菌種傳代與保藏

菌種的傳代與保藏

藥品檢驗(yàn)所

一、菌種保藏的意義如藥品中的控制菌檢查使用的陽(yáng)性對(duì)照菌須防止因?qū)掖蝹鞔龟?yáng)性對(duì)照菌的典型生物學(xué)特征發(fā)生變化及菌株的死亡，保證到達(dá)菌種長(zhǎng)期正確的形態(tài)；如藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)過(guò)程中，檢出的可疑致病菌須妥善保藏，以到達(dá)進(jìn)一步鑒定的目的，保證用藥平安。

二、菌種代號(hào)的意義

國(guó)內(nèi)藥品微生物檢驗(yàn)所用的菌種代號(hào)是CMCC〔F〕或CMCC〔B〕CMCC——中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心B——代表細(xì)菌，F(xiàn)——代表真菌。大腸埃希菌[CMCC(B)44102]乙型副傷寒沙門桿菌[CMCC(B)50094]銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]生孢梭菌[CMCC(B)64941]枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]短小芽孢桿菌[CMCC(B)63202]白色念珠菌[CMCC(F)98001]黑曲霉[CMCC(F)98003]

三、常用菌種保藏方法

(一)菌種保藏的原理根據(jù)微生物的菌種生理、生化特性，在人工創(chuàng)造的條件下盡量降卑微生物細(xì)胞的代謝強(qiáng)度，使細(xì)胞根本處于休眠狀態(tài)，生長(zhǎng)繁殖受到抑制但又不至于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、枯燥、缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物的代謝作用。低溫、枯燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。選擇保藏方法時(shí)，首先應(yīng)考慮方法能否長(zhǎng)期地保持菌種原有的特性，同時(shí)也應(yīng)兼顧到方法的經(jīng)濟(jì)和簡(jiǎn)便。在實(shí)際工作中，往往多種條件同時(shí)使用,以提高保藏效果。〔二〕菌種保藏步驟①挑選特征典型的純菌菌落；②確定保藏的適宜菌體形態(tài)；③選擇最適宜的保藏方法；④定期對(duì)保藏菌種進(jìn)行檢查，觀察是否發(fā)生變化，假設(shè)有變化，須改變保藏方法。保藏期滿應(yīng)及時(shí)進(jìn)行移種。1.瓊脂斜面低溫保存法

〔1〕方法：將經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接種在斜面〔某些特殊菌種可用液體培養(yǎng)基〕上，按規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)，待充分生長(zhǎng)后，把培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮紙保好，為減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長(zhǎng)保藏時(shí)間，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔2~3個(gè)月移種一次，繼續(xù)進(jìn)行保藏。假設(shè)用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，一般可保藏半年至一年。有的甚至更長(zhǎng)時(shí)間。〔2〕適用范圍：細(xì)菌、酵母菌、霉菌保藏。大腸桿菌斜面滕黃微球菌斜面生孢梭菌白色念珠菌

需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基改進(jìn)馬丁瓊脂培養(yǎng)基黑曲霉改進(jìn)馬丁瓊脂斜面不同培養(yǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)形態(tài)黑曲霉改進(jìn)馬丁瓊脂斜面典型斜面正面為黑褐色厚絨狀，色澤均一，不應(yīng)有雜色；斜面?zhèn)让鏌o(wú)色，接近菌層培養(yǎng)基略帶黃色。黑曲霉孢子相當(dāng)穩(wěn)定，可以保存于4℃0.9%氯化鈉溶液中較長(zhǎng)時(shí)間，作為孢子懸液儲(chǔ)藏液使用。由此可以減少菌液制備工作量和反復(fù)操作黑曲霉的風(fēng)險(xiǎn)。各類菌種保藏條件及時(shí)間

菌種培養(yǎng)基保存溫度傳種時(shí)間細(xì)菌一般多用于營(yíng)養(yǎng)瓊脂或根據(jù)菌種規(guī)定選用培養(yǎng)基4~6℃芽孢桿菌3~6個(gè)月，其它細(xì)菌每個(gè)月酵母菌一般用麥芽汁瓊脂或麥芽汁酵母膏瓊脂4~6℃一般4~6個(gè)月絲狀真菌一般用PDA瓊脂、蔡氏瓊脂或麥芽汁瓊脂等4~6℃每4個(gè)月移植一次（每2個(gè)月移植一次）〔3〕特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是——簡(jiǎn)便，易于推廣；一般不需要另選擇保藏用培養(yǎng)基；對(duì)大多數(shù)微生物都適用。缺點(diǎn)是——保藏期太短；傳代次數(shù)多，易發(fā)生變異及污染。〔4〕本卷須知：實(shí)驗(yàn)用的菌種應(yīng)是生命活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物，至少應(yīng)是第三代的培養(yǎng)物。生孢梭菌可用庖肉培養(yǎng)基或流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基〔前者效果更佳〕。必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動(dòng)或生霉，如有異常應(yīng)及時(shí)處理。每次移植后，應(yīng)與原菌種的編號(hào)、名稱逐一核對(duì)，確證培養(yǎng)基特征和純度無(wú)誤后再繼續(xù)保藏。保藏菌種的培養(yǎng)基應(yīng)無(wú)糖，假設(shè)含糖，一般小于2%為宜，以免產(chǎn)酸過(guò)多，影響菌種存活。保藏溫度和時(shí)間都不是絕對(duì)的，個(gè)別菌種不宜低溫保存。如銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，不宜用本法保存。

2、液體石蠟保存法：

本法是用液體石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種的生理生化水平，并可防止水分蒸發(fā)，從而延長(zhǎng)菌種的保藏期。

〔1〕方法：將菌種接種于斜面或穿刺于0.3~0.5%瓊脂半固體高層培養(yǎng)基中，培養(yǎng)好備用。取化學(xué)純的液體石蠟裝在試管中，每管10~15ml，加塞，瓶口包上紙，121℃高壓滅菌30min，取出置37℃溫箱或110~170℃烤箱中1~2h或枯燥器內(nèi)除去液體石蠟中的水分。將上述液體石蠟參加培養(yǎng)好的菌種試管內(nèi)，液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基最上端1㎝為宜，將試管直立，放入4℃冰箱中保藏。適用范圍：適用于保藏局部霉菌，酵母菌和放線菌，對(duì)細(xì)菌保藏效果較差。

液體石蠟對(duì)各類菌種保藏效果

菌種菌株數(shù)保存時(shí)間（年）存活率（%）細(xì)菌霉菌酵母菌放線菌87586400380552420.983.688.991.3各類菌種保藏條件及時(shí)間〔3〕特點(diǎn)：本方法簡(jiǎn)便易行，是實(shí)驗(yàn)室常用的一種保藏方法，該法主要使菌種與空氣隔絕?！?〕本卷須知：①保藏時(shí)，用新鮮培養(yǎng)物接種，應(yīng)檢查純度和特征后，方可進(jìn)行保藏。②使用菌種時(shí)，先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊，再用接種針挑取培養(yǎng)物接種到新鮮斜面上培養(yǎng)，待長(zhǎng)出新培養(yǎng)物后，再移種一次到新斜面上即可使用。

③將沾有少量液體石蠟的接種針浸于95%酒精中片刻，再燒灼滅菌，以免直接在酒精燈下燒灼時(shí)，液體石蠟四濺，引起污染。④液體石蠟在菌種管中高出培養(yǎng)基的高度要嚴(yán)格控制，如太多，會(huì)影響菌種交換氣體，使保藏效果不好；如太少，斜面容易枯燥，將縮短保藏期。一般以高出斜面1㎝為宜。

⑤制備無(wú)菌液體石蠟時(shí)，每管裝量不能太多，否那么分裝到菌種培養(yǎng)基中易造成污染。3、半固體瓊脂培養(yǎng)基〔0.5%〕4、液體石蠟保存

3、其他保存方法簡(jiǎn)介

枯燥保藏法懸液保藏法液氮保藏法梭-氏真空枯燥保藏法真空枯燥保藏法冷凍枯燥保藏法

標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏管

四、試驗(yàn)用菌種的培養(yǎng)傳代方法

程序：凍干菌〔0代〕營(yíng)養(yǎng)肉湯復(fù)蘇〔1代〕接種〔斜面或肉湯2代〕菌種傳代〔3、4、5代〕5代后銷毀檢定用標(biāo)準(zhǔn)菌種，由中國(guó)藥品生物檢定所提供，為冷凍枯燥菌種。菌種的復(fù)蘇與保存在專用無(wú)菌室或超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。

2菌種的傳代與保存

斜面接種時(shí)的無(wú)菌操作〔1〕接種滅菌〔2〕開啟試管塞〔3〕管口滅菌〔4〕挑起菌苔〔5〕接種〔6〕塞旯、好試管塞方法2：菌斜面營(yíng)養(yǎng)肉湯別離平板菌斜面如果菌落形態(tài)不典型可純化，按以下方法傳代〔別離菌落〕：用接種環(huán)取上述菌管〔斜面〕菌苔少許接種置營(yíng)養(yǎng)肉湯中(5ml/支,已滅菌),置35~37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)后，再用接種環(huán)取培養(yǎng)好的營(yíng)養(yǎng)肉湯菌懸液〔濃菌液〕，接種于別離平板，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)，用接種針選典型菌落劃線于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。一般同時(shí)接種幾支管，其中一支用于以后菌種傳代或接種到半固體瓊脂培養(yǎng)基中，其它用做工作菌種。

平板劃線別離法1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法

常用別離平板：大腸埃希菌——EMB瓊脂平板紫黑色有金屬光澤，外表光滑，圓形，凸起銅綠假單胞菌—溴化十六烷三甲銨瓊脂培養(yǎng)基

扁平，無(wú)定型，周邊擴(kuò)散，外表濕潤(rùn)，灰白色，周圍有藍(lán)綠色素?cái)U(kuò)散金黃色葡萄球菌—甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環(huán)沙門菌——SS瓊脂平板無(wú)色，透明或半透明，光滑濕潤(rùn)的圓形菌落顯微鏡檢查將菌種作革蘭氏染色，在顯微鏡觀察制片步驟：涂片—枯燥—固定—染色—鏡檢革蘭氏染色步驟：初染--媒染--脫色--復(fù)染制好片后先用低倍顯微鏡再用油鏡觀察革蘭氏色陽(yáng)性菌為紫色革蘭氏色陰性菌為紅色

革蘭氏染色1.初染：滴加結(jié)晶紫染液1～2滴于標(biāo)本菌膜上。1min后，用水沖洗，并傾去玻片上的余水。2.媒染：加革蘭氏碘液1～2滴于菌膜上，1min后，用水沖洗，傾去玻片上的余水。3.脫色：加95%酒精1～2滴于菌膜上，輕輕晃動(dòng)玻片，直到不再有紫色脫出為止，約0.5min，用水沖洗，傾去玻片上余水。4.復(fù)染：加稀釋石炭酸復(fù)紅1～2滴于菌膜上，1min后，用水沖洗，傾去玻片上余水。用吸水紙輕輕吸干，待標(biāo)本枯燥后，用油鏡觀察。

大腸埃希菌：革蘭氏陰性，短小桿菌沙門菌：革蘭氏陰性，桿菌銅綠假單胞菌：革蘭氏陰性，桿菌金黃色葡萄球菌：革蘭氏陽(yáng)性，葡萄串狀球菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌

3菌懸液的制備

取上述培養(yǎng)好的菌種斜面移入接種室或凈化工作臺(tái)，放置室溫后,用接種環(huán)取菌苔少許接種置營(yíng)養(yǎng)肉湯中(5ml/支,已滅菌),將已接種畢的細(xì)菌管置35~37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)，取出備用。一般于冰箱中保存可用7天。

4對(duì)照用菌液制備

取上述培養(yǎng)好的營(yíng)養(yǎng)肉湯菌懸液〔濃菌液〕1ml，加到9ml0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液混勻，為10-1，再取另一只吸管吸取10-1菌液1ml加到9ml0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液混勻，為10-2……以此類推，稀釋至含活菌數(shù)在50~100個(gè)。用平板計(jì)數(shù)。此稀釋菌液用于試驗(yàn)后加陽(yáng)性對(duì)照，可在1天內(nèi)使用。菌種菌種

工作菌種培養(yǎng)基菌懸液對(duì)照菌液大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面營(yíng)養(yǎng)肉湯0.9%氯化鈉溶液沙門菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面營(yíng)養(yǎng)肉湯0.9%氯化鈉溶液金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面營(yíng)養(yǎng)肉湯0.9%氯化鈉溶液銅綠假單胞菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面營(yíng)養(yǎng)肉湯0.9%氯化鈉溶液生孢梭菌硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基0.9%氯化鈉溶液白色念珠菌真菌瓊脂斜面真菌培養(yǎng)基0.9%氯化鈉溶液

五、菌種保管

?菌種保管應(yīng)有專人負(fù)責(zé)，保存與加鎖的冰箱中或特制的白鐵箱中加鎖置陰暗處，確保菌種平安。因工作變動(dòng)時(shí)，必須做好交接工作。?菌種應(yīng)有詳細(xì)登記本，包括名稱、