細胞融合技術(shù)綜述

PAGEPAGE3細胞融合技術(shù)姓名：王洋專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)號：3117107細胞融合技術(shù)作為細胞工程的核心基礎(chǔ)技術(shù)之一,已在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域取得了開創(chuàng)性的研究成果,而且應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴大。細胞融合技術(shù)不僅為核質(zhì)關(guān)系、基因調(diào)控、遺傳互補、細胞免疫學(xué)、腫瘤發(fā)生、基因定位、衰老控制等理論領(lǐng)域的研究提供了有力的手段,而且被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā)生生物學(xué),特別是在單克隆抗體及動植物遠緣雜交育種等方面具有十分重要的意義。隨著細胞融合技術(shù)研究的不斷深入,細胞融合技術(shù)的發(fā)展前景及其產(chǎn)生的影響將日益顯著。1細胞融合及其意義1.1細胞融合的概念所謂細胞融合就是指在外力(誘導(dǎo)劑或促融劑)作用下,兩個或兩個以上的異源(種、屬間)細胞或原生質(zhì)體相互接觸,從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細胞的現(xiàn)象稱為細胞融合(cellfusion)或細胞雜交(cellhybridization)。如取材為體細胞則稱體細胞雜交(somatichybridization)。體細胞融合后可形成四倍體或多倍體細胞,由此形成的雜交細胞,其特性會有很大的變化。1.2細胞融合的機理最近研究表明,細胞融合與病毒和細胞之間的融合以及細胞內(nèi)的膜泡融合有許多相似之處,即帶包被的病毒(或細胞)通過轉(zhuǎn)膜病毒蛋白介導(dǎo)與宿主細胞的細胞膜進行融合。I類病毒融合蛋白包括流感病毒紅血球凝集素(HA)和人類免疫缺陷病毒包被蛋白,它們都具有相似的結(jié)構(gòu)域,即都具有a-螺旋結(jié)構(gòu)。病毒和細胞之間正是通過這些蛋白來完成融合過程(伴隨有構(gòu)象的變化)的。細胞內(nèi)的膜泡融合也是如此,其相關(guān)融合蛋白包括GTPases及SNARE家族。因此推測細胞融合采用相似的機理。然而細胞融合蛋白并不全具有a-螺旋結(jié)構(gòu),提示a-螺旋并非融合所必需。1.3細胞融合的意義細胞能不受種屬的局限可實現(xiàn)種間生物體細胞的融合,使遠緣雜交成為可能,因而是改造細胞遺傳物質(zhì)的有力手段。它的意義在于從此打破了僅僅依賴有性雜交重組基因創(chuàng)造新種的界限,擴大了遺傳物質(zhì)的重組范圍。但融合后獲得的雜種細胞具有染色體異倍性,致使細胞株的遺傳性不穩(wěn)定、植株不育性、畸形、生育遲緩等不符合育種要求的性狀出現(xiàn),直接利用雜種細胞作育種材料目前還有許多障礙。細胞融合技術(shù)避免了分離、提純、剪切、拼接等基因操作,在技術(shù)和儀器設(shè)備上的要求不像基因工程那樣復(fù)雜,投資少,有利于廣泛開展研究和推廣,有著重大的實踐意義,正得到科學(xué)界的日益重視。2細胞融合技術(shù)發(fā)展的回顧人們很早就注意到了在自然條件下發(fā)生的細胞融合現(xiàn)象,首先在病料組織中發(fā)現(xiàn)了由細胞融合產(chǎn)生的多核細胞,緊接著發(fā)現(xiàn)在脊椎動物和無脊椎動物的正常細胞中也可發(fā)生細胞融合。隨后在體外組織培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)了離體細胞的融合現(xiàn)象。自從發(fā)現(xiàn)活病毒可在體內(nèi)介導(dǎo)癌細胞融合后,人們又實現(xiàn)了滅活病毒促進動物異種細胞的融合,從而打破了細胞融合的種屬屏障,推動細胞融合技術(shù)躍上新的臺階。原生質(zhì)體的大量制備技術(shù)限制了植物細胞融合技術(shù)的發(fā)展,因此植物細胞融合的起步比動物細胞融合要遲十年左右。直到用酶法大量制備有活力的原生質(zhì)體獲得成功后,才使植物原生質(zhì)體的融合工作迅速發(fā)展起來。然而,由于病毒誘導(dǎo)細胞融合存在著病毒制備困難、操作復(fù)雜、滅活病毒的效價差異大等原因,人們又找到了比病毒簡便、快速和高效且比病毒更易制備和控制、活性穩(wěn)定、使用方便的化學(xué)物質(zhì)PEG,作為病毒的替代物誘導(dǎo)細胞融合,這是一個里程碑式的發(fā)現(xiàn),引起實驗生物學(xué)的“無聲革命”。但在PEG誘導(dǎo)細胞融合的有效濃度范圍內(nèi)(50%-55%)對細胞毒性很大,因此人們又找到了新的方法來替代PEG介導(dǎo)細胞融合法,這些新方法有電脈沖誘導(dǎo)細胞融合技術(shù)和激光融合技術(shù)等?？傊?細胞融合技術(shù)在實踐中不斷發(fā)展和完善,細胞融合方法得到了不斷的更新和改進,融合率也得到逐步的提高。現(xiàn)在新的細胞融合方法正在嘗試將各種物理、化學(xué)手段綜合應(yīng)用,使細胞融合的方法和手段操作更為簡便,便于量化研究,同時又能使融合率得到不斷提高的方向發(fā)展。2.1動物細胞融合一些致癌病毒雖然能夠誘導(dǎo)細胞融合,但由于具有毒性大等潛在的危險性而在應(yīng)用上受到很大的限制,由此科研人員又試圖嘗試使用滅活的病毒來作為促融物,并且以異種細胞作為融合對象。1965年,英國Harris等報告滅活病毒可以用來融合不同種動物的細胞,并且指出由此產(chǎn)生的雜交細胞可以存活。當時世界上許多報刊很快就對這一發(fā)現(xiàn)在生物學(xué)上的重要性做出了評價,認為這是在細胞融合研究中的又一次突破。他們的貢獻在于證明了滅活的病毒可以作為一般方法用來在一定的條件下融合動物細胞,而且差異很大的動物種之間的細胞可以被誘導(dǎo)融合,融合的細胞可以存活。1967年Weise和Green發(fā)現(xiàn)在人和鼠的融合細胞中,人的染色體優(yōu)先丟失,并證明利用這一特點有可能對人染色體上的基因進行定位。1970年Ladda又進一步發(fā)展了去核的小鼠成纖維細胞進行融合實驗,開始了各種細胞重組的研究工作。從發(fā)現(xiàn)病毒能夠誘導(dǎo)細胞融合之后,動物細胞融合的研究工作迅速發(fā)展起來。然而,由于HVJ誘導(dǎo)細胞融合存在著病毒制備困難、操作復(fù)雜、滅活病毒的效價差異大等原因,人們一直試圖發(fā)現(xiàn)一種替代物作介質(zhì)誘導(dǎo)細胞融合。2.2植物細胞融合植物細胞融合技術(shù)的發(fā)展可追溯到1937年,Mi-chel用0.5mol/L硝酸鈉處理原生質(zhì)體使之凝集、融合。但那時還不能用酶法大量制備原生質(zhì)體,使實驗受到原生質(zhì)體數(shù)量的限制,因此植物細胞融合的起步比動物細胞融合要遲十年左右。直到1960年Cocking用酶法大量制備有活力的原生質(zhì)體獲得成功,才使植物原生質(zhì)體的融合工作迅速發(fā)展起來。1972年美國科學(xué)家Carlson等將粉藍煙草和郎氏煙草兩個異種的體細胞融合成功。20世紀70年代,細胞融合的研究范圍又擴展到植物間、動物間、動植物間、甚至人體細胞與動植物細胞之間。2.3微生物細胞融合1975年原生質(zhì)體融合技術(shù)已擴展運用到微生物中,匈牙利的Ferenczy首先報道PEG促使真菌融合,以后的成功報道涉及酵母、霉菌、細菌、放線菌等多種微生物的種間以至屬間,使細胞融合技術(shù)繼動、植物之后,在微生物中也形成了實驗體系。3細胞融合的方法3.1化學(xué)法3.1.1此法是應(yīng)用最早的誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法。鹽類融合劑對原生質(zhì)體的破壞小。今后研究應(yīng)提高其融合率,使其對液泡化發(fā)達的原生質(zhì)體能夠誘發(fā)融合。3.1.2Keller首先發(fā)現(xiàn)高Ca2+和高pH值可以誘發(fā)融合。Melchers用此法將煙草種內(nèi)2個光敏感突變體誘導(dǎo)融合成功并獲得100余株體細胞雜種。提高該方法的使用范圍是亟待解決的問題。3.1.3聚乙二醇融合法(PEG法)加拿大籍華人高國楠(1974)用聚乙二醇(PEG)為融合劑誘發(fā)大豆與大麥、大豆與玉米、哈加野豌豆與豌豆的融合。此法比病毒更易制備和控制,活性穩(wěn)定,用PEG作為病毒的替代物誘導(dǎo)細胞融合。在PEG誘導(dǎo)細胞融合的有效濃度范圍內(nèi)(50%～55%)對細胞的毒性應(yīng)進一步減小。聚乙二醇(PEG)是一種多聚化合物,不同種類微生物對PEG分子質(zhì)量的要求不盡相同。放線菌適用分子質(zhì)量常為1ku～1.5ku,也有人使用0.4ku～6ku,真菌一般采用4ku～6ku,細菌用1.5ku～6ku。親本原生質(zhì)體制備好后,即可進行融合。關(guān)于促融機制,一般認為PEG本身是一種特殊的脫水劑,它以分子橋形式在相鄰原生質(zhì)體膜間起中介作用,進而改變質(zhì)膜的流動性能,降低原生質(zhì)膜表面勢能,使膜中的相嵌蛋白質(zhì)顆粒凝聚,形成一層易于融合的無蛋白質(zhì)顆粒的磷脂雙分子層區(qū)。在Ca2+存在下,引起細胞膜表面的電子分布的改變,從而使接觸處的質(zhì)膜形成局部融合,出現(xiàn)凹陷,構(gòu)成原生質(zhì)橋,成為細胞間通道并逐漸擴大,直到兩個原生質(zhì)體全部融合。3.2物理法3.2電脈沖誘導(dǎo)細胞融合技術(shù),產(chǎn)生于20世紀80年代,目前已成為細胞融合的有效手段之一。該技術(shù)融合效率高,是PEG的100倍,操作簡便、快速,對細胞無毒無害,可在顯微鏡下觀察融合全過程。這一技術(shù)將電學(xué)與生物化學(xué)恰當結(jié)合,產(chǎn)生了緩和而高頻率的原生質(zhì)體融合效果。其原理是在短時間強電場的作用下,細胞膜發(fā)生可逆性電擊穿,瞬時失去其高電阻和低通透性,然后在數(shù)分鐘內(nèi)恢復(fù)原狀,當可逆電擊穿發(fā)生在兩個相鄰細胞的接觸區(qū)時,即可誘導(dǎo)它們的膜相互融合,從而導(dǎo)致細胞融合。近年來,該技術(shù)在微生物中的應(yīng)用日漸增多。3.2.2激光融合技術(shù)20世紀80年代中期發(fā)明了激光融合器,迅速崛起的激光誘導(dǎo)細胞融合術(shù)是利用激光微束對相鄰細胞接觸區(qū)的細胞膜進行破壞(或擾動),可將兩個不同特性、不同大小的細胞在顯微鏡下實現(xiàn)融合。即利用光鑷捕捉并拖動一個細胞使之靠近另一個細胞并緊密接觸,然后對接觸處進行脈沖激光束處理,使質(zhì)膜發(fā)生光擊穿,產(chǎn)生微米級的微孔。這樣,由于質(zhì)膜上微孔的可逆性,細胞開始變形融合,最終成為一個細胞。1987年和1989年德國海德堡理化研究所用準分子激光器使油菜原生質(zhì)體融合,從開始照射到完成融合僅需幾秒鐘,對融合產(chǎn)物觀測,發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)仍在運動,說明融合后的細胞仍能存活。激光微束融合法與以前的病毒法、PEG法、電融合法相比較,可選擇任意兩個細胞進行融合,易于實現(xiàn)特異性細胞融合,作用于細胞的應(yīng)力小,定時、定位性強,損傷小,參數(shù)易于控制,操作方便,可利用監(jiān)控器清晰地觀察整個融合過程,實驗重復(fù)性好,無菌,無毒性。但它只能逐一處理細胞,不能像其他方法一樣同時處理大量細胞。細胞間相互接觸是實現(xiàn)細胞融合的前提,目前,最新穎的方法是利用激光光阱建立兩細胞間接觸,即光鑷(poticaltweezers)利用激光高斯光束光場的梯度力把細胞從光束邊緣拉向光束中間,在光斑直徑與光波波長尺度相比擬時,指向束腰的軸向梯度力要大于沿光束方向的散射力,該梯度力把細胞豎直地拉到激光束腰下方處,從而實現(xiàn)對細胞的操作。3.2.3空間細胞融合技術(shù)植物細胞融合過程中由于地面上地球重力的存在,有液泡的原生質(zhì)體與無液泡的原生質(zhì)體的密度差加大,異源細胞融合得率十分有限。在利用動物細胞融合生產(chǎn)單克隆抗體過程中,在地面上由于無法排除地球重力的影響,要提高B淋巴細胞和骨髓瘤細胞的融合得率相當困難。20世紀80年代以來,德國細胞電融合技術(shù)發(fā)明家Zmimermann等人在空間材料科學(xué)的啟發(fā)下,試圖利用空間微重力條件改進細胞融合技術(shù)。大量的飛行實驗結(jié)果表明,在微重力條件下酵母細胞雜種得率有很大的增加。融合得率增加顯然是由于沒有重力沉降影響的緣故,雜種細胞活力增加可能是細胞排列時間縮短引起的。在取得這些成功實驗的基礎(chǔ)上,進一步研究融合后的細胞在空間培養(yǎng)的可能性已經(jīng)開始。3.2.4離子束細胞融合技術(shù)中國科學(xué)院等離子體物理研究所余增亮等人發(fā)現(xiàn)并證實了離子注入生物效應(yīng)和粒子沉積生物效應(yīng)的存在,建立了質(zhì)量、能量、電荷三因子作用機制體系。在離子束與生物體相互作用中,粒子的植入、動量的傳遞和電荷交換可導(dǎo)致細胞表面被刻蝕,引起細胞膜透性和跨膜電場的改變,據(jù)此原理,發(fā)展了離子束誘導(dǎo)細胞融合技術(shù)。由于用于輻照的離子束的參數(shù)除了能量可調(diào)外,離子種類、電荷、質(zhì)量皆可調(diào),因此,離子束的可操縱性高,可以用微束對細胞進行超微加工,有目的地切割染色體用于基因工程和細胞工程,通過消除部分染色體或染色體的某些片段達到細胞非對稱融合的目的。此項研究一旦成功,將改變傳統(tǒng)的一對一細胞融合的弊端,減少供體細胞導(dǎo)入的染色體范圍,使融合更具目的性,大大減少篩選的工作量,將是細胞融合研究的一大進步。3.2.5非對稱細胞融合技術(shù)即利用某種外界因素(如γ射線)輻照某一細胞原生質(zhì)體,選擇性地破壞其細胞核,并用碘乙酰胺堿性蕊香紅6G,處理在細胞核中含有優(yōu)良基因的第2種原生質(zhì)體,選擇性地使其細胞質(zhì)失活。然后融合來自這2個原生質(zhì)體品系的細胞,實現(xiàn)所需胞質(zhì)和細胞核基因優(yōu)化組合。實踐表明非對稱細胞融合技術(shù)通過γ射線X射線照射為實現(xiàn)供體親本少數(shù)基因的轉(zhuǎn)移,創(chuàng)造種間、屬間雜種提供了可能性。4新的細胞融合方法4.1基于微流控芯片的細胞融合技術(shù)隨著微機電系統(tǒng)(MEMS)技術(shù)和微加工技術(shù)的發(fā)展,微電極陣列的設(shè)計加工制作也日趨成熟,加之微通道網(wǎng)絡(luò)可以整合到生物芯片之上,這將使得微流控系統(tǒng)成為細胞融合的理想平臺,利用微流控系統(tǒng)可以按照預(yù)定的要求大量融合異種細胞。Strum-bergA等已經(jīng)在微流控系統(tǒng)中實現(xiàn)了單個成對細胞的融合。證明了利用微流控技術(shù)使細胞之間可以實現(xiàn)可控融合,利用基于芯片技術(shù)的微流控系統(tǒng)不僅可以實現(xiàn)對細胞甚至單個細胞的操控,也可以同時輸送、合并、分離和分選大量細胞,細胞融合在芯片上可以通過并行或快速排隊的方式實現(xiàn)。此外,由于在微通道內(nèi)的腔體容積很小,所以會大幅減少細胞融合中所需的細胞數(shù)量,同時細胞融合率和雜合細胞的成活率會大大提高。4.2高通量細胞融合芯片高通量細胞融合芯片利用微電極陣列在細胞融合芯片的微米范圍內(nèi)(10μm～40μm)產(chǎn)生的高強度高梯度輻射電場,使得細胞融合芯片中的細胞在此特殊輻射電場的作用下產(chǎn)生介電質(zhì)電泳力,精確處理和刺激預(yù)定的細胞目標,從而使目標細胞按照預(yù)先設(shè)計的方向以預(yù)定的速度移動,從而可以按照設(shè)計要求準確地大批量地得到目標細胞配型,集成微電極陣列的微流控系統(tǒng),可以方便靈活地實現(xiàn)對細胞的操作、隔離和轉(zhuǎn)移。該方法的優(yōu)點是可以與化學(xué)誘導(dǎo)融合、電誘導(dǎo)融合等方法相互結(jié)合,比如在細胞融合緩沖液中加入少量的PEG可大大提高細胞的融合率。此外,二價陽離子(如Ca2+)以及蛋白酶對細胞的預(yù)處理,融合率也可大幅提高。然而,截至目前各國與此相關(guān)的細胞融合實驗工作只有幾篇論文報道。參考論文[1]李志勇.細胞工程[M].北京:科學(xué)出版