8發(fā)酵工藝控制1

8.發(fā)酵工藝控制8.1微生物發(fā)酵類型

1.

依據(jù)投料方式:分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵；

2.依據(jù)是否需氧：好氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵。

一、分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵1、分批發(fā)酵：指一次性投入料液，接種后在發(fā)酵過(guò)程中不再補(bǔ)入料液，一直到放罐的發(fā)酵方式。特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，周期短，染菌幾率小，在生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)品質(zhì)量容易掌握。缺點(diǎn)：不適于測(cè)定過(guò)程動(dòng)力學(xué)，對(duì)基質(zhì)濃度敏感的微生物，產(chǎn)率比較低。2、補(bǔ)料分批發(fā)酵:也稱為補(bǔ)料分批培養(yǎng)(fed-batchcultureFBC)是指在分批培養(yǎng)過(guò)程中間歇或連續(xù)的補(bǔ)加一種或多種成分的新鮮料液的培養(yǎng)方法，又稱為半連續(xù)發(fā)酵。補(bǔ)入時(shí)間：一般在生長(zhǎng)期后，以維持生產(chǎn)期的穩(wěn)定。

補(bǔ)料方式很多：連續(xù)流加、不連續(xù)流加、多周期流加等。優(yōu)點(diǎn)：（1）解除了底物抑制、分解產(chǎn)物阻遏和產(chǎn)物反饋抑制。（2）可以避免在分批發(fā)酵中一次性投料過(guò)多，造成菌體大量生長(zhǎng)和溶氧不足，降低發(fā)酵液的粘度。（3）使發(fā)酵過(guò)程最佳化。

3.連續(xù)發(fā)酵連續(xù)培養(yǎng)就是進(jìn)入產(chǎn)物合成期后，開始以恒定的流速向發(fā)酵關(guān)內(nèi)流加培養(yǎng)基，同時(shí)以相同的速度放出培養(yǎng)液，使發(fā)酵罐內(nèi)的體積、菌體濃度、產(chǎn)物濃度保持恒定。特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)率高、生產(chǎn)穩(wěn)定，便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制。缺點(diǎn)：增加染菌幾率，易造成菌種的退化。8.2發(fā)酵過(guò)程的代謝變化一、初級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵的代謝變化發(fā)酵過(guò)程中菌體的生長(zhǎng)過(guò)程表現(xiàn)出：延遲期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、靜止期和死亡期等生長(zhǎng)使特征。沒(méi)有明顯的產(chǎn)物合成期。二、次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵的代謝變化發(fā)酵過(guò)程中的代謝變化一般分為：菌體生長(zhǎng)期、產(chǎn)物合成期、菌體自溶期。

1、菌體生長(zhǎng)階段主要的代謝活動(dòng)為：碳源和氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解代謝和菌體生長(zhǎng)的合成代謝。2、產(chǎn)物合成階段主要的代謝主要是：碳源和氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解代謝和產(chǎn)物的合成代謝。3、菌體自溶階段菌體衰老，細(xì)胞開始自溶，氨氮含量增加，pH上升。8.3參數(shù)及檢測(cè)1.參數(shù)常規(guī)的控制參數(shù)有：罐溫、pH、溶氧、攪拌轉(zhuǎn)數(shù)、空氣流量、罐壓、液位、基質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度等。2.檢測(cè)方法

在線檢測(cè)：溫度、pH、溶氧、攪拌、壓力等。離位檢測(cè)：基質(zhì)濃度（殘?zhí)菨舛龋?、產(chǎn)物濃度、菌體濃度等。8.4營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的影響及控制一、營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)種類的影響及控制1.碳源碳源種類的影響：速效碳源有利于菌體的快速生長(zhǎng)，但其分解產(chǎn)物有明顯的阻遏作用；緩慢利用的碳源有利于延長(zhǎng)代謝產(chǎn)物的合成。碳源濃度的影響：碳源豐富易造成繁殖過(guò)剩，對(duì)產(chǎn)物合成及氧的傳遞造成不良的影響。在工業(yè)上的控制，一般采用二者混合使用，并控制一定的濃度，在發(fā)酵過(guò)程中采用補(bǔ)料分批發(fā)酵的方法。2.氮源影響：同樣包括種類和濃度的影響。工業(yè)生產(chǎn)中采用的措施：1）混合使用2）在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)加氮源。3.磷酸鹽

在工業(yè)生產(chǎn)中，通過(guò)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中控制磷酸鹽的亞適量，來(lái)減少磷酸鹽的抑制作用。二、基質(zhì)濃度對(duì)發(fā)酵的影響及控制1.影響：基質(zhì)濃度過(guò)低，不能滿足菌體生長(zhǎng)的需求；基質(zhì)濃度過(guò)豐富，也會(huì)影響菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。2.控制：一般根據(jù)菌種的特性，通過(guò)補(bǔ)料維持在菌體半饑餓狀態(tài)。8.5種子質(zhì)量的影響及控制1.接種菌齡影響：年輕的種子，到發(fā)酵罐后生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，發(fā)酵周期延長(zhǎng)；過(guò)老的種子，長(zhǎng)表現(xiàn)過(guò)早衰老?？刂疲嚎刂圃诰w濃度接近高峰時(shí)移種，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期。2.接種量影響：接種量少遲滯期延長(zhǎng)；過(guò)大會(huì)造成溶氧不足，影響菌絲和產(chǎn)物的合成。控制：根據(jù)菌種的生長(zhǎng)繁殖速度及對(duì)溶氧的要求確定接種量。8.6溫度的影響和控制一、影響1、溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響;2、溫度對(duì)產(chǎn)物合成的影響;3、溫度對(duì)產(chǎn)物合成方向的影響；4、溫度對(duì)發(fā)酵液物理性質(zhì)及氧的溶解度、傳遞的影響。二、影響發(fā)酵溫度的因素發(fā)酵熱是引起溫度變化的主要因素。發(fā)酵熱：即發(fā)酵過(guò)程中釋放出的凈熱量單位J/(m3.h)，用Q發(fā)酵表示。

Q發(fā)酵=Q生物+Q攪拌-Q蒸發(fā)-Q顯熱-Q輻射

種子罐熱交換系統(tǒng)多用于加熱，發(fā)酵罐多用于冷卻。三、最適溫度的選擇和發(fā)酵溫度的控制

選擇最適溫度應(yīng)考慮兩個(gè)方面：微生物的最適生長(zhǎng)溫度和產(chǎn)物合成的最適溫度?？刂疲阂话悴扇∽儨乜刂?，同時(shí)在控制時(shí)注意靈活掌握。如溶氧條件差，補(bǔ)料不及時(shí)，培養(yǎng)基利用緩慢生長(zhǎng)緩慢時(shí)，都要及時(shí)調(diào)整。8.7pH的影響及控制一、影響1、作用胞外弱酸或弱堿成為分子形式，進(jìn)入細(xì)胞后影響胞內(nèi)酶蛋白的解離度和電荷狀態(tài)，改變酶的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成。

2、影響細(xì)胞的形態(tài)；3、對(duì)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生影響。

二、發(fā)酵過(guò)程中pH變化規(guī)律

1）大多數(shù)微生物生長(zhǎng)適應(yīng)的pH跨度為3-4的單位，其中最佳生長(zhǎng)的pH跨度為0.5-1個(gè)單位。

2）多數(shù)微生物對(duì)最初的pH有一定的調(diào)節(jié)能力。3）培養(yǎng)溫度高的微生物最適pH也相應(yīng)高些。

4）在生長(zhǎng)初期有pH高峰和pH低谷的變化。

5）微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的pH通常不同。6）pH變化和培養(yǎng)基中生理酸性物質(zhì)和堿性物質(zhì)的比例有關(guān)。三、發(fā)酵pH的選擇選擇最適pH的原則是：即有利于菌體的生長(zhǎng)又最大限度的合成產(chǎn)物。

一般最適pH是根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)確定的。

四、控制方法1、實(shí)驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)配方，使生理酸性物質(zhì)和生理堿性物質(zhì)有合適的配比，使發(fā)酵過(guò)程的pH在合適的范圍內(nèi)。2、在培養(yǎng)基中添加一定濃度的碳酸鈣，以中和發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酸。H++CaCO3——Ca2++H2O+CO2

3、在發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)補(bǔ)加酸、堿或補(bǔ)料的方式來(lái)控制。補(bǔ)料是最常用的方法。通過(guò)流加生理酸性物質(zhì)或堿性物質(zhì)進(jìn)行調(diào)解。如葡萄糖、硫酸銨、氨水等。8.8溶氧的影響及控制一、需氧方面：1、微生物對(duì)氧需求的表示方法微生物的耗氧量用攝氧率和呼吸強(qiáng)度來(lái)表示。1）攝氧率（r）：?jiǎn)挝惑w積培養(yǎng)液每小時(shí)的耗氧量。單位：mmol/L.h。2）呼吸強(qiáng)度（QO2）：?jiǎn)挝恢亓康木w（折干）每小時(shí)消耗氧的量，也稱為氧比消耗速率。單位mmol/g.h。二者之間的關(guān)系：r=QO2.XX:發(fā)酵液中菌絲的濃度，g/L。2、影響微生物需氧量的因素1）培養(yǎng)基中的溶解氧濃度

因此，只有溶解氧達(dá)到臨界氧濃度時(shí)，才能滿足微生物對(duì)氧的需求。2）微生物的種類和生長(zhǎng)階段。3）培養(yǎng)基的組成：碳源的種類和濃度影響尤為顯著。4）培養(yǎng)條件：溫度。5）二氧化碳的濃度。二、供氧方面（一）氧在液體中的溶解特性1）溫度:溫度越高，氧的溶解度就越低。2）溶液的性質(zhì):溶質(zhì)含量越高，氧的溶解度就越低。3）氧分壓：氧分壓越高，氧的溶解度就越高。（二）氧在溶液中的傳遞1、氧傳遞的阻力

氧的傳遞的阻力：氣泡—?dú)庖航缑妗耗ぁ合唷耗ぁ桃航缑妗?xì)胞團(tuán)—細(xì)胞膜—細(xì)胞內(nèi)

傳遞過(guò)程中的總推動(dòng)力是氣相與細(xì)胞內(nèi)的氧分壓差和濃度差。2、氧的傳遞方程式N=KLa

.(C*-CL)

N氧的傳遞速率mmol/L.hC*溶液中溶氧的飽和濃度mmol/LCL溶液中的溶氧濃度mmol/L

KL以濃度差為推動(dòng)力的氧傳質(zhì)系數(shù)m/h

a比表面積，因?yàn)楹茈y測(cè)定，所以將KLa

當(dāng)成一項(xiàng)，稱為容積傳遞系數(shù)s-1。（三）影響供氧的因素N=KLa

.(C*-CL)

1、影響氧傳遞推動(dòng)力的因素(C*-CL)

是氧傳遞的推動(dòng)力，因此只有提高C*，降低CL。但不符合生產(chǎn)現(xiàn)狀或要求。2、影響KLa

的因素經(jīng)生產(chǎn)實(shí)踐證明，影響KLa

的主要因素有攪拌、空氣流量、發(fā)酵液的理化性質(zhì)等。可用下列經(jīng)驗(yàn)式表示它們之間的關(guān)系：KLa=K〔(P/V)α·(υs)β·(ηapp)-ω〕P/V發(fā)酵罐攪拌功率kW/m3υs罐體垂直方向的空氣直線速度m/hηapp發(fā)酵液的表觀粘度Pa·

sK經(jīng)驗(yàn)常數(shù)αβ–ω

經(jīng)驗(yàn)常數(shù)，與攪拌器、空氣分布器的形狀等有關(guān)，一般通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)側(cè)得α值在0.75～1.0，β在0.4～0.72，

1）攪拌功率的影響：攪拌功率越大，KLa越大。其中α與攪拌器的形狀有關(guān)。攪拌的作用：將空氣打碎成小氣泡，增加氣-液接觸界面，提高氧的傳遞速率；同時(shí)使發(fā)酵液充分混合，液體中的固形物質(zhì)保持懸浮狀態(tài)。形狀：在攪拌器的中央裝有圓盤，在圓盤上裝上攪拌葉，攪拌葉有平葉式、彎葉式、箭葉式。

擋板：為了克服攪拌器運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生的渦流,將徑向流動(dòng)改變?yōu)檩S向流動(dòng),促使液體的激烈翻動(dòng)。2）空氣流速的影響：在一定范圍內(nèi)，隨著流速的增加，KLa增加。但流速過(guò)大，引起氣泛現(xiàn)象。而且實(shí)驗(yàn)證明攪拌功率的影響遠(yuǎn)大于空氣流速的影響。因此，優(yōu)先考慮攪拌功率。3）發(fā)酵液理化性質(zhì)的影響：發(fā)酵液的粘度越大，越小。4）泡沫的影響：影響氣液混合，降低容積氧傳遞系數(shù)。5）空氣分布器和發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)的影響：使空氣充分分散的空氣分布器有利于溶氧的增加。發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)包括罐的高徑比是否合適、是否達(dá)到全擋板條件等?？諝夥植计饔袉喂苁絺€(gè)和環(huán)管式，目的使空氣均勻分布。全擋板條件是指在一定轉(zhuǎn)速下，隨著罐內(nèi)擋板的增加，攪拌軸功率不在增加時(shí)的擋板數(shù)。三、發(fā)酵過(guò)程的溶氧變化和溶氧濃度的控制1、發(fā)酵過(guò)程溶氧的變化2、溶氧濃度的控制

應(yīng)從供氧和需氧兩個(gè)方面考慮。在供氧方面：攪拌、空氣流速、空氣分布器和發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)影響KLa

，但這些參數(shù)在一定的條件下，很難再優(yōu)化。所以在發(fā)酵液理化性質(zhì)和需氧方面進(jìn)行控制,使需氧量不超過(guò)設(shè)備的供氧能力。采取的措施：控制菌體的比生長(zhǎng)速率，使其保持在比臨界菌體濃度略高一點(diǎn)的水平，達(dá)到適和濃度。在工業(yè)上，還可通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度、液化培養(yǎng)基、中間補(bǔ)水，改善溶氧水平。8.9二氧化碳的影響及控制一、二氧化碳對(duì)發(fā)酵的影響1、發(fā)酵液中的二氧化碳對(duì)微生物的生長(zhǎng)速度具有刺激或抑制作用。1）刺激作用：稱之為CO2效應(yīng)。環(huán)狀芽孢桿菌、大腸桿菌和鏈孢霉的突變株需30%的濃度。2）抑制作用：酵母菌，青霉素菌絲形態(tài)隨著CO2的增加形態(tài)發(fā)生改變，如青霉菌由絲狀變?yōu)榍驙罨蚪湍笭罴?xì)胞。2、對(duì)產(chǎn)物合成產(chǎn)生影響刺激作用：牛鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)生多糖需5%的CO2，精氨酸發(fā)酵等。抑制作用：對(duì)抗生素發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用。

3、對(duì)發(fā)酵液pH的影響。二、二氧化碳的控制二氧化碳在發(fā)酵液中的濃度受到許多因素的影響，如菌體的呼吸強(qiáng)度、發(fā)酵液的特性、通氣攪拌和罐力等?？刂圃瓌t：根據(jù)對(duì)發(fā)酵的影響情況而定。通氣攪拌的大小可以調(diào)節(jié)二氧化碳的濃度。

8.10補(bǔ)料對(duì)發(fā)酵的影響一、分批補(bǔ)料的作用1.可以控制抑制性底物的濃度2.可以解除或減弱分解產(chǎn)物阻遏3.可以使發(fā)酵過(guò)程最佳化。二、補(bǔ)料的方法和速率的確定1.方法：一次性大量補(bǔ)入；少量多次；連續(xù)流加。目前采用的是連續(xù)流加。2.速率的確定：根據(jù)微生物對(duì)養(yǎng)分的消耗及所設(shè)定的發(fā)酵液中最低維持濃度而定。三、補(bǔ)料的依據(jù)和判斷

根據(jù)：最常用的是殘?zhí)菨舛?、溶氧濃度和pH。

三者之間的關(guān)系：糖的濃度大，代謝加快，溶氧濃度降低；糖的濃度降低，利用氮源中提供能量，造成氨基積累，pH升高。

1.通過(guò)控制補(bǔ)料控制溶氧不低于臨界值，將生長(zhǎng)速率控制在中等水平，可以提高大腸桿菌的細(xì)胞密度和產(chǎn)物產(chǎn)率的提高。2.谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中，攝氧率和基質(zhì)消耗成線性關(guān)系，因此可以通過(guò)控制攝氧率控制補(bǔ)料速度。3.在青霉素發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)控制補(bǔ)料使菌體處于半饑餓狀態(tài)，保證溶氧，提高青霉素的產(chǎn)量。

8.11泡沫的影響及控制一、泡沫對(duì)發(fā)酵的影響發(fā)酵液中存在一定的泡沫可以增加氣液的接觸面積，增加氧的傳遞。但大量的泡沫會(huì)對(duì)發(fā)酵帶來(lái)很多不利的影響。1、泡沫過(guò)多造成“逃液”現(xiàn)象，給生產(chǎn)帶來(lái)?yè)p失。2、減少發(fā)酵罐的裝料系數(shù)，影響收率。3、泡沫升至罐頂，增加染菌的幾率。4、消沫劑的加入對(duì)提取帶來(lái)困難。二、泡沫產(chǎn)生的原因及類型1、產(chǎn)生的原因：

1）通氣和攪拌，攪拌比通氣引起泡沫的要大。

2）代謝產(chǎn)生的氣體的逸出，和生長(zhǎng)階段有關(guān)。

3）培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物等表面活性物質(zhì)的存在是產(chǎn)生泡沫的主要因素，糖增加了泡沫的穩(wěn)定性。

4）滅菌溫度高、冷卻時(shí)間長(zhǎng)都會(huì)使泡沫增加。2、泡沫的類型：1）機(jī)械性泡沫：存在于發(fā)酵液的液面上，氣項(xiàng)所占比例較大，與液面有較明顯的界限。如發(fā)酵前期的泡沫。2）流態(tài)泡沫：分散在發(fā)酵液中，比較穩(wěn)定，與液面之間無(wú)明顯的界限。四、泡沫的控制1、機(jī)械消沫物理消沫的方法，利用機(jī)械強(qiáng)烈的振動(dòng)或壓力改變而使泡沫破裂。罐內(nèi)消沫：利用罐內(nèi)的消沫槳罐外消沫：將泡沫引到罐外，通過(guò)噴嘴的加速作用或離心力消除泡沫。但消沫效果不理想，對(duì)流態(tài)泡沫幾乎不起作用。僅作為消沫的輔助作用。

2、消沫劑消沫1）消沫劑的作用：降低泡沫的液膜的機(jī)械強(qiáng)度，或者降低液泡膜的表面張力。2）消沫劑的選擇a、消沫劑要有一定的親水性，保證在氣-液界面上有一定的鋪展性；

b、在低濃度時(shí)具有消泡活性；

c、具有持久的消泡或抑泡能力；

d、對(duì)微生物、人、動(dòng)物無(wú)毒；

e、對(duì)產(chǎn)物提取不產(chǎn)生影響

f、對(duì)氧傳遞不產(chǎn)生影響；

g、成本低且耐高溫。3）常用的消沫劑天然油脂，高碳醇、脂肪酸、酯類，聚醚類和硅酮類四大類。天然油脂：豆油、玉米油、棉籽油、菜籽油和動(dòng)物油等。消沫能力差，用量大。只用在種子罐。

聚醚類：應(yīng)用較多的是聚氧丙烯甘油（GP，抑泡劑）和聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE，消泡劑），它們以一定的比例混合的消沫劑又稱為泡敵。它們的用量小為0.03%-0.035%，消泡效果是天然油脂的10倍。

抑泡劑GP親水性較差，作用時(shí)間較短，常在配培養(yǎng)基時(shí)加入，起到抑制泡沫產(chǎn)生；消泡劑GPE親水性好，作用時(shí)間長(zhǎng)，在發(fā)酵過(guò)程中加入。8.12發(fā)酵終點(diǎn)的判斷

一、發(fā)酵終點(diǎn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)：

1.經(jīng)濟(jì)因素2.對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響3.特殊情況：染菌二、確定放罐指標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量、過(guò)濾速度。

三、放罐工藝控制補(bǔ)料、通氨加消沫劑都為在不影響產(chǎn)物合成的情況下，節(jié)約控制。8.13發(fā)酵染菌的防治和處理染菌：指的是在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中侵入了有礙生產(chǎn)的其他微生物。無(wú)菌檢查主要針對(duì)菌種制備、種子罐、發(fā)酵罐滅菌后和接種培養(yǎng)過(guò)程中。一、細(xì)菌的無(wú)菌檢查1.方法1）肉湯培養(yǎng)法取樣后，放置培養(yǎng)，每6小時(shí)觀察一次。2）平板劃線法3）顯微觀察法沙黃染色進(jìn)行顯微鏡觀察。生產(chǎn)上一般2-3種方法結(jié)合起來(lái)進(jìn)行無(wú)菌檢查。2.取樣間隔：種子罐每4小時(shí)取一次樣，發(fā)酵罐每8小時(shí)取一次樣，培養(yǎng)時(shí)間在8-12小時(shí)后才能做出判定。3.染菌判斷連續(xù)三個(gè)時(shí)間的樣發(fā)生變化，顯微鏡觀察又是同一種菌時(shí)，才能判定是染菌。

二、噬菌體的檢測(cè)噬菌體一般在生產(chǎn)出現(xiàn)異常時(shí)，例如突然轉(zhuǎn)稀、糖消耗明顯減少，產(chǎn)物合成停止，顯微鏡觀察菌絲減少，菌絲自溶。方法：雙層平板瓊脂法。三、染菌的處理1、種