤0.5時為中度多態(tài)性位點，PIC<0.25時為低度多態(tài)性位點，因此，總體而言，相比于行標2014版中的絕大多數(shù)標記，本項目前期開發(fā)的52個標記位點在江蘇粳稻品種間具有更高的變異性，有利于提高對江蘇粳稻品種的鑒定能力（左示敏等，SSR標記在江蘇粳稻品種鑒定中的應用研究，揚州大學學報，2014，35：46-51）?？紤]到上述鑒別樣品品種數(shù)較少，而實際鑒定的樣品數(shù)量較多、親緣關(guān)系可能更近，同時考慮到檢測結(jié)果與《NY/T-1433-2014》《GB/T39917-2021》接軌，以及考慮各標記在染色體上的分布均勻度、標記擴增等位基因數(shù)及PIC值，本項目選擇了《NY/T-1433-2014》《GB/T39917-2021》中48個標記以及篩選到的52個核心標記中多態(tài)性較好、PIC值較高的31個標記，共計79個標記作為本標準初步推薦標記。表1《NY/T-1433-2014》中的48個標記在46個粳稻品種中的等位基因數(shù)和PICChr.引物等位基因數(shù)PICChr.引物等位基因數(shù)PIC1RM1195*20.486RM253*30.301RM49030.236RM17620.081RM58320.277RM48150.571RM49320.297RM54230.481RM44310.007RM43210.002RM42310.007RM336*30.572RM71*10.008RM72*20.502RM42410.008RM33120.362RM56130.418RM33910.002RM208*20.479RM31620.503RM23110.009RM219*20.043RM232*20.389RM278*10.003RM827730.469OSR2820.083RM57110.0010RM311*20.143RM85*10.0010RM258*10.004RM55120.0810RM59010.004RM47120.1611RM33220.234RM11910.0011RM209*30.484RM56720.2711RM2120.505RM267*10.0011RM224*30.335RM28920.0412RM19*30.475RM59810.0012RM710230.485RM274*10.0012RM333120.476RM190*20.0412RM17*20.24表2用于江蘇粳稻品種鑒定的52個核心標記的等位基因數(shù)及PICChr.引物名稱等位基因數(shù)PICChr.引物名稱等位基因數(shù)PIC1RM49030.236RM41230.271RM49320.297RM549920.451RM382530.547RM571140.581RM920.347RM687220.491RM133130.367RM379920.041RM28330.338RM580830.522RM385830.578RM54740.752RM547230.628RM694820.042RM135820.448RM2282520.292ZY24.5-2-630.508RM548520.482RM637830.639OSR2820.083LG25.4-3-120.499ZY5.1-9-120.393RM592420.179WY13.3-920.503RM329720.4510RM31120.143RM21830.2310RM568930.254RM138830.0810RM137530.594RM34820.0411RM121920.474RM135920.4811RM591820.084XG16.6-4-120.2411RM53630.555RM28920.0411RM22430.335RM3130.5612RM2780820.475RM111520.0412RM697320.425RM379630.5512RM24730.396RM58530.4812ZY15.1-12-430.476RM719340.2012LG25.1-12-120.196RM318320.2412RM710230.48（2）用于江蘇水稻品種真實性鑒定標記的驗證為了驗證初步推薦的79對標記，本項目進一步對江蘇近30年審定的230個粳稻品種進行標記基因型檢測。由表3可知，總計79個標記在供試品種中共檢測到599個等位基因，各標記檢測到的等位基因數(shù)在3~19個之間，平均為8個；多態(tài)性標記的比例高達100%；79個SSR標記的PIC值變幅在0.009~0.813之間，平均為0.453，其中國標推薦的48個標記平均值為0.393，明顯低于本項目篩選的31個標記的平均值0.545；PIC值大于0.25的標記有62個，大于0.50的有38個。本研究79個SSR位點中，高度多態(tài)性位點占比為48%，中度多態(tài)性位點占比為30%，這表明本項目采用的SSR標記在測試品種群體中具有豐富的多態(tài)性。表379個標記在233個粳稻品種中的等位基因，PIC值和Shannon指數(shù)*MarkerChrNaIPICRM1331160.7260.347RM1195151.0060.591RM583191.4520.691RM91141.7420.746RM443150.230.087RM3825190.9440.447RM490191.1080.539RM493170.60.304RM6378291.6260.751RM71260.4260.173RM1358270.8260.419ZY24.5-2-62131.8950.807RM5472271.1140.588RM208251.1460.566RM423250.190.071RM424230.0310.009RM561240.6230.321RM231340.3640.154RM2183100.790.321RM3297340.6550.433LG25.4-3-1351.0610.547RM82773121.2930.572RM232380.8820.415RM571340.130.046RM85381.2610.608RM551440.6670.37XG16.6-4-1460.7430.373RM1359481.5490.721RM5674101.4690.722RM119470.5860.234RM471470.7340.439RM3796571.290.659RM1115570.1630.051RM598540.4630.212RM274530.1940.079RM267540.2010.086RM289530.0870.03RM190650.6090.319RM3183661.1170.638RM71936111.1830.536RM412660.8660.408RM176660.6270.289RM2536111.1790.531RM57117192.0230.806RM6872780.9490.513RM542781.1490.591RM432740.1760.063RM3799N750.8770.532RM3367141.5110.675RM4817131.2560.606RM547N8161.8220.781RM728131.5370.681RM228258131.4420.669RM339860.7460.399RM5485830.720.499RM331840.7420.48RM316950.8680.467RM2199121.1980.473WY13.3-9940.9450.55RM278930.3050.137OSR28960.5330.268RM3111091.3630.631RM568910161.7130.742RM5901050.1610.055RM2581040.350.179RM3321161.0270.552RM5918N11111.4170.698RM536N1190.6890.283RM2111141.9670.813RM2241160.8730.453RM20911131.5350.642RM69731250.9420.566RM191281.5220.757RM2780812101.410.686RM71021281.0280.574ZY15.1-12-41291.2520.611RM33311250.8420.488LG25.1-12-1N1270.4280.176RM171250.8180.436*Chr.染色體;Na.等位基因數(shù)；I.Shannon指數(shù)；PIC.多態(tài)信息含量。接著，分別比較統(tǒng)計了兩類標記在粳稻和秈稻品種群體中的PIC值和擴增等位基因數(shù)（Na）值。表4顯示：國標中48個SSR標記在粳稻品種群體中的PIC值變幅在0.009~0.813之間，平均為0.39；在秈稻中在0.344~0.835之間，平均為0.63。48個標記在粳稻中擴增的等位基因數(shù)在3~14個之間，平均每個標記擴增6.9個等位基因；在秈稻中擴增的等位基因范圍在3~17個，平均每個標記擴增9個等位基因。表5顯示：本項目開發(fā)的31個SSR標記在粳稻品種中擴增的PIC值范圍在0.051~0.807之間，平均為0.545；在秈稻中的擴增的PIC范圍在0.212~0.888之間，平均為0.614；31個標記在粳稻中擴增的等位基因數(shù)在3~19個之間，平均每個標記擴增出8.7個等位基因；在秈稻中擴增的等位基因數(shù)范圍在2~18個，平均每個標記擴增9個等位基因。進一步對兩套標記在江蘇水稻品種中的PIC值和Na值進行比較，結(jié)果（表6）顯示：本項目開發(fā)的31個標記在粳稻中的PIC值、Na值均顯著高于48個標記，但在秈稻中，兩者差異不顯著。對230份粳稻和89份秈稻品種間的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)分別進行聚類分析，分別篩選出在三組相似度最高的品種，分別為：淮稻33與淮稻35，鹽申稻83006與中鹽稻83011，甬優(yōu)6711與甬優(yōu)7826。由表7可知，每組水稻的生態(tài)類型，審定年份均相同，除鹽申稻83006與中鹽稻83011外，其他兩組均來自相同的育種單位。對三組品種間的差異標記情況進行分析（表8），發(fā)現(xiàn)在國標48個SSR標記中，品種淮稻33和淮稻35之間有4個位點差異，品種鹽申稻83006和中鹽稻83011之間有3個位點的差異，品種甬優(yōu)6711與甬優(yōu)7826僅存在2個位點差異。但是這三組品種在本實驗室開發(fā)的31個標記位點上分別有3、5和3個位點差異。2022年，我們在與江蘇省種子站合作對江蘇推廣品種真實性進行鑒定中，發(fā)現(xiàn)一個抽檢品種與標準品種“泗稻20”之間在國標48個SSR標記位點中僅存在1個位點差異（圖1A），按照國家標準推薦，這個抽檢品種應該不存在真實性問題，然而，在增加我們開發(fā)的28個標記后，又發(fā)現(xiàn)了該抽樣與標樣間存在2個新的差異位點，這暗示該抽樣可能不是“泗稻20”原品種（圖1A）；隨后，在田間對該樣品與標樣進行了種植比較，發(fā)現(xiàn)彼此在抽穗期、穗型及株高上存在明顯差異（圖1B、C）。同年，在與江蘇省種子管理站合作對江蘇水稻新品種特異性鑒定中，發(fā)現(xiàn)鎮(zhèn)稻9049和鎮(zhèn)稻9042兩個參試品系間在國標中公布的48個SSR標記位點上僅存在1個位點差異，利用本標準檢測后發(fā)現(xiàn)兩者間還存在1個位點差異（圖2A）；在田間，我們發(fā)現(xiàn)這兩個新品系在抽穗期上存在明顯差異（圖2B），兩者分屬于中熟中粳和遲熟中粳兩個完全熟期類型品種。這些實例表明，本標準可以有效提高江蘇水稻尤其是粳稻品種的鑒定能力。綜上結(jié)果表明，進一步證明國標中推薦的48個SSR標記對江蘇粳稻審定和推廣品種的鑒別力是弱于本項目開發(fā)的31個標記，但在秈稻品種鑒定上彼此差異不明顯。表448個標記在秈稻與粳稻中擴增的等位基因數(shù)與PIC值引物名稱ChrNaPIC粳稻秈稻粳稻秈稻RM11951560.5910.558RM58319130.6910.788RM4431560.0870.493RM49019100.5390.609RM49317160.3040.769RM7126110.1730.683RM2082580.5660.673RM4232540.0710.436RM4242380.0090.722RM5612460.3210.491RM2313460.1540.653RM8277312130.5720.832RM23238120.4150.779RM5713460.0460.592RM853880.6080.732RM5514450.370.514RM56741090.7220.813RM11947100.2340.653RM4714750.4390.344RM5985480.2120.517RM2745350.0790.423RM2675440.0860.586RM2895360.030.445RM1906550.3190.450RM1766650.2890.496RM25361180.5310.691RM5427890.5910.478RM4327430.0630.559RM336714140.6750.772RM481713130.6060.835RM72813150.6810.728RM33986100.3990.595RM3318460.480.435RM3169550.4670.604RM219912100.4730.704RM2789390.1370.714OSR289680.2680.593RM311109100.6310.829RM59010570.0550.567RM25810480.1790.633RM33211680.5520.592RM211114170.8130.777RM22411690.4530.741RM2091113100.6420.624RM19128120.7570.733RM710212870.5740.714RM3331125100.4880.707RM1712580.4360.593表531個本項目開發(fā)標記在秈稻與粳稻中的等位基因數(shù)與PIC值情況引物名稱ChrNaPIC粳稻秈稻粳稻秈稻RM13311670.3470.627RM9114160.7460.802RM38251990.4470.768RM637829130.7510.605RM135827130.4190.799ZY24.5-2-6213120.8070.787RM547227110.5880.499RM218310110.3210.771RM32973480.4330.739LG25.4-3-13550.5470.573XG16.6-4-14650.3730.415RM13594890.7210.660RM37965780.6590.583RM11155750.0510.550RM31836630.6380.405RM719361170.5360.645RM4126660.4080.558RM5711719130.8060.722RM68727860.5130.365RM3799N7560.5320.430RM547N816100.7810.734RM2282581390.6690.526RM54858320.4990.212WY13.3-99430.550.407RM56891016180.7420.888RM5918N1111110.6980.839RM536N11990.2830.686RM697312570.5660.552RM278081210140.6860.822ZY15.1-12-412990.6110.694LG25.1-12-1N12740.1760.380表6兩類標記分別在粳稻和秈稻中檢測到的等位基因數(shù)，PIC值NaPIC粳稻秈稻粳稻秈稻48標記均值6.8590.390.63范圍3~143~170.009~0.8130.344~0.835總數(shù)32941118.87830.27331標記均值8.7190.550.61范圍3~192~180.051~0.8070.212~0.888總數(shù)27026916.90419.044F顯著極顯著表7最相似品種的品種審定信息品種名稱生態(tài)類型審定年份審定編號育種單位1淮稻33中熟中粳2021蘇審稻20210035江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學研究所淮稻35中熟中粳2021蘇審稻20210036江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學研究所2鹽申稻83006遲熟中粳2021蘇審稻20210045江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所中鹽稻83011遲熟中粳2021蘇審稻20210060中國水稻研究所3甬優(yōu)6711秈稻2020蘇審稻20200021寧波種業(yè)股份有限公司甬優(yōu)7826秈稻2020蘇審稻20200028寧波種業(yè)股份有限公司表8最相似品種在兩類標記中的差異標記品種名稱48標記31標記淮稻33RM443LG25.4-3-1淮稻35RM311RM1359RM176RM6973RM253鹽申稻83006RM311RM6378中鹽稻83011RM19RM3796RM209RM3183WY13.3-9ZY15.1-12-4甬優(yōu)6711RM8277RM412甬優(yōu)7826RM7102RM547RM5918圖1泗稻20品種市場抽檢樣品與標準樣品間的差異標記位點及田間種植比較注：標記檢測中RM208為國標標記，RM5711和RM5918為本項目開發(fā)的標記。BABA圖2抽穗期明顯不同的新品系“鎮(zhèn)稻9049和鎮(zhèn)稻9042”差異標記位點及田間表型注：真實性標記對比中RM9為本項目開發(fā)的標記，RM219為國標標記。（3）用于江蘇水稻品種真實性鑒定標記的最終確定鑒于上述結(jié)論，本項目認為在江蘇水稻尤其是粳稻品種鑒定中，有必要在國標中的48個標記數(shù)量上增加一些新標記，以提高對江蘇水稻品種真實性的鑒定效果。表9可知：本項目開發(fā)的31個標記在2號、7號、12號染色體上分布數(shù)量較多，位于2號染色體上的引物RM6378與引物ZY24.5-2-6位置接近，但引物ZY24.5-2-6在粳稻中擴增的等位基因數(shù)（13）大于引物RM6378（9）；引物ZY24.5-2-6在粳稻中擴增的PIC值為0.807，大于引物RM6378的0.751；位于7號染色體上的引物RM3799N與國標引物RM336位置接近，但引物RM3799N在粳稻與秈稻中擴增的等位基因數(shù)不及國標引物RM336的一半，引物RM3799N的PIC值也低于國標引物RM336；位于12號染色體上的引物ZY15.1-12-4與引物LG25.1-12-1N距離較接近，但引物ZY15.1-12-4在粳到與秈稻中擴增的等位基因數(shù)（9）大于引物LG25.1-12-1N在粳稻（7）與秈稻（4）中擴增的等位基因數(shù)，且引物ZY15.1-12-4在粳稻與秈稻中的PIC值均明顯高于引物LG25.1-12-1N。最后，結(jié)合上述鑒定結(jié)果，以及考慮各標記在染色體上的分布均勻度、標記擴增等位基因數(shù)及PIC值，認為可去除RM6378、RM3799N和LG25.1-12-1N這3個標記，最終選用國標中的48個標記（R1~R48）與剩余28個標記（R49~R76）共同組成本標準最終推薦的76個SSR標記（表10），它們在多數(shù)染色體上的分布較為均勻（圖3）。利用本標準推薦的76個標記可進一步提高江蘇水稻品種真實性的鑒定效率，提升種子市場中侵權(quán)冒牌品種的鑒定準確度和效率。表979個SSR標記在染色體上的數(shù)量分布標記位置標記總數(shù)48引物個數(shù)31引物個數(shù)Chr1853Chr2954Chr3853Chr4642Chr5642Chr6633Chr7743Chr8633Chr9541Chr10431Chr11642Chr12844表10本標準推薦的76個真實性鑒定SSR標記編號引物名稱染色體

（位置bp）退火溫度℃引物序列（5'→3'）標記

熒光R1RM11951（6154147）55正向：ATGGACCACAAACGACCTTCFAM反向：CGACTCCCTTGTTCTTCTGGR2RM4901（6677229）55正向：ATCTGCACACTGCAAACACCFAM反向：AGCAAGCAGTGCTTTCAGAGR3RM5831（8329859）55正向：AGATCCATCCCTGTGGAGAGFAM反向：GCGAACTCGCGTTGTAATCR4RM4931（12281333）55正向：TAGCTCCAACAGGATCGACCVIC反向：GTACGTAAACGCGGAAGGTGR5RM4431（28340457）55正向：GATGGTTTTCATCGGCTACGFAM反向：AGTCCCAGAATGTCGTTTCGR6RM4232（3836868）55正向：AGCACCCATGCCTTATGTTGFAM反向：CCTTTTTCAGTAGCCCTCCCR7RM712（8760538）55正向：CTAGAGGCGAAAACGAGATGVIC反向：GGGTGGGCGAGGTAATAATGR8RM4242（11389926）55正向：TTTGTGGCTCACCAGTTGAGNED反向：TGGCGCATTCATGTCATCR9RM5612（18769990）55正向：GAGCTGTTTTGGACTACGGCFAM反向：GAGTAGCTTTCTCCCACCCCR10RM2082（35141667）55正向：TCTGCAAGCCTTGTCTGATGPET反向：TAAGTCGATCATTGTGTGGACCR11RM2313（2454259）55正向：CCAGATTATTTCCTGAGGTCPET反向：CACTTGCATAGTTCTGCATTGR12RM2323（9755758）55正向：CCGGTATCCTTCGATATTGCPET反向：CCGACTTTTCCTCCTGACGR13RM82773（28811831）55正向：AGCACAAGTAGGTGCATTTCNED反向:ATTTGCCTGTGATGTAATAGCR14RM5713（33157686）55正向：GGAGGTGAAAGCGAATCATGFAM反向：CCTGCTGCTCTTTCATCAGCR15RM853（36348225）55正向：CCAAAGATGAAACCTGGATTGFAM反向：GCACAAGGTGAGCAGTCCR16RM5514（178251）55正向：AGCCCAGACTAGCATGATTGFAM反向GAAGGCGAGAAGGATCACAGR17RM4714（18996871）55正向：ACGCACAAGCAGATGATGAGVIC反向：GGGAGAAGACGAATGTTTGCR18RM1194（21414514）67正向：CATCCCCCTGCTGCTGCTGCTGPET反向：CGCCGGATGTGTGGGACTAGCGR19RM5674（34718825）55正向:ATCAGGGAAATCCTGAAGGGFAM反向:GGAAGGAGCAATCACCACTGR20RM2675（2881456）55正向：TGCAGACATAGAGAAGGAAGTGNED反向：AGCAACAGCACAACTTGATGR21RM2895（7807871）55正向：TTCCATGGCACACAAGCCPET反向：CTGTGCACGAACTTCCAAAGR22RM5985（16811549）55正向：GAATCGCACACGTGATGAACPET反向：ATGCGACTGATCGGTACTCCR23RM2745（26910926）55正向：CCTCGCTTATGAGAGCTTCGVIC反向：CTTCTCCATCACTCCCATGGR24RM2536（5426496）55正向：TCCTTCAAGAGTGCAAAACCPET反向：GCATTGTCATGTCGAAGCCR25RM1906（1765636）55正向：CTTTGTCTATCTCAAGACACVIC反向：TTGCAGATGTTCTTCCTGATGR26RM1766（30266435）67正向：CGGCTCCCGCTACGACGTCTCCNED反向：AGCGATGCGCTGGAAGAGGTGCR27RM4817（2876164）55正向：TAGCTAGCCGATTGAATGGCFAM反向：CTCCACCTCCTATGTTGTTGR28RM5427（12713066）55正向：TGAATCAAGCCCCTCACTACFAM反向：CTGCAACGAGTAAGGCAGAGR29RM4327（18959591）55正向：TTCTGTCTCACGCTGGATTGPET反向：AGCTGCGTACGTGATGAATGR30RM3367（21872197）55正向：CTTACAGAGAAACGGCATCGVIC反向：GCTGGTTTGTTTCAGGTTCGR31RM728（6763704）55正向：CCGGCGATAAAACAATGAGNED反向：GCATCGGTCCTAACTAAGGGR32RM3318（12295421）55正向：GAACCAGAGGACAAAAATGCNED反向：CATCATACATTTGCAGCCAGR33RM3398（17945059）55正向：GTAATCGATGCTGTGGGAAGVIC反向：GAGTCATGTGATAGCCGATATGR34RM3169（1072098）55正向：CTAGTTGGGCATACGATGGCVIC反向：ACGCTTATATGTTACGTCAACR35RM2199（7888399）55正向：CGTCGGATGATGTAAAGCCTFAM反向：CATATCGGCATTCGCCTGR36RM2789（19320429）55正向：GTAGTGAGCCTAACAATAATCNED反向：TCAACTCAGCATCTCTGTCCR37OSR289（19788731）55正向：AGCAGCTATAGCTTAGCTGGNED反向：ACTGCACATGAGCAGAGACAR38RM31110（9818761）50正向：TGGTAGTATAGGTACTAAACATVIC反向：TCCTATACACATACAAACATACR39RM25810（18085610）55正向：TGCTGTATGTAGCTCGCACCVIC反向：TGGCCTTTAAAGCTGTCGCR40RM59010（23114803)55正向：CATCTCCGCTCTCCATGCPET反向：GGAGTTGGGGTCTTGTTCGR41RM20911（18274582）55正向：ATATGAGTTGCTGTCGTGCGVIC反向：CAACTTGCATCCTCCCCTCCR42RM2111（19173027）55正向：ACAGTATTCCGTAGGCACGGPET反向：GCTCCATGAGGGTGGTAGAGR43RM22411（27673250）55正向：ATCGATCGATCTTCACGAGGNED反向：TGCTATAAAAGGCATTCGGGR44RM33211（2844306）55正向：GCGAAGGCGAAGGTGAAGFAM反向：CATGAGTGATCTCACTCACCCR45RM1912（2433077）55正向：CAAAAACAGAGCAGATGACFAM反向：CTCAAGATGGACGCCAAGAR46RM710212（13214146）55正向：CGGCTTGAGAGCGTTTTTAGFAM反向：TACTTGGTTACTCGGGTCGGR47RM333112（23494475）50正向：CCTCCTCCATGAGCTAATGCFAM反向：AGGAGGAGCGGATTTCTCTCR48RM1712（26988413）55正向：TGCCCTGTTATTTTCTTCTCTCNED反向：GGTGATCCTTTCCCATTTCAR49RM13311（1670278）55正向：CACCAGCTTCATGCATGCFAM反向：AGCACTCAACTGATGCAGTGR50RM91（23326225）55正向：GGTGCCATTGTCGTCCTCVIC反向：ACGGCCCTCATCACCTTCR51RM38251（36471203）55正向：AAAGCCCCCAAAAGCAGTACVIC反向：GTGAAACTCTGGGGTGTTCGR52ZY24.5-2-62（5126573）55正向：CACTCCTACTTCCTCCGTTFAM反向：AGGCGTGATGTTCTACTGTTAR53RM13582（10185685）55正向：GATCGATGCAGCAGCATATGNED反向：ACGTGTGGCTGCTTTTGCR54RM54722（30643072）55正向：CACTCAAGACCAGACCTGTACGPET反向：CGGCACGTCATTGTAGTGACR55RM2183（8406429）55正向：TGGTCAAACCAAGGTCCTTCFAM反向：GACATACATTCTACCCCCGGR56RM32973（13289444）55正向：CTCGTACTCCTCTTCCACCGVIC反向：GTAACCTAGCTGCCCCTTCCR57LG25.4-3-13（25378971）55正向：AACTGAATAATAAGCCAACCPET反向：AGAATGCTCTGAGGGATGTR58XG16.6-4-14（15247546）55正向：AAAGTGTCCCAGTCCATTFAM反向：CCTTTACTCGCCAGATGCR59RM13594（20032557）55正向：CTCGCGAGGAAGAAGACAACPET反向：CGCCGGCTGGTTAATTAATCR60RM37965（488187）55正向：ATTAGCCTTTAATTCCACTGFAM反向：ATACAAACAAACAGCTTGTGR61RM11155（14816294）55正向：GCTGCAATTTATACCGGAGGPET反向：AGCCACCACCATCTATCTGCR62RM31836（12448177）55正向：GCTCCACAGAAAAGCAAAGCVIC反向：TGCAACAGTAGCTGTAGCCGR63RM71936（20258707）55正向：ATGTGGGAATTTCTAGCCCCNED反向：CCCTAGTTTTCCAAATGGCCR64RM4126（30328850）55正向：CACTTGAGAAAGTTAGTGCAGCFAM反向：CCCAAACACACCCAAATACR65RM57117（3142306）55正向：GTCCATGCATCCATCTCTAGFAM反向：ACGGAAGGAATACGTCTGTAR66RM68727（4660489）55正向：GGATGAACACTGATGATGGCFAM反向：ACCTCCACCACGATATCCACR67RM547N8（5592401）55正向：GTCAAGATCATCCTCGTAGCNED反向：TGTCGATTGTATCAGTTTGGR68RM228258（11759304）55正向：AGCACATCACAAACCTACCCTACCVIC反向：CCTAATTAATCCCGCGGAACCR69RM54858（24072903）55正向：CTTCCACAAGCTTGGCTAGGPET反向：AATGCCATCCCCTACTCATGR70WY13.3-99（13265227）55正向：CTGACTCCGACATCCGAAACFAM反向：AACCCTGGCAAGTAGTAAAGR71RM568910（13554862）55正向：GCACATGGTGAGACGTCCTCFAM反向AAGTCCTGTAGTAGGTCACACCGR72RM5918N11（3025975）55正向：AAAGGAAAGCCACAGAAGTGNED反向：TTGCAACCAGGTTGGTAAGAR73RM536N11（8990595）55正向：ACATGCACCAGAGTTCATAATFAM反向：TTTCTTTGCTCAGACCTTACAR74RM2780812（7358562）55正向:GGAAGTGCCCGATTAGTATAGGFAM反向:ATCACCTACTACCTCCATTTCAGGR75ZY15.1-12-412（24434567）55正向：TAACGGTTGGATGTTTTGCTFAM反向：AGAG