動物疫病鑒別檢測技術 第3部分：禽腺病毒Ⅰ群與禽腺病毒Ⅲ群-地方標準格式審查稿

ICS11.220CCSB4137Animaldiseaseidentificationanddetectiontechnology—Part3:GroupIAvadenovirusesandGroupIIIAvianaIDB37/T4754.3—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是DB37/T4754《動物疫病鑒別檢測技術》的第3部分。DB37/T4754已經(jīng)發(fā)布了以下部分：——第1部分：豬瘟強毒與豬瘟疫苗弱毒；——第2部分：兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型；——第3部分：禽腺病毒Ⅰ群與禽腺病毒Ⅲ群。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實施。本文件由山東省畜牧業(yè)標準化技術委員會歸口。DB37/T4754.3—2024動物疫病是影響山東省畜牧業(yè)健康發(fā)展的重要因素之一。不同病原或者相同病原的不同血清型/基因型引起疫病的臨床病癥具有一定程度的相似性，同時，有些疫病弱毒疫苗的使用干擾了病原的檢測。動物疫病鑒別檢測技術標準的建立，規(guī)定了對不同病原、相同病原的不同血清型/基因型以及弱毒疫苗株的鑒別檢測，為山東省動物疫病精準防控提供了技術支持，對于促進畜牧業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。禽腺病毒（Avianadenovirus）分為3個屬：禽腺病毒屬（Aviadenovirus）、唾液腺病毒屬8a、8b～11）為禽腺病毒屬成員，感染雞、火雞、鴨、鵝、鴿子以及珍珠雞、雉雞、鸚鵡、鴕鳥等野生禽類并引起心包積水綜合征、包涵體肝炎、壞死性胰腺炎和肌胃糜爛癥以及呼吸道疾病等典型臨床病癥；禽腺病毒Ⅱ群為唾液腺病毒屬，成員包括火雞出血性腸炎病毒、雉雞大理石脾病毒、雞脾腫大病毒等，其中火雞出血性腸炎病毒主要危害火雞養(yǎng)殖；禽腺病毒Ⅲ群唯一成員減蛋綜合征病毒（Eggdropsyndromevirus，EDSV），又稱為鴨腺病毒A種，為腺胸腺病毒屬，該病毒來源于鴨，易感宿主包括雞、鴨、鵝等禽類，導致產(chǎn)蛋下降及產(chǎn)色淺、殼薄和無殼蛋，也可引起雛鵝呼吸道病征。我國養(yǎng)禽業(yè)主要包括雞、鴨、鵝、鴿子等，禽腺病毒Ⅰ群和Ⅲ群易感宿主均包括雞、鴨、鵝等，是影響我國養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重要病原，且二者具有部分相同群抗原，因此，有必要針對禽腺病毒Ⅰ群與Ⅲ群開展鑒別檢測，對于精準防控禽腺病毒感染具有重要意義?！秳游镆卟¤b別檢測技術》擬由三個部分構成：——第1部分：豬瘟強毒與豬瘟疫苗弱毒。目的在于規(guī)范豬瘟強毒與豬瘟疫苗弱毒SYBRGreenⅠ熒光RT-PCR鑒別檢測技術的操作，便于檢測技術在豬瘟臨床診斷、流行病學調(diào)查、檢驗檢疫、豬瘟疫苗質(zhì)量控制等方面的穩(wěn)定應用?！?部分：兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型。目的在于規(guī)范兔出血癥病毒經(jīng)典型與兔出血癥病毒2型實時熒光RT-PCR鑒別檢測技術的操作，便于檢測技術在兔出血癥臨床診斷、流行病學調(diào)查、檢驗檢疫等方面的穩(wěn)定應用?！?部分：禽腺病毒Ⅰ群與禽腺病毒Ⅲ群。目的在于規(guī)范禽腺病毒Ⅰ群與Ⅲ群PCR鑒別檢測技術的操作，便于檢測技術在禽腺病毒病臨床診斷、流行病學調(diào)查、檢驗檢疫等方面的穩(wěn)定應用。1DB37/T4754.3—2024動物疫病鑒別檢測技術第3部分：禽腺病毒Ⅰ群與禽腺病毒Ⅲ群本文件描述了禽腺病毒Ⅰ群與Ⅲ群聚合酶鏈式反應（Polymerasechainreaction，PCR）的鑒別檢測方法。本文件適用于含有禽腺病毒Ⅰ群與Ⅲ群的鑒別檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4試驗原理PCR技術是在TaqDNA聚合酶作用下，以靶DNA為模板、靶DNA序列5'端與3'端互補的且長度一般為18bp～27bp的特異性寡核苷酸為引物、dNTP為反應原料，按照堿基配對及半保留復制原理，經(jīng)變性、退火、延伸循環(huán)多次，DNA擴增產(chǎn)物呈指數(shù)型上升，并通過瓊脂凝膠電泳獲知擴增產(chǎn)物的分子量從而判定結果。本文件對禽腺病毒Ⅰ群與Ⅲ群靶基因進行PCR擴增，并通過特異性擴增產(chǎn)物分子量差異，用于禽腺病毒Ⅰ群與Ⅲ群的鑒別檢測。5試劑或材料除非另有說明，所用試劑均為分析純。5.1水：GB/T6682，一級。5.210000×核酸熒光染料（GelRed/GelGreen）。5.3DL2000DNA分子標準：包括100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp分子量標準。5.4PCR反應試劑：10×TaqDNA聚合酶緩沖液、TaqDNA聚合酶（5U/μL）、dNTP（2.5mmol/L）；2×PCR反應預混液（2×TaqPCRMix）。5.5磷酸鹽緩沖液（PBS）：0.01mol/L、pH7.4。稱取氯化鈉（NaCl）8.0g、氯化鉀（KCl）0.2g、磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2g、磷酸氫二鈉（Na2HPO4.12H2O）2.9g，依次溶于800mL水中，用鹽酸調(diào)pH值至7.4，于高壓滅菌鍋121℃滅菌20min，4℃保存。5.60.5mol/LEDTA溶液：pH8.0。2DB37/T4754.3—2024稱取EDTA18.61g，加滅菌水至80mL，用氫氧化鈉調(diào)pH至8.0，充分溶解，定容至100mL，室溫保存。5.71×TAE緩沖液。取20mL50×TAE電泳緩沖液，加滅菌水至1000mL，室溫保存。5.81.5%瓊脂糖凝膠。稱取瓊脂糖1.5g，放入100mL1×TAE電泳緩沖液中，加熱融化，溫度降至50℃~60℃時，加入10μL10000×核酸熒光染料（GelRed/GelGreen），均勻鋪板，厚度為3mm～5mm。5.96×核酸電泳加樣緩沖液。稱取EDTA4.4g、溴酚藍0.25g、二甲苯腈藍FF0.25g，依次溶于200mL滅菌水中，加入180mL甘油，調(diào)pH值至7.0，定容至500mL，分裝室溫保存。5.10病毒DNA提取試劑盒。5.11無核酸酶離心管（1.5mL）。5.12PCR檢測反應管（0.2mL）。5.13禽腺病毒Ⅰ群4型、禽腺病毒Ⅲ群EDSV陽性對照樣品和陰性對照樣品，均-20℃保存。陽性對照：禽腺病毒Ⅰ群4型、禽腺病毒Ⅲ群EDSV基因組DNA；陰性對照：SPF雞肝臟組織。5.14引物：引物名稱和序列按照附錄A執(zhí)行。6儀器設備6.1A型Ⅱ級生物安全柜。6.2電子天平：精度0.01g。6.3高速冷凍離心機：轉(zhuǎn)速≥12000r/min。6.4微型低速離心機：轉(zhuǎn)速≤6000r/min。6.5冰箱：-20℃。6.6PCR檢測儀。6.7凝膠成像儀。6.8電泳儀、電泳槽。6.9高壓滅菌鍋。7樣品樣品采集、保存和運輸按照NY/T541執(zhí)行。8試驗步驟8.1樣品處理8.1.1肝臟組織樣品在A型Ⅱ級生物安全柜中處理。使用電子天平稱取1.00g±0.05g樣品，剪碎后與PBS按1:5（W/V）比例混合，研磨成組織勻漿，裝入1.5mL無核酸酶離心管，置于高速冷凍離心機，4℃、12000r/min離心5min，取上清液提取核酸。8.1.2拭子樣品3DB37/T4754.3—2024置于500μL的PBS中充分震蕩浸潤，反復擠壓拭子3次，4℃、5000r/min離心5min，取上清液提取核酸。8.1.3病毒培養(yǎng)物樣品收獲的病毒細胞培養(yǎng)液、禽胚尿囊液或卵黃液，直接提取核酸。8.1.4陰性對照樣品處理同8.1.1。8.1.5檢畢樣品按照NY/T541處理。8.2核酸提取按照病毒DNA提取試劑盒說明書，提取待檢樣品、陰性對照樣品的DNA。提取的DNA樣品應立即檢測，否則應-20℃冰箱保存30d。8.3PCR檢測8.3.1反應體系配置PCR檢測反應體系見表1。也可使用等效的商品化2×PCR反應預混液配制PCR擴增體系。表1PCR檢測反應體系10×TaqDNA聚合酶緩沖液TaqDNA聚合酶水8.3.2加樣將制備的陰性對照與待檢樣品DNA、陽性對照基因組DNA樣品溶液產(chǎn)物各2μL依次分別加入對應PCR檢測反應管中，扣緊管蓋，混勻后置于微型低速離心機離心10s。8.3.3擴增PCR檢測儀反應程序：——第一階段：94℃預變性5min；——第二階段：94℃40s，55℃40s，72℃30s，共35個循環(huán)；4DB37/T4754.3—2024——第三階段：72℃10min。8.3.4瓊脂糖凝膠電泳取5μL擴增樣品，與1μL6×核酸電泳加樣緩沖液混勻（若使用含有染料的PCR預混液進行擴增，省略該環(huán)節(jié)），加樣至1.5%瓊脂糖凝膠樣品孔，置于電泳槽TAE緩沖液中，并設DL2000DNA分子標準電泳泳道，按照5V/cm設置電泳儀電壓，電泳30min。電泳結束后，置于凝膠成像儀拍攝圖片，根據(jù)分子量標準判斷PCR擴增產(chǎn)物。9結果判定9.1質(zhì)控標準擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，質(zhì)控標準同時滿足以下條件試驗有效，否則無效：a)陰性對照無特異性PCR擴增產(chǎn)物；b)陽性對照能夠擴增禽腺病毒Ⅰ群4型494bp與禽腺病毒Ⅲ群EDSV308bp特異性擴增產(chǎn)物。9.2結果描述及判定若被檢樣品PCR產(chǎn)物含有大小為494bp的特異性條帶，則判定為禽腺病毒I群核酸檢測陽性，若被檢樣品PCR產(chǎn)物含有大小為308bp的特異性條帶，則判定為禽腺病毒Ⅲ群核酸檢測陽性，若被檢樣品PCR產(chǎn)物同時含有大小分別為494bp、308bp的特異性條帶，則判定為禽腺病毒I群、Ⅲ群核酸檢測陽性；若被檢樣品無特異性PCR產(chǎn)物，則判定為禽腺病毒I群、Ⅲ群核酸檢測陰性。電泳圖見附錄B。5DB37/T4754.3—2024（規(guī)范性）引物名稱和序列見表A.1。表A.1