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ICSFORMTEXT點(diǎn)擊此處添加ICS號(hào)FORMTEXT點(diǎn)擊此處添加中國標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)分類號(hào)FORMTEXT?????DBFORMTEXT61DBFORMTEXT61/FORMTEXTXXXXX—FORMTEXTXXXXFORMTEXT?????奶牛活體采卵技術(shù)規(guī)程Technicalspecificationofovumpick-upindairy

cattle

FORMTEXT點(diǎn)擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識(shí)FORMDROPDOWNFORMTEXT?????FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實(shí)施FORMTEXT陜西省市場(chǎng)監(jiān)督管理局???發(fā)布DBXX/XXXXX—XXXX前言本文件依據(jù)GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由陜西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位:西北農(nóng)林科技大學(xué)、楊凌秾福農(nóng)牧科技服務(wù)有限公司、陜西省畜牧產(chǎn)業(yè)試驗(yàn)示范中心。本文件主要起草人:林鵬飛、靳亞平、王勇勝、肖勁邦、李赫強(qiáng)、謝成運(yùn)、田滿園、王炳科、肖紅年、賈永宏。奶?;铙w采卵技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了奶?;铙w采卵技術(shù)中采卵室的基本要求、供體牛篩選與飼養(yǎng)管理、供體牛卵巢刺激前評(píng)估、供體牛卵巢刺激程序、活體采卵操作、卵母細(xì)胞分級(jí)鑒定的技術(shù)要求。本文件適用于奶?;铙w采卵技術(shù)及其他相關(guān)領(lǐng)域的科研需求。規(guī)范性引用文件本標(biāo)準(zhǔn)采用下列術(shù)語和定義下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T26938-2011牛胚胎生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程。T/DACS002-2021荷斯坦牛體型鑒定操作技術(shù)規(guī)范。術(shù)語和定義供體牛donor指提供優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞的良種母牛?;铙w采卵ovumpick-up(OPU)借助專用獸用超聲診斷儀,用陰道探頭、采卵針、連接系統(tǒng)和負(fù)壓泵直接從活體供體牛卵巢上抽吸卵泡液中包含未成熟卵母細(xì)胞的操作過程。卵巢刺激superstimulationOPU前,通過專用獸用超聲診斷儀和外源性激素,誘導(dǎo)供體牛卵巢發(fā)育更多卵泡,確保卵母細(xì)胞質(zhì)量和適宜大小卵泡的比例,配合后續(xù)不同體外胚胎生產(chǎn)的操作方法。卵巢刺激與超數(shù)排卵不同,后者需誘導(dǎo)卵泡成功排卵,前者應(yīng)盡可能保證卵泡以適宜大小存在于卵巢上并避免過度成熟。采卵室基本要求儀器OPU獸用超聲診斷儀:包括顯示器、OPU專用陰道探頭(128陣元、頻率5.5Hz~7.5Hz、適配各型號(hào)采卵針)、負(fù)壓泵(吸引壓力0kPa~25kPa、0mmHg~200mmHg),恒溫器(操作控溫范圍為38.5±1℃,適配收集管為50mL離心管)、血糖血酮儀。場(chǎng)地設(shè)施采卵室要求清潔安靜、明亮寬敞、溫度需8℃~25℃,配備有水電、置物臺(tái)及設(shè)置有防踢鏈的六柱欄保定架。藥品耗材所用藥品生產(chǎn)廠家應(yīng)具備生產(chǎn)資質(zhì),試劑批號(hào)、編號(hào)須清晰,試劑和藥物應(yīng)在保質(zhì)期內(nèi)并嚴(yán)格按照使用說明書貯存、取用和配置。藥品。獸用注射用促卵泡素(FSH)、注射用前列腺素F2α、孕酮陰道栓,血糖血酮儀試紙、2%鹽酸利多卡因、耦合劑、75%酒精、石蠟油、生理鹽水、新潔爾滅等。耗材。一次性采卵針(18G×24/5或1,2×70mm)、硅膠管(1.2mm×2.4mm)、注射器(10mL,20mL、50mL),長臂手套、乳膠手套、口罩、吸水衛(wèi)生紙等。供體牛篩選與飼養(yǎng)管理選拔適用對(duì)象青年母奶牛和成年母奶牛均可作為候選供體牛群體。選擇供體牛時(shí),宜根據(jù)牧場(chǎng)育種目標(biāo)、實(shí)際生產(chǎn)需要和基因組測(cè)序結(jié)果,選擇具有產(chǎn)奶量、長壽性、繁殖性能、健康度、適應(yīng)性和抗逆性等優(yōu)良遺傳學(xué)價(jià)值的母牛。生產(chǎn)性能分析調(diào)取牧場(chǎng)DHI檢測(cè)、生產(chǎn)性能和繁殖、疾病治療等記錄。供體牛應(yīng)滿足下列要求:健康狀況良好,排除遺傳性疾病與生殖器官疾??;年產(chǎn)奶量14t以上,生產(chǎn)壽命高于4胎次;成年母牛應(yīng)為2~4胎次、產(chǎn)后天數(shù)超過45d、卵巢機(jī)能已完全恢復(fù);青年母牛應(yīng)為9月齡以上、卵巢狀態(tài)發(fā)育良好并至少有1次完整的發(fā)情周期。線性鑒定參照T/DACS002-2021鑒定供體牛體型。荷斯坦奶牛共劃分5個(gè)部位:包括體軀容量(18%)、尻部(10%)、肢蹄(20%)、泌乳系統(tǒng)(42%)和乳用特征(10%),20個(gè)線性評(píng)分性狀和23個(gè)缺陷性狀。按體型鑒定得分劃分為6個(gè)等級(jí):優(yōu)秀(EX,90~100)、很好(VG,85~89)、好+(G+,80~84)、好(G,75~79)、一般(F,65~74)和差(P,65分以下)。應(yīng)選擇等級(jí)為“好+”及以上、無明顯體型缺陷的母牛作為供體牛。全基因組選擇全基因組測(cè)序應(yīng)由商業(yè)化公司完成。操作人員應(yīng)穿戴防護(hù)、確保血斑卡干凈無污染,奶牛耳號(hào)、血斑卡號(hào)和表格登錄號(hào)必須保持一致,規(guī)范制作測(cè)序血液樣本血斑卡:在空白的血斑卡背面標(biāo)記牛號(hào)等信息,用5mL或10mL的一次性無菌注射器,從奶牛尾根部或頸部采集血液樣本1mL,立即將血樣滴加至血斑卡中心黑色圓圈內(nèi),完全覆蓋但不能超卡片;放置桌面自然晾干(約12h)。供體牛飼養(yǎng)確認(rèn)供體牛后,宜單獨(dú)分群飼養(yǎng)。牧場(chǎng)實(shí)施常規(guī)管理,日糧配方平衡全面,保持合適體況,環(huán)境清潔安靜,飼養(yǎng)密度合理,運(yùn)動(dòng)適量。應(yīng)建立和實(shí)施完善的防疫、生物安全制度,保證牛群無中毒風(fēng)險(xiǎn)。卵巢刺激前評(píng)估卵巢刺激程序前1天,應(yīng)評(píng)估供體牛是否適合卵巢刺激和OPU操作。臨床檢查。檢查供體牛體溫、精神狀態(tài)、采食情況、瘤胃充盈度和糞便等情況,應(yīng)重點(diǎn)檢查是否發(fā)生乳房炎、子宮炎、肺炎和腹瀉等炎性疾病。能量平衡狀態(tài)檢查。檢查供體牛近1周產(chǎn)奶量、評(píng)估近1天采食狀況,卵巢刺激前1天,采集血液樣本,檢測(cè)血糖和血β羥基丁酸水平。其中血糖值應(yīng)為2.8mmol/L~4.5mmol/L,血β羥基丁酸應(yīng)<1.2mmol/L。溫順度評(píng)估。用牛毛刷評(píng)價(jià)供體牛溫順度:待奶牛處于頸夾時(shí),用專用毛刷刺激其頸部、背部和尾根部,根據(jù)牛只反應(yīng)評(píng)分:1分,奶牛無明顯反應(yīng);2分,奶牛輕微不安,躲避毛刷,但無攻擊性;3分,奶牛明顯不安,且表現(xiàn)攻擊性。供體牛應(yīng)性格溫順,易接近、易驅(qū)趕,對(duì)操作人員無明顯攻擊性,對(duì)注射操作無過激反應(yīng)。應(yīng)優(yōu)先選擇評(píng)分為1分的奶牛,慎重選擇評(píng)分為2分的奶牛,盡量不選擇評(píng)分為3分的奶牛。卵巢刺激消除卵泡程序啟動(dòng)時(shí)間。OPU供體牛篩選評(píng)估合格后,無需觀察或確定發(fā)情周期,選定任意一天即可啟動(dòng)卵巢刺激程序。宜在下午啟動(dòng),減少夜間注射FSH次數(shù)并將采卵時(shí)間安排在上午。供體牛保定。供體牛實(shí)施頸夾保定。供體牛麻醉。一般情況不需麻醉。如供體牛煩躁不安、左右搖擺、直腸緊繃或努責(zé),可于尾椎和薦椎結(jié)合處或第一和第二尾椎結(jié)合處注射2.5mL2%鹽酸利多卡因?qū)嵤┯材ね馇宦樽?。儀器準(zhǔn)備。按照儀器操作說明,將硅膠管一端緊密連接一次性采卵針,保持采卵針頭無菌置入OPU專用陰道探頭針槽中,另一端連接負(fù)壓泵或一次性50mL注射器。負(fù)壓泵的負(fù)壓值應(yīng)為60mmHg~110mmHg(或流速為20mL/min~30mL/min)。供體牛清潔消毒。刺激排糞或掏盡供體牛積糞,用0.1%新潔爾滅仔細(xì)清洗供體牛會(huì)陰處和外陰,并使用75%酒精消毒。超聲檢查。將連接好的OPU超聲診斷儀陰道探頭插入供體牛陰道,一手固定保持位置,另一手佩戴長臂手套伸入供體牛直腸,通過直腸把握卵巢,動(dòng)作輕柔、雙手配合將卵巢間隔陰道穹隆貼于超聲探頭上。顯示器屏幕能清晰顯示卵巢狀態(tài)時(shí),記錄卵巢狀態(tài):有無黃體及其大小,2mm~5mm的卵泡數(shù)量,5mm以上的卵泡數(shù)量及卵巢囊腫或粘連等異常情況。采取同樣方式檢查并記錄另一側(cè)卵巢。抽吸消除卵泡。由專業(yè)人員參照顯示影像引導(dǎo)線,控制一次性采卵針刺入卵巢,抽吸全部>5mm卵泡,應(yīng)抽盡并避免出血,抽吸的卵泡液可棄掉,每頭供體牛抽取5mm以上卵泡不超過5個(gè)。儀器清洗。對(duì)下一頭供體牛操作前,應(yīng)用0.1%新潔爾滅清洗陰道探頭,更換一次性采卵針,避免交叉感染。溶解黃體消除卵泡24h后,對(duì)存在黃體的供體牛肌肉注射單劑量PGF2α。以商品諦諾為例,注射5mL。無黃體的供體牛,省略此步驟。FSH刺激消除卵泡36h后,根據(jù)藥物說明書溶解或直接肌肉注射第1針FSH(注射劑量為167國際單位),隨后每間隔12h注射167國際單位FSH一次,共注射三次,總劑量500國際單位。選擇性放置孕酮陰道栓第1針FSH注射后,可選擇性放置孕酮陰道栓直至OPU前取出?;衅诘?針FSH注射完成后,不做任何處理,24h后實(shí)施OPU。程序總覽供體牛卵巢刺激程序共應(yīng)操作4~5次,總時(shí)長84h(3.5d),操作時(shí)間誤差不超過±1h。保證OPU時(shí)可采集卵泡超過25個(gè),且適宜大小卵泡(5mm~8mm)占比75%以上,可用卵母細(xì)胞(A級(jí)、B級(jí)和C級(jí)卵母細(xì)胞)占比90%以上。供體牛卵巢刺激程序卵巢刺激程序?qū)嵤┖笮Ч鸒PU操作供體牛保定將供體牛無應(yīng)激趕至牛活體采卵室,用六柱欄保定架牢固保定,設(shè)置好防踢鏈子。供體牛麻醉應(yīng)先掏去直腸內(nèi)積糞,再于尾椎和薦椎結(jié)合處或第一和第二尾椎結(jié)合處注射5mL2%鹽酸利多卡因做硬膜外腔麻醉。儀器準(zhǔn)備按照操作說明連接獸用OPU超聲診斷儀。將硅膠管一端緊密連接一次性采卵針(17G×600mm長針或18G短針)并保持針頭無菌,置入OPU專用陰道探頭的針槽中。另一端通過采卵收集管(50mL離心管)連接負(fù)壓泵,采卵收集管內(nèi)提前加入5mL左右預(yù)熱好的卵母細(xì)胞保存液,負(fù)壓值設(shè)置為60mmHg~110mmHg(或流速為20mL/min~30mL/min),恒溫箱溫度設(shè)定為38℃±1℃。牛清潔消毒用0.1%新潔爾滅仔細(xì)清洗供體牛會(huì)陰處和外陰,并使用75%酒精消毒。OPU操作將連接好的獸用OPU超聲診斷儀陰道探頭插入供體奶牛陰道內(nèi),一手固定保持位置,另一手佩戴長臂手套伸入供體奶牛直腸,通過直腸把握卵巢,應(yīng)動(dòng)作輕柔、雙手配合將卵巢間隔陰道穹隆貼于超聲探頭上,顯示器能清晰顯示卵巢狀態(tài)時(shí),調(diào)整探頭與卵巢的相對(duì)位置,選擇清晰可見的卵泡(大于2mm),推進(jìn)采卵針,刺破卵泡壁時(shí)用開關(guān)控制負(fù)壓泵抽吸卵泡內(nèi)容物至收集管中,記錄穿刺卵泡數(shù)量。采用同樣方法對(duì)另一側(cè)卵巢進(jìn)行采集。沖洗管道待所有清晰可見的卵泡均被穿刺后,用采卵液沖洗采卵針和導(dǎo)管,連同沖洗液一同置于收集管中;迅速運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。操作過程應(yīng)保證溫度恒定。卵母細(xì)胞分級(jí)鑒定沖洗過濾使用20mL注射器將采集到的卵泡液緩慢加入集卵杯上方濾網(wǎng)中,蓋上蓋子傾斜過濾,隨后用38.5℃預(yù)熱的卵母細(xì)胞洗滌液潤洗收集管的管壁、蓋子和集卵杯蓋2~3次。多次用卵母細(xì)胞洗滌液緩慢沖洗集卵杯濾網(wǎng)四周直至采卵液清亮。卵母細(xì)胞收集在體視顯微鏡下,用檢胚管檢出卵丘顆粒細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合物(COCs)。檢出時(shí)應(yīng)盡量少攜帶液體,降低污染。洗卵檢出的COCs放入不同hepes中潤洗3~5次;在OM洗液中潤洗3~5次;在體外成熟液中潤洗1次后移到IVM卵滴中,置于三

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