無菌檢查法培訓(xùn)課件

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法無菌檢查法培訓(xùn)

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法無

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法二、檢測環(huán)境無菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行。潔凈度標(biāo)準(zhǔn)：《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。無

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法無菌檢驗(yàn)過程中應(yīng)同時(shí)檢查超凈工作臺(tái)單向流空氣中的菌落數(shù)：

每次操作時(shí)在層流空氣所及臺(tái)面的左中右置3個(gè)營養(yǎng)瓊脂平板，暴露30min，于30～35℃培養(yǎng)48小時(shí)，菌落數(shù)平均應(yīng)不超過1CFU/平板。無

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法無

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法四、樣品量檢驗(yàn)數(shù)量：是指一次試驗(yàn)所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。檢驗(yàn)量：指一次試驗(yàn)所用的供試品總量。除另有規(guī)定外，出廠產(chǎn)品按表1規(guī)定；上市產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)按表2、表3規(guī)定。表1、表2、表3中最少檢驗(yàn)數(shù)量不包括陽性對(duì)照試驗(yàn)的供試品用量。（一般情況下，供試品無菌檢查若采用薄膜過濾法，應(yīng)增加1/2的最小檢驗(yàn)數(shù)量作陽性對(duì)照用；若采用直接接種法，應(yīng)增加供試品1支（或瓶）作陽性對(duì)照用。）

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法表1批出廠產(chǎn)品最少檢驗(yàn)數(shù)量無

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法表2.液體制劑最少檢驗(yàn)量及上市抽驗(yàn)樣品的最少檢驗(yàn)數(shù)量

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法表3.固體制劑最少檢驗(yàn)量及上市抽檢樣品的最少檢驗(yàn)數(shù)無

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法五、實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備1、培養(yǎng)基及稀釋液（1)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（2）改良馬丁培養(yǎng)基（3）pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液無

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法2、培養(yǎng)基的制備及培養(yǎng)條件直接購買配制好的干粉培養(yǎng)基，按培養(yǎng)基包裝上的說明，取規(guī)定量的干粉培養(yǎng)基及蒸餾水進(jìn)行配制之后，按說明上的溫度、時(shí)間要求進(jìn)行培養(yǎng)基滅菌。注：對(duì)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，配好后，須煮沸，再滅菌。培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過培養(yǎng)基深度的1/5。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，置30～35℃培養(yǎng)。改良馬丁培養(yǎng)基，置23～28℃培養(yǎng)。無

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法3、其他實(shí)驗(yàn)材料剪刀、鑷子濾器、微孔濾膜量筒培養(yǎng)器無

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法以上材料可以采用干熱滅菌（只限于剪刀、鑷子，滅菌時(shí)將剪刀和鑷子裝入專用滅菌器具內(nèi)）或濕熱滅菌。干熱滅菌為160℃2小時(shí)，或置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121℃蒸汽滅菌30分鐘后使用。無

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法4、培養(yǎng)基的適用性檢查無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應(yīng)符合培養(yǎng)基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時(shí)進(jìn)行。無菌性檢查：每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支（瓶），培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。無

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法無

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法菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30℃～35℃培養(yǎng)18小時(shí)～24小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，23～28℃培養(yǎng)24～48小時(shí)。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu（菌落形成單位）的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23～28℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)小于100cfu的孢子懸液。無

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法菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在2～8℃可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2～8℃，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。培養(yǎng)基接種

取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)3天；取每管裝量為9ml的改良馬丁培養(yǎng)基5支,分別接種小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)5天。逐日觀察結(jié)果。結(jié)果判定空白對(duì)照管應(yīng)無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。無

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法六、實(shí)驗(yàn)設(shè)備過濾裝置（無油真空泵、濾杯、濾頭、濾瓶、微孔濾膜、夾子）電子天平壓力蒸汽滅菌器電熱鼓風(fēng)干燥箱恒溫培養(yǎng)箱集菌儀無

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法5、供試品的準(zhǔn)備

操作前，用適宜的消毒液對(duì)供試品容器表面進(jìn)行徹底消毒，如果供試品容器內(nèi)有一定的真空度，可用適宜的無菌器材（如帶有除菌過濾器的針頭）向容器內(nèi)導(dǎo)入無菌空氣，再按無菌操作起開容器取出內(nèi)容物。無

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法七、供試液的制備（薄膜過濾法）用？mlpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液浸提供試品，混勻、立即過濾。？：使供試品完全浸泡所需的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液的用量無

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法八、檢查法——薄膜過濾法

將供試液混勻，過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用適量的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)不得少于三次。優(yōu)先采用封閉式薄膜過濾器（集菌器），也可使用開放式薄膜過濾器。濾膜孔經(jīng)不大于0.45μｍ。濾器和濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌，或直接采用無菌集菌器。無

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法如采用封閉式薄膜過濾器，取一副三聯(lián)式集菌器，將供試液通過集菌儀過濾，使通過每只培養(yǎng)管的量基本均勻。然后通過集菌儀一只加120ml改良馬丁培養(yǎng)基，另兩只分別加入120ml硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（其中一只做陽性對(duì)照，內(nèi)加金黃色葡萄球菌液1ml）。另取一副二聯(lián)集菌器，用同批的沖洗液或浸提介質(zhì)120ml通過集菌儀過濾（每只約50ml），同法一只加硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基120ml，另一只加改良馬丁培養(yǎng)基120ml分別作陰性對(duì)照。封閉式薄膜過濾器

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法如用一般薄膜過濾器，將供試液過濾后取出濾膜，將其剪成3等份，分別置于含50ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基的容器中，其中兩份作檢驗(yàn)，一份作陽性對(duì)照。無

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法八、檢查法——直接接種法

每個(gè)供試品按規(guī)定量分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中。每個(gè)容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%，或培養(yǎng)基的裝量足以浸沒供試品。同時(shí)，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml及改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml。無

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法九、對(duì)照實(shí)驗(yàn)陽性對(duì)照應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇對(duì)照菌：無抑菌無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對(duì)照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對(duì)照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對(duì)照菌；抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對(duì)照菌。陽性對(duì)照試驗(yàn)的菌液制備同方法驗(yàn)證試驗(yàn)，加菌量小于100cfu，供試品用量同供試品無菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對(duì)照管培養(yǎng)48～72小時(shí)應(yīng)生長良好。無

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法陽性對(duì)照：一般情況下，供試品無菌檢查若采用薄膜過濾法，應(yīng)增加1/2的最小檢驗(yàn)數(shù)量作為陽性對(duì)照用；若采用直接直接接種法，應(yīng)增加供試品無菌檢查時(shí)每個(gè)培養(yǎng)基容器接種的樣品量作為陽性對(duì)照用。陰性對(duì)照：供試品無菌檢查時(shí)，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長。無

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法十、培養(yǎng)及觀察

上述含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天。

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，置30～35℃培養(yǎng)。

改良馬丁培養(yǎng)基，置23～28℃培養(yǎng)。培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長。如在加入供試品后、或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，細(xì)菌培養(yǎng)2天、真菌培養(yǎng)3天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。無

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法無

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法無

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法影響假陰性發(fā)生的因素1、培養(yǎng)條件不能支持微生物的生長（促生長試驗(yàn)）；2、在無菌實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)品中釋放出了殺菌或微生物電解的物質(zhì)（消除抑制物質(zhì)）3、從滅菌處理到培養(yǎng)有一定的時(shí)間間隔（確定滅菌后產(chǎn)品的儲(chǔ)存條件及儲(chǔ)存時(shí)間）無

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法十三、實(shí)驗(yàn)過程中所用的記錄1、培養(yǎng)基配制記錄2、無菌檢驗(yàn)原始記錄3、滅菌設(shè)備、培養(yǎng)設(shè)備使用記錄4、菌種使用記錄5、培養(yǎng)基、陽性菌銷毀記錄6、培養(yǎng)基靈敏度檢查記錄7、無菌檢驗(yàn)室消毒記錄8、檢定菌接收、傳代登記表9、冰箱溫度檢查記錄10、無菌檢驗(yàn)室溫濕度記錄11、無菌檢驗(yàn)室臭氧消毒記錄12、無菌檢驗(yàn)室紫外燈使用記錄13、無菌工作服清洗消毒記錄14、消毒劑配制記錄無

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法十四、實(shí)驗(yàn)全過程中的注意事項(xiàng)1、取樣質(zhì)檢人員要清楚樣品的來源，確保樣品具有代表性；樣品包裝須完好無損，尤其是只有一層包裝的樣品。2、實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備注意干粉培養(yǎng)基包裝瓶上所寫的滅菌溫度和時(shí)間；硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基必須在煮沸后，再進(jìn)行分裝、滅菌；無菌實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基最好現(xiàn)做現(xiàn)用。無

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法3、將樣品及滅菌后的物品送入實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入無菌檢驗(yàn)室的樣品若有兩層包裝的，需將外包裝在傳遞窗或緩沖間拆除