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文檔簡介
Q/LB.□XXXXX-XXXX目次TOC\o"1-1"\h\t"標(biāo)準(zhǔn)文件_一級條標(biāo)題,2,標(biāo)準(zhǔn)文件_附錄一級條標(biāo)題,2,"前言 II引言 III1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14實(shí)驗(yàn)原理 15試劑和耗材 16儀器設(shè)備 27試驗(yàn)方法 2附錄A(資料性)類器官生長速率檢測 6附錄B(資料性)類器官標(biāo)志物表達(dá)水平檢測 7前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。為指導(dǎo)開展類器官(腦、心、肺、腸、肝)在化學(xué)品毒性測試中的應(yīng)用,特制定本標(biāo)準(zhǔn)。本文件由南京醫(yī)科大學(xué)提出。本文件由江蘇省衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位:南京醫(yī)科大學(xué)、同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院、東南大學(xué)、生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所、蘇州疾病預(yù)防控制中心、南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院。本文件主要起草人:顧愛華、徐進(jìn)、劉倩、蔣兆彥、楊楊、張娟、吉貴祥、邵文濤、趙鵬、胡佳、金經(jīng)、郭文慧、顧杰。引言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件主要描述了類器官在化學(xué)品毒性測試中的應(yīng)用技術(shù)規(guī)范,包括腦、心、肺、腸、肝類器官的構(gòu)建和毒性評價(jià)方法。類器官在化學(xué)品毒性測試中的應(yīng)用技術(shù)規(guī)范范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了類器官(腦、心、肺、腸、肝)在化學(xué)品毒性測試中的應(yīng)用技術(shù)規(guī)范。本標(biāo)準(zhǔn)適用于開展各類化學(xué)品對相應(yīng)組織器官來源的類器官的毒性測試。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。
類器官organoid由干細(xì)胞或前體細(xì)胞體外培養(yǎng)形成,由組織器官特異性的多種細(xì)胞組成,具有特定組織器官關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和功能特性的三維細(xì)胞培養(yǎng)物。
毒性測試toxicitytesting給受試物進(jìn)行不同途徑、不同時(shí)間的染毒,檢測各種毒性終點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)原理通過構(gòu)建腦、心、肺、腸、肝類器官,檢測化學(xué)品處理下,類器官各指標(biāo)的變化情況,以反映化學(xué)品相應(yīng)靶器官毒性大小。試劑和耗材試驗(yàn)中所用的試劑,在沒有注明其他要求時(shí),均指分析純試劑;所使用的水,在未說明規(guī)格時(shí),應(yīng)符合GB/T6682中純水的規(guī)定。試劑和耗材宜包括但不限于:DMEM/F12培養(yǎng)基、PGM1多能干細(xì)胞培養(yǎng)基、Essential6?培養(yǎng)基、Neurobasal?-A培養(yǎng)基、小鼠肺類器官培養(yǎng)基、小鼠腸類器官培養(yǎng)基、小鼠肝類器官培養(yǎng)基、TeSR?E8?培養(yǎng)基、B27培養(yǎng)基;Matrigel基質(zhì)膠;Accutase消化液、EDTA溶液;胎牛血清(FBS);細(xì)胞篩(30μm、70μm、100μm);青霉素、鏈霉素、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、B?27添加劑(不含維生素A)、成纖維細(xì)胞生長因子2(FibroblastGrowthFactor2,F(xiàn)GF2)、激活素A(ActivinA)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)、6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈(CHIR?99021)、表皮生長因子(EGF)、中性蛋白酶(Dispase)、IV型膠原酶、ROCK抑制劑(Y-27632)、肝素、成纖維細(xì)胞生長因子9(FGF9)、4-[4-(1,3-苯并二氧雜環(huán)戊醇-5-基)-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺(SB431542)、dorsomorphin、XAV-939、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(GlutaMAX)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)、Wnt-C59;磷酸鹽緩沖液(PBS)、紅細(xì)胞裂解液、DNA酶溶液;T25培養(yǎng)瓶(poly-HEMA包被)、Elplasia96孔板、低粘附孔板、細(xì)胞培養(yǎng)皿、transwell小室。儀器設(shè)備儀器設(shè)備至少應(yīng)包括:生物安全柜;激光共聚焦顯微鏡;離心機(jī);細(xì)胞培養(yǎng)箱;低速圓周搖床;倒置顯微鏡;移液槍;無菌細(xì)胞培養(yǎng)皿;多功能酶標(biāo)儀;醫(yī)用冰箱。試驗(yàn)方法類器官構(gòu)建腦類器官構(gòu)建腦類器官宜采用人胚胎干細(xì)胞H9構(gòu)建,培養(yǎng)于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中,通過定向分化為背側(cè)前腦類器官。當(dāng)H9干細(xì)胞生長匯合度約80%~90%后,用0.5mMEDTA溶液消化為單細(xì)胞,用含有10μMY27632的PGM1多能干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸。將300μL共含有75萬個(gè)細(xì)胞的懸液轉(zhuǎn)移至Elplasia96孔板中(Elplasia96孔板需提前加入含有10μMY27632的PGM1多能干細(xì)胞培養(yǎng)基以500g×3min進(jìn)行離心浸潤,排除微孔底部的空氣)。將孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6~12h后,觀察到干細(xì)胞形成邊緣光滑的球體后,轉(zhuǎn)移到低粘附的6孔板中。Day0~6背側(cè)前腦類器官形成:將培養(yǎng)基替換為預(yù)熱的Essential6?培養(yǎng)基(10μMSB431542、2.5μMdorsomorphin、2.5μMXAV-939、1%青霉素/鏈霉素),每孔2mL液體,前兩天維持穩(wěn)定不更換培養(yǎng)基,后面每天換液。D6~25背側(cè)前腦類器官擴(kuò)增:將培養(yǎng)基替換為預(yù)熱的Neurobasal?-A培養(yǎng)基(含1%100×GlutaMAX、2%50×B27、1%青霉素/鏈霉素、20ng/mLEGF、20ng/mLFGF2),每孔2mL液體,前10天每天更換培養(yǎng)基液,后面九天隔天更換培養(yǎng)基。D25~D43背側(cè)前腦類器官分化:將培養(yǎng)基替換為預(yù)熱的Neurobasal?-A培養(yǎng)基(含1%100×GlutaMAX、2%50×B27、1%青霉素/鏈霉素、20ng/mLBDNF、20ng/mLNT3),每孔2mL液體,隔天換液。D44~:背側(cè)前腦類器官維持:將培養(yǎng)基替換為預(yù)熱的Neurobasal?-A培養(yǎng)基(含1%100×GlutaMAX、2%50×B27、1%青霉素/鏈霉素),每孔2mL液體,3~4天換液。心臟類器官構(gòu)建心臟類器官宜采用人胚胎干細(xì)胞H9構(gòu)建,培養(yǎng)于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中。使用Accutase消化液將H9細(xì)胞解離成單細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù),并用含有10μMY27632的TeSR?E8?培養(yǎng)基重懸,然后以10000細(xì)胞/孔的量,將細(xì)胞接種到低吸附處理的96孔板中,300g離心4min。24h后(記為Day-1),更換不含Y27632的TeSR?E8?培養(yǎng)基24小時(shí)。Day0使用含有1ng/mLActivinA、1.25ng/mLBMP-4、4μMCHIR-99021的B27培養(yǎng)基(不含胰島素)處理24h。Day1更換B27培養(yǎng)基(不含胰島素)24h。Day2利用含有2μMWnt-C59的B27培養(yǎng)基(不含胰島素)培養(yǎng)2d。Day4更換B27培養(yǎng)基(不含胰島素)繼續(xù)培養(yǎng)2d。Day6更換B27培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。Day7用2μMCHIR-99021的B27培養(yǎng)基處理1小時(shí);之后每2d更換一次B27培養(yǎng)基,直到Day16培養(yǎng)結(jié)束。肺類器官構(gòu)建肺類器官宜采用小鼠肺組織構(gòu)建,置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將小鼠用75%酒精徹底消毒皮膚,無菌分離肺組織并置于預(yù)冷的無菌PBS溶液中漂洗,清除結(jié)締組織及肺內(nèi)主支氣管,分離肺葉,清洗2次~3次去血。無菌鑷子轉(zhuǎn)移清洗后的肺葉于新的培養(yǎng)皿中,吸除殘留的PBS,用眼科手術(shù)剪將肺組織均勻剪成約1mm3的組織塊,轉(zhuǎn)移至預(yù)熱的膠原酶消化溶液中,37℃恒溫?fù)u床(100轉(zhuǎn)r/min)消化45min~60min。加入等量的含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化,吹打混勻后,使用100μm細(xì)胞篩過濾;過濾液4℃300g離心5min,棄上清。加入3mL紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞沉淀,室溫孵育1min~2min,加入6mLDMEM/F12培養(yǎng)基混勻,4℃300g離心5min,棄上清;重復(fù)上述步驟2次,直至細(xì)胞沉淀變白。加入4mLDNA酶溶液(20U/mL)重懸細(xì)胞沉淀,室溫手搖3min~5min;加入6mLDMEM/F12培養(yǎng)基混勻,4℃300g離心5min,棄上清。按照2×107/mL細(xì)胞數(shù)量重懸于40μLMatrigel基質(zhì)膠中,并接種至24孔板中央。待Matrigel基質(zhì)膠凝固后,加入600μL小鼠肺類器官培養(yǎng)基,每隔2d天更換培養(yǎng)基,第14d即得到肺類器官。腸類器官構(gòu)建腸類器官宜采用小鼠腸組織構(gòu)建,置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在靠近小鼠胃的一端取長度約20cm小腸,去除腸道絨毛、血管和脂肪。將腸段縱向切開,用預(yù)冷的PBS輕輕洗滌腸道,直至清洗干凈。將腸組織剪成2mm片段,用預(yù)冷的PBS反復(fù)沖洗,直至上清液澄清。除去上清液,將組織碎片重懸于4mL含有5mMEDTAPBS中。用槍頭吹打、重懸含有消化液的組織碎片,使組織反復(fù)穿過移液管以產(chǎn)生機(jī)械剪切力,從而使腸隱窩與基底層分離。加入4mL小鼠腸類器官培養(yǎng)基終止消化。用100μm細(xì)胞篩過濾組織懸液,過濾液4℃300g離心5min,棄上清。顯微鏡下計(jì)數(shù)腸隱窩數(shù)量。按照每10μLMatrigel基質(zhì)膠含200個(gè)~600個(gè)腸隱窩密度,接種至24孔板中。待Matrigel基質(zhì)膠凝固后,加入600μL小鼠腸類器官培養(yǎng)基,每隔2d更換培養(yǎng)基,第7d天即得到腸類器官。肝類器官構(gòu)建肝類器官宜采用小鼠肝組織構(gòu)建,置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取小鼠肝臟,放入預(yù)冷的DMEM/F12培養(yǎng)基中漂洗2次。使用無菌剪刀將肝臟剪碎至1mm3大小,轉(zhuǎn)移至離心管中,靜置2min后,去除上清。放入消化液10mL(Dispase、IV型膠原酶、DMEM/F12培養(yǎng)基,按1:1:6配比),37℃水浴20min。機(jī)械吹打后,靜置1min,去除上清。上述步驟重復(fù)3次,收集上清液,冰上保存。用70μm細(xì)胞篩過濾組織懸液,收集過濾液。用30μm細(xì)胞篩過濾,收集細(xì)胞篩網(wǎng)截留的肝細(xì)胞。按照2×107/mL細(xì)胞數(shù)量重懸于40μLMatrigel基質(zhì)膠中,并接種至24孔板中央。待Matrigel基質(zhì)膠凝固后,加入600μL小鼠肝類器官培養(yǎng)基,每隔2d更換培養(yǎng)基,第14d即得到肝類器官。類器官毒性測試評價(jià)評價(jià)方法采用類器官培養(yǎng)基,將受試化學(xué)品按一定比例(推薦1:4)逐級稀釋,生成具有梯度濃度的稀釋液。小心吸出培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基(不要觸碰膠滴),加入含受試化學(xué)品的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)類器官種類不同,檢測相應(yīng)的指標(biāo),以反映化學(xué)品對類器官毒性的大小。評價(jià)指標(biāo)腦類器官檢測指標(biāo)應(yīng)包括但不限于下列內(nèi)容。a) 類器官生長速率,參考附錄A的方法檢測。b) 參考附錄B的方法,檢測腦類器官標(biāo)志物表達(dá)水平,包括:1) 神經(jīng)元標(biāo)志物,如微管相關(guān)蛋白2(MAP2);2) 膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物,如膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)。心臟類器官檢測指標(biāo)應(yīng)包括但不限于下列內(nèi)容。a) 類器官生長速率,參考附錄A的方法檢測。b) 參考附錄B的方法,檢測心類器官標(biāo)志物表達(dá)水平,包括:1) 肌成纖維細(xì)胞,如鈣調(diào)蛋白(calponin);2) 內(nèi)皮細(xì)胞,如血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(CD31)、VE-鈣粘蛋白(CD144)。肺類器官檢測指標(biāo)應(yīng)包括但不限于下列內(nèi)容。類器官生長速率,參考附錄A的方法檢測。參考附錄B的方法,檢測肺類器官分子標(biāo)志物變化水平,包括:上皮標(biāo)志物,如上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM);增殖標(biāo)志物,如Ki-67;分化標(biāo)志物,如AcetylatedTubulin。腸類器官檢測指標(biāo)應(yīng)包括但不限于下列內(nèi)容。a) 類器官生長速率,參考附錄A的方法檢測。b) 參考附錄B的方法,檢測腸類器官分子標(biāo)志物變化水平,包括:1) 杯狀細(xì)胞,如黏蛋白2(Muc2);2) 潘氏細(xì)胞,如溶菌酶(Lyz);3) 吸收細(xì)胞,如鈣調(diào)肌動(dòng)蛋白(Villin)。肝類器官檢測指標(biāo)應(yīng)包括但不限于下列內(nèi)容。a) 類器官生長速率,參考附錄A的方法檢測。b) 參考附錄B的方法,檢測肝類器官分子標(biāo)志物變化水平,包括:1) 白蛋白(ALB);2) 甲胎蛋白(AFP);3) 細(xì)胞角蛋白19(CK19)。
(資料性)
類器官生長速率檢測儀器設(shè)備儀器設(shè)備包括但不限于:光學(xué)顯微鏡;臺式定軌振蕩器(含加熱功能);多功能酶標(biāo)儀。試劑CCK-8試劑。試驗(yàn)方法試驗(yàn)方法如下:a) 采用光學(xué)顯微鏡,每天拍照記錄類器官大小,計(jì)算類器官平均直徑和面積;b) 采用巴氏管上下吹打,使類器官和Matrigel基質(zhì)膠分離;c) 將培養(yǎng)板放在臺式定軌振蕩器上,以37°C和120rpm的速度孵育30min;d) 吸取100μL懸液轉(zhuǎn)移至96孔板中,每孔加入10μLCCK-8溶液,37℃孵育30min~3h;e) 多功能酶標(biāo)儀(450nm)測定吸光度值,以反映類器官增長速率。
(資料性)
類器官標(biāo)志物表達(dá)水平檢測儀器設(shè)備儀器設(shè)備包括但不限于:NanoDrop微量分光光度計(jì);臺式定軌振蕩器(含加熱功能);實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測儀。試劑試劑包括但不限
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