培養(yǎng)基的配制及質量控制課件

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培養(yǎng)基的配制及質量控制

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一、培養(yǎng)基的配制

培養(yǎng)基是絕大多數微生物試驗的基礎。因此，培養(yǎng)基的質量是微生物試驗成功與否的關鍵因素。適宜的培養(yǎng)基制備方法、貯藏條件和質量控制試驗是提供優(yōu)質培養(yǎng)基的保證。6-培養(yǎng)基4

⑴培養(yǎng)基可按處方制備也可使用按處方生產的符合規(guī)定的商品化成品培養(yǎng)基，脫水培養(yǎng)基除附有處方和使用說明外還應注明有效期、貯存條件、適用性試驗的質控菌株和用途。配制時應按使用說明上的要求操作，受潮結塊不能使用，以確保培養(yǎng)基的質量符合要求。

6-培養(yǎng)基4⑵使用容器

配制培養(yǎng)基使用的容器應是玻璃器皿或搪瓷器皿如搪瓷筒、量筒、漏斗、三角燒瓶、刻度吸管、試管、培養(yǎng)皿等。禁用金屬容器如鐵、銅、鋁容器，避免金屬離子與培養(yǎng)基成分結合，生成有害物質，影響細菌生長。

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⑶使用的器皿應洗凈，用蒸餾水或純化水完全沖洗以消除清潔劑和外來物質的殘留，并進行清除污物的確認后方可使用。若于非潔凈的玻璃器皿中制備，可能導致抑菌物質進入培養(yǎng)基中。抑菌物質可能是殘留的玻璃器皿清潔用的清潔劑或之前玻璃器皿所盛裝的物質。6-培養(yǎng)基4

⑷配制培養(yǎng)基最常用的溶劑是純化水，特殊情況下需要用去離子水和蒸餾水，對熱敏感的培養(yǎng)基應用滅菌水和無菌容器配制與分裝，配制時若需加熱助溶應注意溫度不要過高。6-培養(yǎng)基4

⑸對配制培養(yǎng)基的過程作詳細的記錄，記錄內容包括：配制日期、培養(yǎng)基名稱、成分、配制數量、質量監(jiān)控結果等進行全面詳細記錄。6-培養(yǎng)基4

1、培養(yǎng)基的制備方法

稱量

為保證培養(yǎng)基質量的穩(wěn)定可靠，在配制培養(yǎng)基時，在稱量前要詳細了解處方和使用說明，按照產品說明書的規(guī)定稱量，各稱量物的重量應記錄。各脫水培養(yǎng)基或組成培養(yǎng)基的組分應準確稱量，并要求有一定的精確度。6-培養(yǎng)基4

配制將準確稱量的各組分或脫水培養(yǎng)基加入溶劑中，完全溶解，如需要可適當加熱。所有的培養(yǎng)基對熱都有或多或少的敏感，因此當培養(yǎng)基需要加熱溶解時，應注意不要加熱過度，否則會使培養(yǎng)基顏色變深。配制培養(yǎng)基所用的器具應能方便控制加熱和不斷攪拌。當培養(yǎng)基需要添加其它組分時，添加后也應將其充分混勻。6-培養(yǎng)基4

分裝⑴配制的培養(yǎng)基根據試驗需要分裝試管、傾注平皿、制備斜面（高層短斜面或低層高斜面）。經滅菌的培養(yǎng)基分裝，應在無菌環(huán)境下按無菌要求操作，避免污染。6-培養(yǎng)基4

⑵對熱敏感的培養(yǎng)基如糖發(fā)酵培養(yǎng)基其分裝容器一般應預先進行滅菌，以保證培養(yǎng)基的無菌性。6-培養(yǎng)基4

矯正pH

配制培養(yǎng)基必須矯正pH，干燥培養(yǎng)基也必須對pH進行驗證，高壓滅菌前的pH應比最終pH值高0.2左右。矯正pH后的培養(yǎng)基應加熱、過濾，使培養(yǎng)基澄清。6-培養(yǎng)基4

2、培養(yǎng)基的滅菌

滅菌方法及條件不當可直接影響培養(yǎng)基質量，培養(yǎng)基滅菌方法和條件，應通過無菌性試驗和促生長試驗進行驗證，驗證方法同《中國藥典2010年版》附錄滅菌法。商品化的成品培養(yǎng)基或自配的培養(yǎng)基若采用不適當的加熱和滅菌條件，有可能引起顏色變化、透明度降低、瓊脂凝固力或PH的變化，而不符合培養(yǎng)基質量的要求。6-培養(yǎng)基4

培養(yǎng)基的滅菌應按照生產商提供或使用者驗證的參數進行。商品化的成品培養(yǎng)基必須附有所用滅菌方法的資料。6-培養(yǎng)基4

不同種類培養(yǎng)基應采用不同的滅菌方法，配制好的培養(yǎng)基滅菌一般多用流通蒸汽滅菌和濾膜過濾除菌。

流通蒸汽滅菌是最常用的最有效的滅菌法，

121℃，15min(121℃，30min)或116℃，40min可殺死所有的細菌芽孢。6-培養(yǎng)基4

濾膜過濾除菌

如配制的培養(yǎng)基含有不耐熱成分可采用濾膜過濾除菌和血清凝固器除菌。濾膜過濾除菌采用孔徑0.22um的濾膜過濾器，濾膜材質依過濾物品的性質及目的而定。不得對被濾過成分有吸附作用，不得有物質釋放和纖維的脫落，也不得使用含有石棉的濾器。濾器和濾膜在使用前應進行驗證，并進行滅菌。血清凝固器80～100℃、30min，連續(xù)三天，間歇滅菌。6-培養(yǎng)基4

3、培養(yǎng)基的貯藏

⑴商品化培養(yǎng)基應根據使用說明書上的要求進行儲存。培養(yǎng)基標簽上應標有批號，生產日期、有效期及培養(yǎng)基的有關特性。所采用的保藏和運輸條件應使培養(yǎng)基最低限度失去水分并提供機械保護。6-培養(yǎng)基4

脫水培養(yǎng)基或單獨配方組分應在適當的條件下貯存，如低溫、干燥和避光，所有的容器應密閉，尤其是盛有脫水培養(yǎng)基的容器.6-培養(yǎng)基4

⑵配制好的培養(yǎng)基應驗證的條件下貯藏。保存在2～25℃避光的環(huán)境。若保存于非密閉容器中，一般在三周內使用,若保存于密閉容器中，一般在一年內使用.

6-培養(yǎng)基4⑶瓊脂培養(yǎng)基不得在0℃或0℃以下存放，防止冷凍破壞凝膠特性。瓊脂平板最好現配現用，如置冰箱保存，一般不超過一周，且應密閉包裝，若延長保存，保存期需經驗證確定。⑷培養(yǎng)基滅菌后應立即取出，不得儲藏在高壓滅菌器中，避免影響培養(yǎng)基的質量。

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⑸固體培養(yǎng)基滅菌后的再融化應在加熱的水浴中或采用流通蒸汽進行，只允許一次，融化的培養(yǎng)基應放在45～50℃的水浴中，不得超過8小時。⑹使用過的培養(yǎng)基（包括失效的培養(yǎng)基）應按照國家污染廢物處理相關規(guī)定進行。6-培養(yǎng)基4

二、培養(yǎng)基的質量控制

經實驗室配制或由生產廠生產的培養(yǎng)基的質量高度依賴于其如何制備，采用不適宜方法制備的培養(yǎng)基將影響微生物的生長或復蘇，從而影響試驗結果的可靠性。

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所有配制好的培養(yǎng)基均應進行驗證，驗證方法參照《中國藥典2010年版》附錄無菌檢查或微生物限度檢查項下有關規(guī)定進行。6-培養(yǎng)基4

實驗室配制的培養(yǎng)基監(jiān)控項目外觀、性狀、pH、促生長試驗、定期的穩(wěn)定性檢查以及培養(yǎng)基有效期的確定。6-培養(yǎng)基4

驗證時間由同一批脫水培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基時，若采用已驗證的配制和滅菌程序，那么可不進行批批促生長試驗。如果培養(yǎng)基制備的方法未經驗證，那么，配制的每一批培養(yǎng)基必須進行促生長試驗。

試驗方法根據培養(yǎng)基的用途參照《中國藥典2010年版》附錄無菌檢查或微生物限度檢查項下有關規(guī)定進行。

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培養(yǎng)基的有效期是指已通過促生長試驗的培養(yǎng)基在整個有效期內均需符合這些相應的標準。每批培養(yǎng)基儲存的時間將取決于一定存放條件（包括容器和密封性）的培養(yǎng)基組成成分的穩(wěn)定性。6-培養(yǎng)基4

試驗結果處理

⑴當批培養(yǎng)基不符合促生長試驗，應尋找造成不合格的原因。⑵這個調查包括采取適當的行動以防止問題的重復出現。⑶如果未找到原因或還沒有解決有關培養(yǎng)基的促生長問題，那么任何不符合要求的批次均不能使用。6-培養(yǎng)基4

一些用于進一步鑒定微生物的診斷試劑，如革蘭染色、氧化酶試驗試劑等。它們與培養(yǎng)基相似點是質量控制試驗。在試劑用于未知樣品鑒定前，選擇正確的標準質控菌，按使用說明上的要求進行質控試驗。6-培養(yǎng)基4

用于環(huán)境監(jiān)控的培養(yǎng)基應特別小心防護。尤其是用于關鍵區(qū)域監(jiān)控的培養(yǎng)基最好要雙層包裝和終端滅菌，如果不能采用終端滅菌的培養(yǎng)基，那么在使用前應進行100%的預培養(yǎng)。這樣是為了防止將外來的污染帶到環(huán)境中及避免出現假陽性結果。6-培養(yǎng)基4

1、測定PH值

每批培養(yǎng)基滅菌后均應測定PH值；在冷卻至室溫（25℃）后，以無菌操作取出少量培養(yǎng)基進行測定。除非經驗證表明培養(yǎng)基的PH允許的變化范圍很寬，否則，培養(yǎng)基的PH的范圍不得超過規(guī)定的±0.2。6-培養(yǎng)基4

2、一般性狀

⑴制成平板或分裝于試管的培養(yǎng)基應檢查；容器和蓋子的破裂，裝量。⑵固體培養(yǎng)基因水分流失而造成表面產生裂縫或漣漪。⑶其他如溶血，可能冷藏溫度下形成的結晶，大量的汽泡，微生物污染，氧化還原指示劑的狀況，批數量和有效期的檢查和記錄，培養(yǎng)基的無菌檢查等。6-培養(yǎng)基4

⑷液體培養(yǎng)基應觀察培養(yǎng)基的顏色，是否有沉淀，微生物污染，氧化還原指示劑的狀況，批數量和有效期的檢查和記錄等。6-培養(yǎng)基43、培養(yǎng)基的促生長和抑制性能試驗

⑴無菌檢查用培養(yǎng)基使用前應進行適用性試驗，適用性試驗包括無菌性檢查和靈敏度檢查，無菌性試驗是檢查培養(yǎng)基滅菌是否完全，靈敏度檢查是確定培養(yǎng)基的質量好壞、穩(wěn)定與否，這對檢驗結果有極為重要的影響。培養(yǎng)基的靈敏度檢查法如下：6-培養(yǎng)基4

靈敏度檢查

菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]

銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]

枯草芽胞桿菌[CMCC(B)63501]

生孢梭菌[CMCC(B)64941]

白色念珠菌[CMCC(F)98001]

黑曲霉[CMCC(F)98003]

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金黃色葡萄球菌好氧性革蘭陽性菌和銅綠假單胞菌好氧性革蘭陰性菌枯草芽胞桿菌好氧性芽胞桿菌生孢梭菌厭氧菌白色念珠菌酵母菌黑曲霉真菌這幾類菌基本上代表了自然界常見的微生物,也是藥品中常見的污染菌；。6-培養(yǎng)基4

靈敏度檢查培養(yǎng)基接種量

試驗菌培養(yǎng)溫度培養(yǎng)基培養(yǎng)時間接種管數裝量

(℃)(天)（支）（支）

金黃色葡萄球菌30～35硫乙醇酸鹽流體3212銅綠假單胞菌3212生孢梭菌3212白色念珠菌23～28改良馬丁529黑曲霉39

①每種菌液接種量含菌小于100cfu②同時做1支空白對照6-培養(yǎng)基4

結果判定

空白對照管應無菌生長。⑴若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。⑵若加菌的培養(yǎng)基管不生長或生長不好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查不符合規(guī)定，不能用于無菌試驗，并尋找造成不合格的原因。培養(yǎng)基的適用性檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進行。6-培養(yǎng)基4

⑵微生物限度檢查(計數培養(yǎng)基)培養(yǎng)基的適用性檢查微生物限度檢查(計數培養(yǎng)基)

使用前應進行適用性試驗，適用性試驗包括促生長、抑制及指示能力檢查。6-培養(yǎng)基4菌種大腸埃希菌[CMCC（B）26003]金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]白色念珠球菌[CMCC（B）98001]黑曲霉[CMCC（F）98003]6-培養(yǎng)基4

檢查方法

菌種培養(yǎng)基加入菌數培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時間（cfu）（℃）（h）大腸埃希菌金黃色葡萄球菌營養(yǎng)瓊脂50~10030~3548

枯草芽孢桿菌黑曲霉玫瑰紅鈉瓊脂50~10023~2872

白色念珠球菌白色念珠球菌酵母浸出粉胨50~10023~2872

葡萄糖瓊脂

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菌懸液制備后在室溫下放置應在2小時內使用，若保存在2～8℃可以在24小時內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2～8℃，在驗證過的貯存期內使用。6-培養(yǎng)基4

結果判定

被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數不得小于對照培養(yǎng)基菌落平均數的70%，且菌落形態(tài)、大小應與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。6-培養(yǎng)基4⑶控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查控制菌檢查用培養(yǎng)基的促生長、抑制及指示能力檢查控制菌檢查培養(yǎng)基特性試驗菌株大腸埃希菌膽鹽乳糖促生長能力大腸埃希菌抑制能力金黃色葡萄球菌

MUG促生長能力+指示能力大腸埃希菌曙紅亞甲藍或麥康凱促生長能力+指示能力大腸埃希菌大腸菌群乳糖膽鹽促生長能力大腸埃希菌抑制能力金黃色葡萄球菌乳糖發(fā)酵促生長能力+指示能力大腸埃希菌曙紅亞甲藍或麥康凱促生長能力+指示能力大腸埃希菌

6-培養(yǎng)基4沙門菌營養(yǎng)肉湯促生長能力乙型付傷寒沙門菌四硫磺酸鈉亮綠促生長能力乙型付傷寒沙門菌抑制能力金黃色葡萄球菌膽鹽硫乳瓊脂或沙門、志賀氏屬瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示能力乙型付傷寒沙門菌曙紅亞甲藍瓊脂或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基促生長能力+指示能力乙型付傷寒沙門菌三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基指示能力乙型付傷寒沙門菌銅綠假單膽鹽乳糖促生長能力銅綠假單胞菌胞菌抑制能力金黃色葡萄球菌溴化十六烷基三促生長能力銅綠假單胞菌甲銨瓊脂抑制能力大腸埃希菌綠膿菌素測定用培養(yǎng)基促生長能力+指示能力銅綠假單胞菌6-培養(yǎng)基4金黃色葡亞碲酸鹽肉湯促生長能力金黃色葡萄球菌萄球菌抑制能力大腸埃希菌卵黃氯化鈉瓊脂促生長能力+指示能力金黃色葡萄球菌或甘露醇鹽瓊脂抑制能力大腸埃希菌梭菌梭菌增菌培養(yǎng)基促生長能力生孢梭菌哥倫比亞瓊脂促生長能力生孢梭菌白色念沙氏葡萄糖肉湯促生長能力白色念珠菌珠菌沙氏葡萄糖瓊脂促生長能力+指示能力白色念珠菌念珠菌顯色培養(yǎng)基促生長能力+指示能力白色念珠菌吐溫80玉米瓊脂促生長能力+指示能力白色念珠菌6-培養(yǎng)基4

檢查方法

1、液體培養(yǎng)基促生長能力檢查增菌培養(yǎng)基促生長能力檢查分別接種不大于100cfu的試驗菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗菌應生長良好。6-培養(yǎng)基42、固體培養(yǎng)基促生長能力檢查

固體培養(yǎng)基促生長能力檢查取試驗菌各0.1ml（含菌數50～100cfu）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板中，在相應控制菌檢查規(guī)定的培