生化 第16章 DNA的生物合成學(xué)習(xí)課件

本學(xué)期后五次單元測試安排5月21日DNA生物合成，RNA生物合成6月9日蛋白質(zhì)合成，基因表達(dá)調(diào)控6月24日第四篇授課內(nèi)容5月26日第一篇第二次測試6月16日第二篇第二次測試均為是非題，每篇50個(gè)題目，時(shí)間20分鐘,21:30-21:50每次45個(gè)題目，時(shí)間30分鐘，21:30-22:00

DNA的合成及重組

DNABiosynthesisandRecombination第十六章DNA生物合成DNA復(fù)制（DNA指導(dǎo)的DNA合成）逆轉(zhuǎn)錄

(逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA指導(dǎo)的DNA合成)校正復(fù)制中可能出現(xiàn)的錯(cuò)誤，并修復(fù)受到損傷的DNA細(xì)胞中酶促修復(fù)系統(tǒng)自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移的基本方式基因組復(fù)制的主要特點(diǎn)TheGeneralfeaturesofGenomeReplication

第一節(jié)一、基因組是細(xì)胞或病毒全部遺傳信息的總和

含有一種生物的一整套遺傳信息的遺傳物質(zhì)，稱為基因組（genome）。在真核生物體中，基因組是指一套完整單倍體DNA（染色體DNA）和線粒體DNA的全部序列，既包括編碼序列，也包括非編碼序列。二、基因組DNA復(fù)制具備一些共同特征基因組DNA都具有固定的復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制過程中形成復(fù)制泡和復(fù)制叉復(fù)制的基本單位稱為復(fù)制子

半保留復(fù)制方式保證遺傳信息的忠實(shí)傳遞

半不連續(xù)復(fù)制克服了DNA空間結(jié)構(gòu)對DNA新鏈合成的制約

復(fù)制起點(diǎn)由多個(gè)短重復(fù)序列組成

DNA復(fù)制必須有引物復(fù)制起點(diǎn)（origin）：指DNA復(fù)制所必需的一段特殊的DNA序列?；蚪MDNA都具有固定的復(fù)制起始點(diǎn)雙螺旋DNA復(fù)制時(shí)，復(fù)制區(qū)生長點(diǎn)的結(jié)構(gòu)呈Y形或叉形，稱之為復(fù)制叉。復(fù)制過程中形成復(fù)制泡和復(fù)制叉目錄從一個(gè)DNA復(fù)制起點(diǎn)起始的DNA復(fù)制區(qū)域，它是一個(gè)獨(dú)立復(fù)制單位，包括復(fù)制起點(diǎn)和終點(diǎn)。復(fù)制子（replicon）復(fù)制的基本單位稱為復(fù)制子

半保留復(fù)制方式保證遺傳信息的忠實(shí)傳遞（1）全保留式（conservative），即恢復(fù)原來的DNA雙螺旋，并產(chǎn)生一個(gè)新的子代DNA雙螺旋；（2）半保留式（semiconservative），即新老搭配，由一條新合成的DNA鏈和一條復(fù)制模板鏈配對產(chǎn)生子代雙螺旋DNA；（3）散布式（dispersive），即復(fù)制模板鏈被分成許多小片段，散布于子代DNA中。兩條新合成的DNA鏈和兩條原來的復(fù)制模板鏈之間的結(jié)合方式可能性：密度梯度實(shí)驗(yàn)——實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制方式含重氮-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第二代梯度離心結(jié)果前導(dǎo)鏈（leadingstrand）:DNA復(fù)制時(shí)，一條鏈的合成方向和復(fù)制叉前進(jìn)方向相同，可以連續(xù)復(fù)制合成的新鏈。后隨鏈（laggingstrand）:另一條鏈的合成方向與復(fù)制叉前進(jìn)方向相反，不能連續(xù)復(fù)制，只能分成若干小片段分別合成，然后連接起來形成新鏈。后隨鏈中的小片段稱為岡崎片段（Okazakifragments)。半不連續(xù)復(fù)制克服了DNA空間結(jié)構(gòu)對DNA新鏈合成的制約前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而后隨鏈不連續(xù)復(fù)制，即DNA半不連續(xù)復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)的一般特征:由多個(gè)獨(dú)特的短重復(fù)序列組成。短重復(fù)序列被多亞基的復(fù)制起始因子所識別并結(jié)合。一般富含AT，利于雙螺旋DNA解旋，以產(chǎn)生單鏈DNA復(fù)制模板。復(fù)制起點(diǎn)由多個(gè)短重復(fù)序列組成E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

同向重復(fù)序列

反向重復(fù)序列5

3

5

3

酵母復(fù)制起點(diǎn)為自主復(fù)制序列（autonomouslyreplicatingsequences，ARS）：酵母染色體含有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。元件A(富含A/T的共有序列)：結(jié)合一個(gè)特異的蛋白質(zhì)復(fù)合物──復(fù)制起點(diǎn)識別復(fù)合物(ORC)。

3個(gè)序列(B1、B2和B3)可以增加復(fù)制起點(diǎn)的效率，其中B2的9個(gè)堿基與上述ARS共有序列相同。酵母復(fù)制起始點(diǎn)DNA聚合酶不能從游離的核苷酸開始合成DNA鏈，必須由引物（primer）提供自由的3

-OH末端，通過加入核苷酸使之不斷延伸。所有細(xì)胞和多數(shù)病毒的DNA復(fù)制，首先利用模板合成一段RNA引物，這一過程為引發(fā)（priming）。RNA引物5

端的第一個(gè)核苷酸通常是pppA（個(gè)別為pppG）。DNA復(fù)制必須有引物1.多數(shù)DNA復(fù)制使用RNA引物

174等噬菌體以雙鏈環(huán)形DNA的一條鏈上產(chǎn)生切口處的3

-OH為引物；腺病毒及某些線性DNA病毒以結(jié)合于病毒DNA的5

端磷酸基團(tuán)的末端蛋白上的dCTP的3

-OH為引物開始復(fù)制。2.個(gè)別DNA復(fù)制以DNA或核苷酸為引物不同基因組DNA通過不同的模式

進(jìn)行復(fù)制真核生物基因組DNA復(fù)制過程涉及反轉(zhuǎn)錄基因組單鏈DNA通過復(fù)制中間體完成復(fù)制

有的基因組DNA通過RNA中間體進(jìn)行復(fù)制雙鏈環(huán)狀DNA也有不同的復(fù)制方式不同基因組RNA通過不同的

模式進(jìn)行復(fù)制基因組雙鏈RNA復(fù)制過程是雙鏈復(fù)制

基因組單鏈正鏈RNA以負(fù)鏈為模板進(jìn)行復(fù)制

基因組單鏈負(fù)鏈RNA以正鏈RNA為模板進(jìn)行復(fù)制

反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組RNA通過DNA中間體進(jìn)行復(fù)制

DNA復(fù)制過程

ProcessofDNAReplication第二節(jié)E.coli上有一個(gè)固定的復(fù)制起始點(diǎn),在第82等分位點(diǎn)上,稱為oriC。oriC跨度為245bp,含3組串聯(lián)重復(fù)序列(Tandemarray)和2組反向重復(fù)序列。串聯(lián)序列為識別區(qū)，反向序列富含AT，容易解鏈。有固定的復(fù)制起始點(diǎn)嗎？一、原核生物DNA復(fù)制體現(xiàn)了復(fù)制

的基本過程和特征（一）在復(fù)制起點(diǎn)解旋酶和多種因子形成復(fù)合物

1.E.coli復(fù)制起始需要6種蛋白質(zhì)因子

DnaA、DnaB、DnaC、HU、促旋酶（gyrase，即拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ）、單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandbindingprotein,SSB)2.解螺旋酶激活引發(fā)酶形成3.解旋還需要促旋酶和SSB

E.coliDNA復(fù)制起始結(jié)合oriC的4個(gè)9bp反向重復(fù)序列形成復(fù)制起始復(fù)合物。DnaA蛋白作用于oriC的3個(gè)13bp正向重復(fù)序列，DNA在這3個(gè)位點(diǎn)解鏈，形成開放型復(fù)合物（opencomplex）。5

3

解旋酶作用產(chǎn)生兩條復(fù)制模板鏈激活引發(fā)酶DnaG蛋白DnaB蛋白與引發(fā)酶結(jié)合，形成引發(fā)體DnaB蛋白使一條DNA鏈圍繞著另一條旋轉(zhuǎn)，消除解旋產(chǎn)生的張力。促旋酶SSB蛋白HU蛋白穩(wěn)定解旋后的單鏈DNA構(gòu)象，有助于解旋。DNA結(jié)合蛋白，對復(fù)制起促進(jìn)作用。HU蛋白能夠使DNA發(fā)生折疊。E.coli中DnaB結(jié)合引發(fā)酶DnaG，催化合成RNA引物，其序列始于pppAG，模板鏈序列3

-GTC-5

，引物長度一般11~12個(gè)堿基。（二）引發(fā)酶合成RNA引物負(fù)責(zé)切除RNA引物。（三）復(fù)制時(shí)聚合酶Ⅲ催化DNA合成而聚合酶Ⅰ切除引物DNA聚合酶Ⅰ可利用損傷尚未修復(fù)的DNA鏈作為模板合成DNA，但不能修復(fù)損傷。負(fù)責(zé)合成DNA。DNA聚合酶ⅢDNA聚合酶Ⅱ

亞基（130000）主要功能是合成DNA

亞基具有3

5

外切酶活性（校正功能）

亞基可增強(qiáng)其活性

亞基可能起組裝作用核心酶由

、

和

亞基組成：DNA聚合酶Ⅲ全酶結(jié)構(gòu)2個(gè)

-亞基分別和1個(gè)核心酶相互作用，其柔性連接區(qū)可以確保在復(fù)制叉1個(gè)全酶分子的2個(gè)核心酶能夠相對獨(dú)立運(yùn)動(dòng)，分別負(fù)責(zé)合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈。功能：

-復(fù)合物是DNA夾子加載蛋白，負(fù)責(zé)將可沿DNA鏈滑動(dòng)的一對

-亞基（DNA夾子）加載于DNA，使DNA聚合酶Ⅲ具有持續(xù)合成能力。

-復(fù)合物由6種亞基組成：

、

、

、

、

、

２個(gè)核心酶1個(gè)

-復(fù)合物（

、

、

、

、

、

6種亞基）可滑動(dòng)的DNA夾子（含1對

-亞基）DNA聚合酶Ⅲ全酶結(jié)構(gòu)全酶結(jié)構(gòu)包括：（二）復(fù)制的延長

1、聚合子代DNA：由DNA聚合酶催化，以3'→5'方向的親代DNA鏈為模板，從5'→3'方向聚合子代DNA鏈。在原核生物中，參與DNA復(fù)制延長的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中，是DNA聚合酶α(延長隨從鏈)和δ（延長領(lǐng)頭鏈）。

2、引發(fā)體移動(dòng)：引發(fā)體向前移動(dòng)，解開新的局部雙螺旋，形成新的復(fù)制叉，隨從鏈重新合成RNA引物，繼續(xù)進(jìn)行鏈的延長。

（三）復(fù)制的終止

1、去除引物，填補(bǔ)缺口：在原核生物中，由DNA聚合酶Ⅰ來水解去除RNA引物，并由該酶催化延長引物缺口處的DNA，直到剩下最后一個(gè)磷酸酯鍵的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一種特殊的核酸酶來水解，而岡崎片段仍由DNA聚合酶來延長。

5

3

外切酶：去除RNA引物3

5

外切酶：起校正作用DNA聚合酶活性：填補(bǔ)兩個(gè)岡崎片段之間的缺口DNA聚合酶Ⅰ有3個(gè)酶促活性結(jié)構(gòu)域:323個(gè)氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段：Klenow片段

604個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端枯草桿菌蛋白酶DNA-polⅠ2、連接岡崎片段：

在DNA連接酶的催化下，形成最后一個(gè)磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完整的DNA長鏈。

Tus蛋白具有反解旋酶（contra-helicase）活性，識別并結(jié)合ter序列中共有序列，阻止DnaB蛋白的解旋作用，從而抑制復(fù)制叉前進(jìn)。Tus蛋白除了使復(fù)制叉停止運(yùn)動(dòng)以外，還可能造成復(fù)制體解體。(四)Tus蛋白識別復(fù)制終點(diǎn)使復(fù)制終止在復(fù)制叉匯合點(diǎn)兩側(cè)約100kb處各有一個(gè)終止區(qū)（terD/A和terC/B）。當(dāng)oriC處于半甲基化狀態(tài)時(shí)，SeqA蛋白迅速結(jié)合半甲基化的GATC，阻止Dam甲基化酶與之結(jié)合，使復(fù)制起點(diǎn)不能被完全甲基化，同時(shí)阻止DnaA蛋白結(jié)合oriC。oriC的GATC被完全甲基化，DnaA蛋白就能與之結(jié)合，開始新的一輪復(fù)制。(五)DNA甲基化保證復(fù)制起點(diǎn)在每個(gè)復(fù)制周期中僅起一次作用E.coli復(fù)制起點(diǎn)oriC含有11個(gè)拷貝GATC，這一回文序列中的A是Dam甲基化酶的靶位點(diǎn)。在復(fù)制過程中，DNA每復(fù)制10bp，復(fù)制叉前方的模板DNA雙螺旋就要繞其長軸旋轉(zhuǎn)一周，產(chǎn)生正超螺旋。拓?fù)洚悩?gòu)酶是一種可逆的核酸酶。它們可共價(jià)結(jié)合DNA分子上的磷酸基團(tuán)，切斷磷酸二酯鍵。(六)DNA復(fù)制需要兩類DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶消除正超螺旋，使復(fù)制叉能夠順利前進(jìn)。維持E.coli、噬菌體和質(zhì)粒DNA復(fù)制起始模板DNA負(fù)超螺旋狀態(tài)。環(huán)形染色體復(fù)制后產(chǎn)生的兩個(gè)子染色體連環(huán)體解連環(huán)。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶功能：E.coIi的TopoⅠ只作用于負(fù)超螺旋DNA，消除負(fù)超螺旋。

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的功能：E.coli的TopoⅡ?qū)⑶胺疆a(chǎn)生的正超螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的功能E.coli

的TopoⅣ功能是將復(fù)制產(chǎn)生的兩個(gè)子染色體從連環(huán)體中分離出來，催化連環(huán)和去連環(huán)過程。二、真核生物DNA復(fù)制哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期DNA合成期G1G2SM?細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入S期及M期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。G1→S及G2→M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。?蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實(shí)施調(diào)控作用。Nurse,HartwellandHunt

discoveredtwoproteins,cyclin

andCDK(cyclindependentkinase),thatcontrolthetransitionfromonestagetoanother.Theseproteinsarecalledcheckpoints.SirPaulNurse真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制起始點(diǎn)比E.coli的oriC短。酵母DNA復(fù)制起始點(diǎn)含11bp富含AT的核心序列：A(T)TTTATA(G)TTTA(T),稱為自主復(fù)制序列(ARS,autonomousreplicationsequences)

。（一）復(fù)制的起始真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時(shí)序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步起動(dòng)。復(fù)制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿负蛷?fù)制因子(replicationfactor,RF)。增殖細(xì)胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在復(fù)制起始和延長中起關(guān)鍵作用。真核生物復(fù)制子多、岡崎片段短、復(fù)制叉前進(jìn)速度慢等；DNA復(fù)制從引發(fā)進(jìn)入延伸階段發(fā)生DNA聚合酶

/

轉(zhuǎn)換；切除岡崎片段RNA引物的是核酸酶RNAseHⅠ和FEN1等。真核生物與原核生物DNA復(fù)制的差異：Pol

負(fù)責(zé)合成引物Pol

負(fù)責(zé)DNA復(fù)制、核苷酸切除修復(fù)和堿基切除修復(fù)Pol

的功能與Pol

相似（其確切功能尚待定）Pol

可能和堿基切除修復(fù)有關(guān)Pol

負(fù)責(zé)線粒體DNA復(fù)制和損傷修復(fù)常見的真核DNA聚合酶有5種：拓?fù)洚悩?gòu)酶，去除負(fù)超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除復(fù)制叉前方產(chǎn)生的正超螺旋TolⅠ和TolⅡDNA雙螺旋解鏈，參與組裝引發(fā)體DNA解旋酶連接岡崎片段DNA連接酶Ⅰ核酸酶，切除RNA引物RNAseHⅠ核酸酶，切除RNA引物FEN1DNA復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)Pol

/

合成RNA-DNA引物Pol

/引發(fā)酶有依賴DNA的ATPase活性，結(jié)合于引物-模板鏈，激活DNA聚合酶，促使PCNA結(jié)合于引物-模板鏈RFC激活DNA聚合酶和RFC的ATPase活性PCNA單鏈DNA結(jié)合蛋白，激活DNA聚合酶，使解旋酶容易結(jié)合DNARPA功能蛋白質(zhì)真核DNA復(fù)制叉主要蛋白質(zhì)的功能(二)真核DNA復(fù)制叉主要蛋白質(zhì)的類型和功能與原核基本相似DNA聚合酶

（Pol

）分子含有4個(gè)亞基：1.DNA聚合酶

/引發(fā)酶復(fù)合物合成RNA-DNA引物p180：催化亞基p48：具有引發(fā)酶活性p58：p48的穩(wěn)定性和活性所必需的p70：與組裝引發(fā)體有關(guān)功能：合成RNA引物反應(yīng)過程：調(diào)節(jié)：磷酸化的調(diào)節(jié)作用Pol

/引發(fā)酶復(fù)合物首先，合成RNA引物；其次，利用DNA聚合酶活性將引物延伸，產(chǎn)生起始DNA（initiatorDNA，iDNA）短序列，形成RNA-DNA引物；最后，Pol

/引發(fā)酶脫離模板鏈DNA，發(fā)生DNA聚合酶轉(zhuǎn)換（switch）。結(jié)構(gòu)：

p70、p34和p11組成異源三聚體功能：

2.RPA的功能與E.coli的SSB相似復(fù)制蛋白A（replicationproteinA，RPA）結(jié)合單鏈DNA促使雙螺旋DNA解旋激活Pol

/引發(fā)酶活性為Pol

依賴復(fù)制因子C（RFC）和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）合成DNA所必需RPA三聚體與SV40T抗原結(jié)合，組裝引發(fā)體復(fù)合物所必需RPA參與DNA重組和修復(fù)p140結(jié)合PCNAp40、p37和p36組成穩(wěn)定的核心復(fù)合物，具有依賴DNA的ATPase活性p38可能在p140和核心復(fù)合物之間起連接作用3.RFC與E.coliDNA聚合酶Ⅲ的

-復(fù)合物功能相似復(fù)制因子C（replicationfactorC，RFC）結(jié)構(gòu)：有p140，p40，p38，p37、p365個(gè)亞基促使可滑動(dòng)的DNA夾子PCNA結(jié)合于引物-模板鏈，是Pol

在模板DNA鏈上組裝并形成具有持續(xù)合成能力全酶所必需的。RFC的功能：PCNA是Pol

的進(jìn)行性因子，使Pol

獲得持續(xù)合成能力。PCNA是協(xié)調(diào)DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、表觀遺傳和細(xì)胞周期調(diào)控的核心因子。PCNA水平是檢測細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)。PCNA能激活Pol

。4.PCN