HIFU的免疫調(diào)控作用

高能量聚焦超聲（HIFU）的免疫調(diào)控機(jī)理聚焦超聲是一種正在受到世界各國(guó)廣泛重視的無(wú)創(chuàng)局部治療手段HIFU：High-IntensityFocusedUltrasoundHIFU技術(shù)的產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化：涉及物理學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、機(jī)械工程學(xué)、電子學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、材料科學(xué)以及傳熱學(xué)等多種學(xué)科，融合了包括傳感器技術(shù)、信號(hào)處理技術(shù)、水處理技術(shù)、生物工程技術(shù)、圖像處理、腫瘤組織變性鑒別技術(shù)及計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)、計(jì)算機(jī)治療計(jì)劃系統(tǒng)等最新研究成果。HIFU作為腫瘤治療的新技術(shù)尤其引起了越來(lái)越多的關(guān)注國(guó)內(nèi)外對(duì)HIFU已進(jìn)行了近十年的研究，技術(shù)日漸成熟，并已開(kāi)始從動(dòng)物試驗(yàn)向臨床過(guò)渡。歐美已批準(zhǔn)用于前列腺癌治療。國(guó)內(nèi)開(kāi)展HIFU臨床試驗(yàn)的研究早于國(guó)外，迄今已積累上萬(wàn)例臨床病例。用于肝癌、乳腺癌、前列腺癌、骨肉瘤、軟組織肉瘤治療。

尚待解決的問(wèn)題：原位復(fù)發(fā)：體積較大的實(shí)體瘤組織特性和熱傳導(dǎo)性不均一。已有報(bào)道軟組織肉瘤的HIFU治療臨床研究中有20%的原位復(fù)發(fā)率。腫瘤轉(zhuǎn)移：已有幾項(xiàng)研究報(bào)道HIFU治療并不增加腫瘤轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)腫瘤轉(zhuǎn)移仍然是病人死亡的主要原因研究熱點(diǎn)：HIFU劑量學(xué)即超聲劑量與治療效應(yīng)的關(guān)系、腫瘤影像學(xué)與治療過(guò)程的實(shí)時(shí)跟蹤監(jiān)控及組織內(nèi)的精確測(cè)溫技術(shù)等方面。HIFU除可以殺滅原發(fā)灶腫瘤組織外，還可以增加機(jī)體的系統(tǒng)性抗腫瘤免疫

HIFU治療小鼠體表Brown-Pierce肉瘤，當(dāng)將其原位瘤破壞后其播散結(jié)節(jié)也自行消失。HIFU治療荷神經(jīng)母細(xì)胞瘤1300小鼠，治愈者再次接種同種腫瘤的腫瘤增殖率降低。腫瘤病人經(jīng)HIFU治療后，循環(huán)中CD3+CD4+T細(xì)胞數(shù)量及CD4+/CD8+T細(xì)胞數(shù)量比有所上升。HIFU治療乳腺癌使同側(cè)腋窩淋巴結(jié)內(nèi)濾泡增多，生發(fā)中心擴(kuò)大，淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增多，78%的病例淋巴結(jié)為混合免疫反應(yīng)增強(qiáng)型。

對(duì)HIFU調(diào)控免疫應(yīng)答的作用機(jī)制及其潛能缺乏必要的深入研究?？鼓[瘤免疫應(yīng)答及DC的作用：HIFU增強(qiáng)抗腫瘤免疫的關(guān)鍵環(huán)節(jié)可能在于DC的活化和功能調(diào)節(jié)危險(xiǎn)理論和危險(xiǎn)信號(hào)：1994年Matzinger首先提出。認(rèn)為誘發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因素是機(jī)體細(xì)胞受損后產(chǎn)生危險(xiǎn)信號(hào)。核心是接受APCs在免疫應(yīng)答中的重要地位，認(rèn)為APCs由損傷的細(xì)胞提供的危險(xiǎn)信號(hào)所激活。危險(xiǎn)信號(hào)：外源性?xún)?nèi)源性誘導(dǎo)性表達(dá)組成性表達(dá)腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生并釋放多種內(nèi)源性DC激活因子熱休克蛋白HSPsATP、GTP、mRNA、DNA及其代謝代謝產(chǎn)物UricＡcid等。核蛋白如HMBG1(HighMobilityGroupB1)正常情況下這些分子位于細(xì)胞內(nèi)，但在損傷情況下可以釋放至細(xì)胞外，激活DC。我們的工作假說(shuō)：HIFU-treatmentreleaseofcytoplasmcomponentsactivationofDCs

Whatwewanttoknow:HowmuchcytoplasmcomponentscanbereleasedfromHIFU-treatedtumorcellsWhetherthereleasedcytoplasmcomponentscanactivateDCsWhethertheHIFU-triggeredDCactivationcanbreakdowntheimmunetolerancepromoteT-celltoactKillingoftumorcellHIFU實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)：超聲的熱效應(yīng)調(diào)整超聲的聲場(chǎng)參數(shù)可獲得不同特點(diǎn)的溫度變化曲線(xiàn)。

HIFU能對(duì)腫瘤組織內(nèi)0.3～1mm范圍升溫至70℃以上而鄰近2mm范圍內(nèi)則迅速降溫至50℃以下。HIFU激活HSP的基因表達(dá)HSPs的抗腫瘤免疫活性已引起廣泛的關(guān)注，因此，HIFU誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生HSPs的生物學(xué)效應(yīng)如能適當(dāng)加以利用，可以增強(qiáng)HIFU的免疫調(diào)控能力，具有重要的進(jìn)一步研究的價(jià)值。Control55℃-10s65℃-10s75℃-10s85℃-10sHSPGeneactivationinvivo(Hsp70B-Luciferase)HSPGeneactivationinvitro(Hsp70B-GFP)PhaseContrastFluorescence2mmXYZ超聲空化效應(yīng)及其引起的腫瘤細(xì)胞機(jī)械性損傷和內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)的局部釋放空化效應(yīng)（Cavitation)：組織間的微氣泡在超聲波的負(fù)壓相內(nèi)迅速增大，又在正壓相內(nèi)被急劇壓縮至崩潰，產(chǎn)生瞬間的高壓和強(qiáng)大的沖擊波，使氣泡周?chē)?xì)胞的膜性結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致細(xì)胞崩潰。超聲空化效應(yīng)在HIFU發(fā)展之初一般被盡量避免，但隨后研究發(fā)現(xiàn)空化效應(yīng)可以提高HIFU的治療效果。熱效應(yīng)HIFUvs

機(jī)械性HIFUThermalHIFU:采用較低的超聲壓力以避免誘發(fā)空化效應(yīng)，但采用較高的占空比以達(dá)到HIFU治療中的快速升溫（5s內(nèi)溫度上升至80℃），以模擬傳統(tǒng)HIFU單純的熱效應(yīng)MechanicalHIFU:采用較高的超聲壓力以誘發(fā)強(qiáng)空化效應(yīng)，但采用極低的占空比（%DutyCycle）以避免溫度的快速升高，降低HIFU的熱效應(yīng)TheoutputparametersofThermalandmechanicalHIFUtreatmentsininvitroexperimentsOutputParametersThermalHIFUMechanicalHIFUModulationBurstModeBurstModeFrequency(MHz)1.11.1PRF(Hz)2004P+(MPa)12.031.7P-(MPa)6.710.7DutyCycle(%)303Treatmentduration5s3×10s#PRF:pulserepetitionfrequency.#atanintervalof10s

ThephysicalparametersoftheHIFUexposureconditionsininvivoexperimentTreatmentStrategyP+(Mpa)P-(Mpa)DutycycleDuration(s)Ispta(w/cm2)Mechanical34.112.52%30723Thermal19.97.7100%312751細(xì)胞損傷和細(xì)胞內(nèi)容物釋放：體外實(shí)驗(yàn)：機(jī)械性HIFU導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的機(jī)械性破碎，內(nèi)容物完全釋放；熱效應(yīng)HIFU則導(dǎo)致凝固性死亡和內(nèi)容物的不完全釋放，對(duì)熱敏感的危險(xiǎn)因子如HSP60變性失活，僅對(duì)熱穩(wěn)定的危險(xiǎn)因子如ATP得以不完全釋放。從HIFU損傷的腫瘤細(xì)胞釋放的內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)對(duì)DC的激活作用

Up-regulatedexpressionofCD80andCD86andenhancedsecretionofIL-12byDCsafterexposedtosupernatantsofMC-38tumorcellstreatedwithmechanicalorthermalHIFUExposureMeanFluorescenceIntensityIL-12secretionGroupCD80CD86(pg/ml)Medium127±6.1302±30.216.1±3.8Non-treatmentcontrol128±12.4308±26.540.3±5.0MechanicalHIFU154±2.8a402±8.5a111.2±8.9bThermalHIFU145±5.0a372±7.8a57.9±2.5a經(jīng)機(jī)械性HIFU裂解的腫瘤細(xì)胞上情可刺激體外培養(yǎng)的DC高表達(dá)CD80、CD86，并分泌大量的IL-12。比較經(jīng)熱效應(yīng)HIFU作用的腫瘤細(xì)胞上清，雖仍具有激活DC的作用，但生物活性明顯低于前者。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：熱效應(yīng)HIFU可在3s內(nèi)使組織溫度上升至75度，但幾乎檢測(cè)不到空化效應(yīng)；機(jī)械性HIFU處理時(shí)瘤內(nèi)溫度控制在55度以下，但引起強(qiáng)空化效應(yīng)。不同的HIFU治療所致的腫瘤組織損傷mechanical(left)andthermal(right)HIFUtreatmentHIFU治療引起的DC瘤內(nèi)聚集Day1Day2

Non-treatmentThermalHIFUMechanicalHIFUHIFU治療引起的引流淋巴結(jié)腫大和DC遷移CFSECD11ca

HIFU誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答和對(duì)腫瘤再攻擊的保護(hù)作用：經(jīng)HIFU治療的荷瘤小鼠體內(nèi)檢測(cè)到顯著增強(qiáng)CTL應(yīng)答并對(duì)腫瘤細(xì)胞的再次攻擊產(chǎn)生保護(hù)作用。熱效應(yīng)HIFU誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答低于機(jī)械性HIFU。研究結(jié)論：HIFU腫瘤治療中從損傷的腫瘤細(xì)胞局部釋放的內(nèi)源性的危險(xiǎn)信號(hào)激活了DC的成熟,是HIFU增強(qiáng)抗腫瘤免疫的重要機(jī)制.提示HIFU治療中過(guò)渡的熱效應(yīng)由于導(dǎo)致內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)的部分失活不利于抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)，應(yīng)強(qiáng)調(diào)HIFU適當(dāng)?shù)臒嵝?yīng)并充分利用空化效應(yīng)造成的腫瘤機(jī)械性損傷。HIFU有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的潛力，目前的HIFU治療策略并未發(fā)揮出其免疫調(diào)控的最大潛力。進(jìn)一步優(yōu)化HIFU治療的策略，強(qiáng)調(diào)HIFU適當(dāng)?shù)臒嵝?yīng)并充分利用超聲空化效應(yīng)導(dǎo)致的機(jī)械性損傷，誘生內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)并促使其最大程度的局部釋放，增強(qiáng)其激活DC，誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答的效能。下一步的工作打算：將HIFU技術(shù)