上海大學-生物工藝學第7章-谷氨酸發(fā)酵

第七章

谷氨酸發(fā)酵氨基酸的制造是從1820年水解蛋白質(zhì)開始。1866年德國的立好生博士利用硫酸水解小麥面筋，分離出一種酸性氨基酸，依據(jù)原料命名為谷氨酸。日本從海帶汁液中提取了谷氨酸，并在1908年開始制造商品味之素——味精。1910年日本味之素公司用水解法生產(chǎn)谷氨酸，與食鹽配合出售。二次世界大戰(zhàn)后，美國提出用發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸。1956年日本協(xié)和發(fā)酵公司分離出一種新的細菌，它可以利用100克葡萄糖轉(zhuǎn)化為40克以上的谷氨酸。1957年發(fā)酵法味精正式商業(yè)性生產(chǎn)，標志著氨基酸發(fā)酵工業(yè)的誕生。60年代以來，直接用糖類發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸獲得成功。我國成為世界上最大的味精生產(chǎn)國。氨基酸的制備方法發(fā)酵法：發(fā)酵法又可分為直接發(fā)酵法與添加前體的發(fā)酵法。添加前體法是以氨基酸的中間產(chǎn)物為原料，用微生物法轉(zhuǎn)化為相應的氨基酸。提取法：將蛋白質(zhì)原料用酸水解，然后從水解液中提取氨基酸。目前，胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸仍用提取法生產(chǎn)。酶法：利用微生物細胞或微生物產(chǎn)生的酶來制造氨基酸。合成法：用化學合成法制造的氨基酸有DL-蛋氨酸、DL-丙氨酸，甘氨酸和苯丙氨酸。生產(chǎn)氨基酸的大國：日本、德國。世界氨基酸生產(chǎn)的三巨頭日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵；德國的德固沙。用于輸液制劑的生產(chǎn)。味精的產(chǎn)品特性

味精,也稱味素,因味精起源于小麥，俗稱麩酸鈉、谷氨酸鈉（分子式C5H8NO4Na）。

味精是無色至白色的柱狀結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末，含一分子結(jié)晶水，無氣味，易溶于水，微溶于乙醇，無吸濕性，對光穩(wěn)定，中性條件下水溶液加熱也不分解，一般情況下無毒性。味精有很濃的鮮味，被食用后，經(jīng)胃酸作用轉(zhuǎn)化為谷氨酸，消化吸收構(gòu)成蛋白質(zhì)并參與體內(nèi)其他代謝過程，有較高的營養(yǎng)價值。味精味精的使用是否安全？

自1970年起美國食品藥物管理局(FDA)與世界衛(wèi)生組織(WHO)的聯(lián)合食品專家委員會，就味精的安全性加以慎重研討，認為一般人味精攝取量可以達到一天0.12公克/公斤體重。此即表示體重50公斤的人，每天即使食用高達6公克的味精，連續(xù)食用一輩子也不會影響到身體的健康。1987年,聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織宣布,取消對味精的食用限量,

作為一種增加食品風味的調(diào)味料,味精不再需要評價其每日容許攝入量,消費者可以放心食用味精。味精安全性報告

美國食品藥物管理局（FDA）在1995年8月31日公布一份最新的報告，結(jié)論是：對一般人而言，食用正常消費量的味精是安全的，且無任何證據(jù)顯示食用味精和任何嚴重的或慢性的疾病有關(guān)。這份報告是美國食品藥物管理局（FDA）委托獨立的科學研究機構(gòu)——美國實驗生物學學會聯(lián)盟（FASEB）進行長達三年的研究評估后得出的。報告澄清了人們對味精于人體健康的疑慮。

還味精一個清白

美國FDA的研究報告，解除消費者的疑慮，澄清了一般人對味精的誤解，也使科學家改變研究態(tài)度，而能從正面的角度來思考味精這一種廣泛被使用的調(diào)味料，到底對人體有哪些重要性，這是二十一世紀的一個重要研究課題。

味精對人體的重要性

1、生物化學研究顯示，味精中的谷氨酸是生物體內(nèi)氨基酸和碳水化合物代謝的重要橋梁。2、美國Reeds博士的最新研究發(fā)現(xiàn)，飲食中的谷氨酸進入消化道時，提供消化道表面細胞代謝所需的大部分能量，也提供其合成必需氨基酸所需的材料。3、Schiffman教授的研究證實，食物中添加味精可以增加正常老人和患病老人的攝食量，也顯著地改善營養(yǎng)狀況和身體免疫力。

市售味精結(jié)晶味精，90％、80％、70％、60％等粉末味精。以80％最為常見，其余為精鹽。食鹽起助鮮兼作填充劑作用。稍有吸濕性，應密封防潮貯存。

一、氨基酸發(fā)酵氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本成分，8種必需氨基酸，人體只有通過食物來獲得。食品工業(yè)中，氨基酸可作為調(diào)味料，谷氨酸鈉、肌苷酸鈉、鳥苷酸鈉可作為鮮味劑，色氨酸和甘氨酸可作為甜味劑。食品中添加某些氨基酸可提高其營養(yǎng)價值。氨基酸使用的菌株

谷氨酸谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、黃色短菌桿、北京棒桿菌、鈍齒棒桿菌纈氨酸北京棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌丙氨酸

凝結(jié)芽孢桿菌脯氨酸鏈形寇氏桿菌

、黃色短桿菌賴氨酸黃色短桿菌

、乳糖發(fā)醇短桿菌

、谷氨酸棒桿菌蘇氨酸大腸桿菌、大腸桿菌鳥氨酸

谷氨酸棒桿菌

、黃色短桿菌亮氨酸黃色短桿菌酪氨酸氨酸棒桿菌表1

部分氨基酸及其生產(chǎn)用菌株

氨基酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵

以谷氨酸為例，谷氨酸的大量積累不是由于生物合成途徑的特異，而是菌體代謝調(diào)節(jié)控制和細胞膜通透性的特異調(diào)節(jié)以及發(fā)酵條件的適合。谷氨酸產(chǎn)生菌的主要特征1.

-酮戊二酸氧化能力微弱:

-酮戊二酸脫氫酶喪失或活性低；2.谷氨酸脫氫酶活性強；3.還原性輔酶Ⅱ(NADPH+H+)進入呼吸鏈能力缺陷或微弱；4.異檸檬酸裂解酶活力微弱；5.不利用谷氨酸；6.耐高糖耐高谷氨酸；7.CO2固定能力強；8.解除谷氨酸反饋抑制；9.具有向胞外分泌谷氨酸的能力。谷氨酸生產(chǎn)菌細胞膜的通透性

——向胞外分泌谷氨酸用能積累谷氨酸菌株做如下實驗:生物素充足時,細胞內(nèi)含大量谷氨酸,但培養(yǎng)液里幾乎不含谷氨酸；用溶菌酶消化細胞壁得到的原生質(zhì)體仍不分泌谷氨酸；當把原生質(zhì)體放入低滲溶液里,將其漲破,谷氨酸才排出；生物素亞適量時,培養(yǎng)液里含大量谷氨酸,細胞里含量少。結(jié)論:谷氨酸的分泌是由細胞膜控制?？刂萍毎ねㄍ感缘姆椒ǎ嚎刂屏字暮铣?；控制細胞壁的合成；選育溫敏突變株。生物素營養(yǎng)缺陷型作用機制：生物素是脂肪酸生物合成最初反應的關(guān)鍵酶乙酰CoA羧化酶的輔酶，參與脂肪酸合成。當磷脂合成量少到正常的1/2左右時，細胞變形，Glu向膜外泄漏?？刂脐P(guān)鍵：使用該類突變株必須限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素亞適量(5-10

g/L)。在發(fā)酵初期(0-8小時)，細胞正常生長，當生物素耗盡后，在菌的再次倍增時，開始出現(xiàn)異常形態(tài)細胞，即完成了細胞從生長型到積累型轉(zhuǎn)換。突變株

油酸營養(yǎng)缺陷型作用機制:油酸營養(yǎng)缺陷型喪失了合成油酸的能力，通過控制油酸使磷脂合成量減少到正常量的1/2左右?？刂脐P(guān)鍵:保證在培養(yǎng)基中油酸亞適量，完成細胞從生長型到生產(chǎn)型的轉(zhuǎn)換。其他

添加表面活性劑添加表面活性劑(如吐溫60)或不飽和脂肪酸(C16-18)，能造成細胞滲漏，積累谷氨酸。機理:兩者在脂肪酸合成時對生物素有拮抗作用，導致磷脂合成不足，形成不完整的細胞膜。關(guān)鍵:控制脂肪酸或表面活性劑的時間和濃度，必須在藥劑加入后，在這些藥劑存在下進行分裂，形成產(chǎn)酸型細胞。其他

添加青霉素機理:青霉素抑制谷氨酸生產(chǎn)菌細胞壁后期的合成，細胞膜在失去保護，在滲透壓的作用下受損，向外泄露谷氨酸?？刂脐P(guān)鍵:在對數(shù)生長期的早期(3-6小時)添加。添加青霉素后，倍增的菌體不能合成完整的細胞壁，完成細胞功能的轉(zhuǎn)換。

其他谷氨酸發(fā)酵強制控制工藝為了穩(wěn)產(chǎn)，克服培養(yǎng)基原料中某些成分不易控制帶來的影響，在谷氨酸發(fā)酵時可采取“強制控制”的方法，如:“高生物素高吐溫”或“高生物素高青霉素”的方法。控制方法:發(fā)酵培養(yǎng)基中預先配加一定量(過量)的純生物素，削弱每批原料中生物素含量變化的影響，高生物素還能促進菌體迅速增殖。再在菌體倍增的早期加入相對高的吐溫或青霉素，形成產(chǎn)酸型細胞。其他二、谷氨酸發(fā)酵的生化過程（1）是代謝控制發(fā)酵的典型代表（2）是目前代謝控制發(fā)酵中，在理論與實踐上最成熟的……整個過程可簡單的分為2個階段:第1階段是菌體生長階段；第2階段是產(chǎn)酸階段，谷氨酸得以大量積累。三、合成谷氨酸的生化途徑葡萄糖丙酮酸草酰乙酸檸檬酸琥珀酸透過細胞膜異檸檬酸α-酮戊二酸谷氨酸谷氨酸（一）、GA的生物合成途徑主要有：Glucose的酵解，EMPGlucose的有氧氧化，HMP

丙酮酸的有氧氧化，TCA循環(huán)乙醛酸循環(huán)途徑，DCA循環(huán)

CO2固定反應

α-KGA的還原氨基化

這6條途徑之間是相互聯(lián)系和相互制約的，如圖所示：CO2CO2固定α-KGA的還原氨基化NADPH（二）、GA生物合成的內(nèi)在因素從上圖可以看出，菌體要在葡萄糖含量10%以上的培養(yǎng)基上，合成5%以上的谷氨酸，是一種不正常的現(xiàn)象。GA產(chǎn)生菌必須具備以下條件：谷氨酸生產(chǎn)菌的生化特征—內(nèi)在因素

1、生物素缺陷型生物素缺陷型谷氨酸產(chǎn)生菌發(fā)酵時，通過控制生物素亞適量，引起菌種代謝失調(diào)，使谷氨酸得到大量積累。2、具有CO2

固定反應的酶系菌種能利用CO2

產(chǎn)生大量草酰乙酸，有利于谷氨酸的大量積累。3、α-KGA脫氫酶酶活性微弱或喪失是菌體生成并積累α-KGA的關(guān)鍵。從上圖可以看出，α-KGA是TCA循環(huán)的中間性產(chǎn)物，在α-KGA脫氫酶的作用下氧化脫羧生成琥珀酸輔酶A，在正常的微生物體內(nèi)它的濃度很低，也就是說，由α-KGA進行還原氨基化生成GA的可能性很少。只有當體內(nèi)α-KGA脫氫酶活性很低時，TCA循環(huán)才能夠停止，α-KGA才得以積累，為谷氨酸的生成奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。4、GA產(chǎn)生菌體內(nèi)的NADPH氧化能力欠缺或喪失（1）如上圖所示，NADPH是α-KGA還原氨基化生成GA必須物質(zhì)，而且該還原氨基化所需要的NADPH是與檸檬酸氧化脫羧相偶聯(lián)

的。（2）由于NADPH的在氧化能力欠缺或喪失，使得體內(nèi)的NADPH有一定的積累，NADPH對于抑制α-KGA的脫羧氧化有一定的意義。5、

產(chǎn)生菌體內(nèi)乙醛酸循環(huán)（DCA）的關(guān)鍵酶——異檸檬酸裂解酶該酶是一種調(diào)節(jié)酶，或稱為別構(gòu)酶，通過該酶酶活性的調(diào)節(jié)來實現(xiàn)DCA循環(huán)的封閉。DCA循環(huán)的封閉是實現(xiàn)GA發(fā)酵的首要條件。糖的代謝才能沿著α-酮戊二酸的方向進行，從而有利于谷氨酸的積累。6、菌體有強烈的L-谷氨酸脫氫酶活性α-KGA+NH4++NADPH==GA+NADP

L-谷氨酸脫氫酶，GA產(chǎn)生菌體內(nèi)該酶的酶活性很強，α-酮戊二酸易生成谷氨酸。該反應與異檸檬酸脫羧氧化相偶聯(lián)，反應機制：偶聯(lián)反應

α-KGANADPHα-KGAGANADP異檸檬酸L-谷氨酸脫氫酶異檸檬酸脫羧氧化（三）、GA生物合成的最理想途徑1.在前述GA合成所必需的條件的基礎(chǔ)上（……，封閉乙醛酸循環(huán)）體系不存在CO2固定反應，則有：3/2C6H12O6+NH4+→C5H9NO4+4CO2

產(chǎn)率：147/（180*3/2）==54.4%3/2GlucoseEMP丙酮酸+丙酮酸+丙酮酸CO2乙酰輔酶A+乙酰輔酶A+乙酰輔酶A檸檬酸（DCA循環(huán)封閉）谷氨酸不存在CO2固定反應草酰乙酸2.在前述GA合成所必需的條件的基礎(chǔ)上（……，封閉乙醛酸循環(huán)）存在CO2固定反應，則有：C6H12O6+NH4+→C5H9NO4+CO2

產(chǎn)率：147/180==81.7%GlucoseEMP丙酮酸+丙酮酸CO2CO2草酰乙酸（草酰乙酸羧化酶）乙酰輔酶A+C4二羧酸蘋果酸（蘋果酸合成酶）檸檬酸（DCA循環(huán)封閉）谷氨酸存在CO2固定反應可見，在GA的生物合成過程中，CO2固定反應對于產(chǎn)率的提高有著多么重要的作用。CO2固定反應(1)磷酸丙酮酸羧化酶的作用下磷酸丙酮酸+CO2+GTP==草酰乙酸+GDP(2)丙酮酸+CO2

==

草酰乙酸

酶：丙酮酸羧化酶(3)蘋果酸酶的作用下丙酮酸+CO2+NADH===蘋果酸+NAD需要Mn+做催化劑，所以，在GA發(fā)酵過程中需要向培養(yǎng)基中補充Mn+谷氨酸理論轉(zhuǎn)化率如果四碳二羧酸(草酰乙酸、蘋果酸)全部由CO2固定獲得，則1摩爾葡萄糖生成1摩爾的谷氨酸。C6H12O6+NH3+1.5O2→C5H9O4+CO2+3H2O

理論轉(zhuǎn)化率=147/180=81.7%實際上，發(fā)酵過程中不可能控制檸檬酸合成所需的C4二羧酸完全來自于CO2固定反應，體系也不可能完全不存在CO2固定反應，因此，GA發(fā)酵的糖酸轉(zhuǎn)化率應在：54.4%-81.7%。目前，國內(nèi)的GA生產(chǎn)企業(yè)的糖酸轉(zhuǎn)化率通常都在50%以內(nèi)？（1）企業(yè)計算的糖酸轉(zhuǎn)化率是把GA發(fā)酵前期菌體增殖時期消耗的葡萄糖計算在內(nèi)，而我們所計算的不包括這一部分葡萄糖，通常這一部分糖占總量的20%左右，當然與企業(yè)的技術(shù)水平有關(guān)。（2）TCA循環(huán)也不可能完全封閉；α-KGA也不可能完全轉(zhuǎn)化為GA；生成的GA也不可能完全分泌的細胞外；發(fā)酵液中還存在一定的殘?zhí)?，通常?.5%-0.7%之間。提高GA的潛力（1）強化CO2固定反應，具體措施：Mn+

，生物素？（2）控制溶氧濃度是非常重要的低的溶氧濃度，則丙酮酸向乳酸方向轉(zhuǎn)化……高的溶氧濃度，則NADPH有被氧化的可能，……（四）、生物素對GA發(fā)酵的影響GA產(chǎn)生菌大都是生物素的營養(yǎng)缺陷型，即：VH-生物素對發(fā)酵的影響是全面的，在發(fā)酵過程中要嚴格控制其濃度。

1.生物素對糖代謝的影響VH對于糖酵解有促進作用；

對丙酮酸的有氧氧化——乙酰輔酶A的生成也有促進作用，但兩者的促進作用不一樣，對前者大一些。這樣，培養(yǎng)基中如果有較豐富的VH，就會打破糖酵解與丙酮酸氧化之間的平衡，導致丙酮酸的積累，丙酮酸積累則可能導致乳酸的形成，乳酸生成，則使得碳源利用率降低，而且?guī)戆l(fā)酵液的pH值下降。另外，可以通過控制VH的濃度，以實現(xiàn)對于乙醛酸循環(huán)的封閉。封閉乙醛酸循環(huán)對于GA發(fā)酵的重要性！如何封閉乙醛酸循環(huán)呢？DCA循環(huán)的關(guān)鍵酶是異檸檬酸裂解酶，研究表明，該酶受以下幾個因素的影響：為醋酸誘導受琥珀酸阻遏，其活性受琥珀酸的抑制如何封閉乙醛酸循環(huán)呢？當VH缺乏時：（1）丙酮酸的有氧氧化會減弱(由于VH對TCA循環(huán)的促進作用)，則：乙酰輔酶A的生成量就會少，醋酸濃度降低，它的誘導作用降低；（2）VH對TCA循環(huán)的促進作用的降低，使得其中間產(chǎn)物琥珀酸的氧化速度降低，其濃度得到積累，這樣它的阻遏和抑制作用加強；兩者綜合的作用使得，異檸檬酸裂解酶的活性喪失，DCA循環(huán)得到封閉。2.生物素對氮代謝的影響由以上分析可知，當VH缺乏時，異檸檬酸裂解酶的活性減弱。當VH豐富時，異檸檬酸裂解酶的活性必然加強，則DCA循環(huán)正常進行，DCA循環(huán)的進行，一方面提供了大量的“中間性產(chǎn)物”，另一方面，菌體的能荷水平得到提高。前者是菌體增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，后者則是菌體增殖的能量的保證。這樣的結(jié)果是，有利于菌體的增殖和生長，則GA的生物合成就會受到影響，甚至停止，這在生產(chǎn)上，就是通常我們說的“只長菌，不產(chǎn)酸”的現(xiàn)象。

以上分析說明，GA發(fā)酵過程中，前期，菌體的增殖期，一定量的生物素是菌體增殖所必需的；而在產(chǎn)物合成期，則要限制生物素的濃度，以保證產(chǎn)物的正常合成。3.VH對菌體細胞膜通透性的影響3.VH對菌體細胞膜通透性的影響菌體進入產(chǎn)物合成期時，有GA的產(chǎn)生，如果能夠大量的把產(chǎn)物及時的排泄到細胞膜外，可以解除GA對L-谷氨酸脫氫酶活性的抑制作用，從而使由Glucose→GA的高效率轉(zhuǎn)化，反之，如果……。可見，改善細胞膜通透性的重要性。如何進行呢？VH-谷氨酸發(fā)酵菌，可以通過控制VH的濃度，來實現(xiàn)對菌體細胞膜通透性的調(diào)節(jié)。VH對細胞膜合成的影響主要是通過對細胞膜的主要成分——磷脂中的脂肪酸的生物合成來實現(xiàn)的，當限制了菌體脂肪酸的合成時，細胞就會形成一個細胞膜不完整的菌體。生物體內(nèi)脂肪酸的合成途徑如下：其中，將乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A的酶是乙酰輔酶A羧化酶，該酶的輔酶是VH，VH在此反應過程中起到傳遞CO2的作用。當培養(yǎng)基中VH的濃度較低時，細胞膜的合成就會受影響。葡萄糖丙酮酸+丙酮酸乙酰輔酶A乙酰輔酶Ａ乙酰輔酶A羧化酶CO2丙二酰輔酶AC4丙二酰輔酶ACO2C6CO2培養(yǎng)基中生物素限量時，胞內(nèi)AA92%胞外培養(yǎng)基中生物素豐富時，胞內(nèi)AA12%胞外

（五）、GA發(fā)酵的外在因素GA發(fā)酵是一個典型的代謝控制發(fā)酵，固然有其內(nèi)在的菌體特性，諸如：？（提問），但是正如任何事物發(fā)展的基本規(guī)律一樣，外在因素仍然有重要的作用，對于GA的發(fā)酵也是一樣。1.供氧濃度過量：NADPH的再氧化能力會加強，使α-KGA的還原氨基化受到影響，不利于GA的生成。供氧不足：積累大量的乳酸，使發(fā)酵液的pH值下降，不利于GA的產(chǎn)生，同時，一部分葡萄糖轉(zhuǎn)成了乳酸，影響了糖酸轉(zhuǎn)化率，降低了產(chǎn)物的產(chǎn)出率。2.NH4+濃度（1）影響發(fā)酵液的pH值（2）與產(chǎn)物的形成有關(guān)：NH4+過量，菌體增殖階段會抑制菌體生長，產(chǎn)酸階段Glu會受谷氨酰胺合成酶作用轉(zhuǎn)化為Gln；NH4+不足，不利于α-KGA的還原氨基化，

-酮戊二酸積累，引起反饋調(diào)節(jié)。NH4+與產(chǎn)物的形成NH4+的供給方式：（1）液氨（2）流加0.8%尿素3.磷酸鹽過量：（1）促進EMP途徑，打破EMP與TCA之間的平衡，積累丙酮酸，產(chǎn)生乳酸等……（2）產(chǎn)生并積累Val，Glucose丙酮酸+丙酮酸（焦磷酸硫胺素，TPP）活性乙醛α-乙酰乳酸ValVal合成途徑Val（1）可以抑制葡萄糖丙酮酸，使GA的生物合成受到阻止；（2）消耗丙酮酸，降低了糖酸轉(zhuǎn)化率；（3）發(fā)酵液中的Val存在，嚴重影響GA的結(jié)晶、提取。發(fā)酵過程中,要嚴格控制NH4

+

和P的含量4.發(fā)酵液的碳氮比發(fā)酵液中糖含量與谷氨酸發(fā)酵有密切關(guān)系。在一定范圍內(nèi)，谷氨酸的產(chǎn)量隨糖含量的增加而增加；但糖含量過高，滲透壓過大，對菌體生長不利，谷氨酸對糖的轉(zhuǎn)化率低。發(fā)酵液中還原糖的含量一般應控制在10%～13%。氮源是合成菌體細胞蛋白質(zhì)、核酸和谷氨酸的氨基來源，大約85%的氮源用于合成谷氨酸，15%用于合成菌體。谷氨酸發(fā)酵需要的氮源比一般發(fā)酵工業(yè)多得多，一般發(fā)酵工業(yè)碳氮比為100：0.2~2.0，谷氨酸發(fā)酵的碳氮比為100：15~21。在谷氨酸發(fā)酵過程中,應正確控制碳氮比。一般在菌體生長期碳氮比應大一些(氮低），在產(chǎn)酸期，碳氮比應小些(氮高）。在碳源和氮源的比為3∶1時，谷氨酸棒狀桿菌會大量合成谷氨酸，但當碳源和氮源的比為4∶1時，谷氨酸棒狀桿菌只生長而不合成谷氨酸？。5.生物素生物素對VH-營養(yǎng)缺陷型產(chǎn)生菌的生長繁殖、代謝產(chǎn)物的影響非常明顯。生物素過量時，丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗幔悪幟仕徂D(zhuǎn)變?yōu)殓晁?，菌體生長繁殖快；同時，生物素又促進菌體細胞膜通透性障礙物的生物合成，使菌體不能及時將細胞內(nèi)的谷氨酸排出，谷氨酸合成途徑受阻，發(fā)酵液中由菌種細胞排出的谷氨酸僅占氨基酸總量的12%；生物素亞適量時，細胞膜通透性增強，細胞內(nèi)的谷氨酸能及時排出，有利于谷氨酸的積累，發(fā)酵液內(nèi)由菌體細胞排出谷氨酸能達總氨基酸的92%左右。因此，要根據(jù)發(fā)酵時期來控制生物素的含量。6.發(fā)酵溫度谷氨酸發(fā)酵前期應采取菌體生長最適溫度，即30～32℃。溫度過低，菌體生長繁殖慢；溫度過高，菌體易衰老，生產(chǎn)中表現(xiàn)為DO值增長慢、耗糖慢、pH值高，最終發(fā)酵周期長、產(chǎn)酸少。發(fā)酵中、后期菌體生長基本停止，為積累大量谷氨酸，應適當提高發(fā)酵溫度；但溫度過高，酶易失活，谷氨酸生成受阻。7.pH值1）pH值對谷氨酸產(chǎn)生菌生長的影響谷氨酸生產(chǎn)菌象其它微生物一樣，有最適生長pH值范圍，當高于或低于這個值時:(1)體內(nèi)酶受到抑制，菌體新陳代謝受阻，生長停滯；(2)細胞膜所帶電荷改變，從而改變細胞膜的滲透性，影響菌體對營養(yǎng)的吸收和代謝產(chǎn)物的排出；(3)影響培養(yǎng)基組分和中間代謝產(chǎn)物的離解，從而影響菌體對這些物質(zhì)的利用。2）pH值對谷氨酸積累的影響谷氨酸脫氫酶是合成谷氨酸的主要酶，它的最適pH為7.0～7.2，當發(fā)酵液的pH值偏酸時(pH5.0-5.8)，谷氨酸脫氫酶受到抑制，代謝向著生成谷氨酰胺和乙酰谷氨酰胺的方向進行。在發(fā)酵后期由于耗用大量NH4+

，pH值下降，此時就要進行pH值調(diào)節(jié)，以保證發(fā)酵的正常進行。pH發(fā)生變化的主要原因：是培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的利用和代謝產(chǎn)物的積累。如當谷氨酸棒狀桿菌利用糖類物質(zhì)不斷生成谷氨酸時，培養(yǎng)液的pH就會下降。（而堿性物質(zhì)的積累和氨的生成等則會導致pH上升。）pH：前期pH（7.5~8.0），中后期pH7.0~7.6。通過采用流加尿素，氨水或液氨等辦法調(diào)節(jié)pH，補充氮源。8.通風

（同1.供氧濃度）通風的實質(zhì)就是供氧，并使菌體和培養(yǎng)基充分混合。谷氨酸產(chǎn)生菌為兼性好氧菌，在有氧、無氧的條件下都能生長，只是其代謝產(chǎn)物不同。在谷氨酸發(fā)酵過程中，通風必須適度。風量過大，氧氣充足，在長菌階段表現(xiàn)為耗糖慢、

菌體生長慢、pH值偏高；產(chǎn)酸階段，供氫體被氧化，谷氨酸合成受阻，積累α-酮戊二酸；

風量小，供氧不足，長菌階段表現(xiàn)為菌體生長快；在產(chǎn)酸階段，葡萄糖進入菌體后，進行不完全氧化，產(chǎn)物由谷氨酸變?yōu)槿樗帷?.泡沫谷氨酸發(fā)酵是好氣性發(fā)酵，通風和攪拌產(chǎn)生泡沫是正常的，但泡沫過多會帶來一系列問題：

(1)泡沫形成泡蓋時，代謝產(chǎn)生的氣體不能及時排出，妨礙菌體呼吸作用，影響菌體的正常代謝；(2)泡沫過多，發(fā)酵液會外溢，造成浪費和污染；(3)泡沫過多，易沖上罐頂，造成染菌。因此，在谷氨酸的發(fā)酵過程中控制泡沫是發(fā)酵成敗的關(guān)鍵。谷氨酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵條件與產(chǎn)物的關(guān)系控制因子發(fā)酵產(chǎn)品轉(zhuǎn)換氧氣乳酸或琥珀酸（通氣不足）←→谷氨酸（通氣充足）NH4+α-酮戊二酸（缺乏）←→谷氨酸（適量）←→谷氨酰胺（過量）pHN-乙酰谷氨酰胺（酸性）←→谷氨酸（中性或微堿性）磷酸纈氨酸（高濃度）←→谷氨酸生物素乳酸或琥珀酸（豐富）←→谷氨酸（缺乏）谷氨酸發(fā)酵過程中，生產(chǎn)菌種的特性、生長素、發(fā)酵溫度、pH值、通風和發(fā)酵產(chǎn)生的泡沫都是影響谷氨酸積累的主要因素。在實際生產(chǎn)中，只有針對存在的問題，嚴格控制工藝條件，才能達到穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的目的。假設(shè)人們想利用葡萄糖、谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)α-酮戊二酸，請你利用現(xiàn)有知識，設(shè)計一個大量積累α-酮戊二酸的方案?

菌種：對谷氨酸捧狀桿菌進行誘變處理，選育不能合成谷氨酸脫氫酶的菌種條件：氧（通風）、NH4+、C/N；pH、磷酸鹽、溫度、生物素、Mn+代謝的人工控制及其在發(fā)酵工業(yè)中的應用工業(yè)發(fā)酵的目的：大量積累人們所需要的微生物代謝產(chǎn)物。代謝的人工控制：人為地打破微生物的代謝控制體系，使代謝朝著人們希望的方向進行。人工控制代謝的手段：改變微生物遺傳特性(遺傳學方法）；控制發(fā)酵條件（生物化學方法）；改變細胞膜透性；總結(jié)1營養(yǎng)缺陷型菌株的應用

末端產(chǎn)物E對生長乃是必需的，所以，應在培養(yǎng)基中限量供給E，使之足以維持菌株生長，但又不至于造成反饋調(diào)節(jié)（阻遏或抑制），這樣才能有利于菌株積累中間產(chǎn)物C。（1）對于直線式代謝途徑：選育營養(yǎng)缺陷型突變株能積累中間代謝產(chǎn)物

AaBbCcDdE

(一)遺傳學方法(2)分支代謝途徑：情況較復雜，可利用營養(yǎng)缺陷型克服協(xié)同、或累加抗反饋抑制，積累末端產(chǎn)物，亦可利用雙重缺陷發(fā)酵生產(chǎn)中間產(chǎn)物ABCDEFG分支途徑——

賴氨酸發(fā)酵:谷氨酸棒桿菌的Hom–2抗反饋控制突變株的應用★抗反饋控制突變株——是指對反饋抑制不敏感或?qū)ψ瓒粲锌剐?，或兩者兼有之的菌株?！锟狗答伩刂仆蛔冎昕梢詮慕K產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株和營養(yǎng)缺陷性回復突變株中獲得。目標產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物賴氨酸S-（2氨基乙基）-L半胱氨酸-(AEC)蘇氨酸-氨基--羥基戊酸（AHV)異亮氨酸乙硫氨酸精氨酸D-精氨酸苯丙氨酸對氟苯丙氨酸3選育組成型突變株和超產(chǎn)突變株如果調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，以至產(chǎn)生無效的阻遏物而不能和操縱基因結(jié)合，或操縱基因突變，從而造成結(jié)構(gòu)基因不受控制的轉(zhuǎn)錄，酶的生成將不再需要誘導劑或不再被末端產(chǎn)物或分解代謝物阻遏，這樣的突變株稱為

組成型突變株。少數(shù)情況下，組成型突變株可產(chǎn)生大量的、比親本高的多的酶，這種突變株稱為超產(chǎn)突變株。（二）生物化學方法1.添加前體繞過反饋控制點：亦能使某種代謝產(chǎn)物大量產(chǎn)生DABCEF(-)(-)(-)2.添加誘導劑：從提高誘導酶合成量來說，最好的誘導劑往往不是該酶的底物，而是底物的衍生物，3.發(fā)酵與分離過程耦合：4.控制發(fā)酵的培養(yǎng)基成分：（三）控制細胞膜滲透性使胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物迅速滲漏出去,解除末端產(chǎn)物的反饋抑制。1.用生理學手段——

直接抑制膜的合成或使膜受缺損如:在Glu發(fā)酵中把生物素濃度控制在亞適量可大量分泌Glu；控制生物素的含量可改變細胞膜的成分，進而改變膜透性；當培養(yǎng)液中生物素含量較高時采用適量添加青霉素的方法。2.利用膜缺損突變株——油酸缺陷型、甘油缺陷型如:用谷氨酸生產(chǎn)菌的油酸缺陷型，培養(yǎng)過程中，有限制地添加油酸，合成有缺損的膜，使細胞膜發(fā)生滲漏而提高谷氨酸產(chǎn)量。甘油缺陷型菌株的細胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量滲漏。應用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸過量的情況下，適量添加青霉素也可以獲得大量谷氨酸。四、谷氨酸發(fā)酵1、適應期:尿素分解出氨使pH上升，糖不利用，2-4h。

措施:接種量和發(fā)酵條件控制使適應期縮短。2、對數(shù)生長期:糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降。溶氧急劇下降后維持在一定水平，菌體濃度迅速增大，菌體形態(tài)為排列整齊的八字形，不產(chǎn)酸，12h。措施:及時供給菌體生長必須的氮源及調(diào)節(jié)pH，在pH7.5-8.0時流加尿素；維持溫度30-32℃。3、菌體生長停止期:谷氨酸合成。

措施:提供必須的氨及pH維持在7.2-7.4，大量通氣，控制溫度34-37℃。4、發(fā)酵后期:菌體衰老，糖耗慢，殘?zhí)堑汀?/p>

措施:營養(yǎng)物耗盡酸濃度不增加時，及時放罐。

發(fā)酵周期一般為30h。谷氨酸除用于制造味精外還可用于治療神經(jīng)衰弱及配制營養(yǎng)注射液，應用前景廣泛。某醋廠轉(zhuǎn)產(chǎn)用谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸，結(jié)果代謝產(chǎn)物沒有谷氨酸而產(chǎn)生了乳酸

及琥珀酸，其原因是：?

A．溫度控制不適

B．pH呈堿性

C．pH呈酸性

D．溶氧不足（一）谷氨酸生產(chǎn)菌

谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、黃色短桿菌。我國使用的生產(chǎn)菌株是北京棒桿菌AS1.299、北京棒桿菌D110、鈍齒棒桿菌AS1.542、棒桿菌S-914和黃色短桿菌T6~13等。谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)菌株特點

在己報道的谷氨酸生產(chǎn)菌中，除芽孢桿菌外，雖然它們在分類學上屬于不同的屬種，但都有一些共同特點:革蘭氏陽性；菌體為球形、短桿至棒狀；不形成芽孢；沒有鞭毛，不能運動；需要生物素作為生長因子；在通氣條件下才能產(chǎn)生谷氨酸。（二）生產(chǎn)原料淀粉質(zhì)原料：玉米、小麥、甘薯、大米等，其中甘薯和淀粉最為常用；糖蜜原料：甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜；氮源料：尿素或氨水。輔助材料：硫酸、碳酸鈉、

活性碳、液堿、鹽、消泡劑、淀粉酶等。年產(chǎn)12萬噸味精，主要原輔材料耗用如下表：

項

目

單位：噸

淀

粉

196,870

液

氨

31,108

硫

酸

35,000

碳酸鈉

30,000

活性碳

2,500

液

堿

40,000

鹽

8,000

消泡劑

77,960

淀粉酶

11,694（三）工藝流程

味精生產(chǎn)全過程可分五個部分：原料的預處理及淀粉水解糖的制??；谷氨酸生產(chǎn)菌種子的擴大培養(yǎng)；谷氨酸發(fā)酵；谷氨酸的提取與分離；由谷氨酸制成味精及味精成品加工。發(fā)酵過程參數(shù)測定還原糖的測定谷氨酸的測定菌體形態(tài)觀察菌體濃度測定發(fā)酵過程參數(shù)的控制DO值pH溫度攪拌速度發(fā)酵發(fā)酵液冷卻接種三角瓶培養(yǎng)固體斜面培養(yǎng)上罐實消培養(yǎng)基的配制谷氨酸發(fā)酵的工藝流程圖谷氨酸發(fā)酵液常溫等電法等電結(jié)晶沉降分離脫色中和結(jié)晶冷凍等電法上清液（母液）離子交換谷氨酸晶體谷氨酸晶體冷凍結(jié)晶濃縮結(jié)晶谷氨酸鈉晶體（味精）谷氨酸的分離與味精的制備

（四）

發(fā)酵生產(chǎn)工藝

1.培養(yǎng)基成分碳源：實際生產(chǎn)中以糖質(zhì)原料為主。培養(yǎng)基中糖濃度對谷氨酸發(fā)酵有密切的關(guān)系。在一定的范圍內(nèi)，谷氨酸產(chǎn)量隨糖濃度的增加而增加。氮源：氮源是合成菌體蛋白質(zhì)、核酸及谷氨酸的原料。大約85%的氮源被用于合成谷氨酸，另外15%用于合成菌體。碳氮比對谷氨酸發(fā)酵有很大影響。一般發(fā)酵工業(yè)碳氮比為100：0.2~2.0，谷氨酸發(fā)酵的碳氮比為100：15~21。無機鹽：是微生物維持生命活動不可缺少的物質(zhì)。主要功能：構(gòu)成細胞的組成成分；作為酶的組成成分；激活或抑制酶的活力；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的氧化還原電位。起著調(diào)節(jié)微生物生命活動的作用。發(fā)酵時，使用的無機離子有K+、Mg2+、Fe2+、Mn2+等陽離子和PO43-、SO42-、Cl－等陰離子，其用量如下：

KH2PO4

0.05%~0.2%

K2HPO4

0.05%~0.2%

MgSO4.7H2O

0.005%~0.1%

FeSO4.7H2O

0.0005%~0.01%

MnSO4.4H2O

0.0005%~0.005%生物素：又叫維生素H或輔酶R。生物素的作用是影響代謝途徑；影響細胞的滲透性。谷氨酸產(chǎn)生菌幾乎都是生物素缺陷型，實際生產(chǎn)中通過添加玉米漿、麩皮水解液、糖蜜等作為生長因子（生物素）的來源。2.培養(yǎng)基

（1）斜面培養(yǎng)基

葡萄糖

0.1%、牛肉膏

1.0%、

蛋白胨

1.0%、氯化鈉

0.5%、瓊脂

2.0%、pH

7.0~7.2121℃滅菌30min(傳代和保藏斜面不加葡萄糖)。（2）

一級種子、二級種子及發(fā)酵培養(yǎng)基

一級種子：葡萄糖

2.5%、尿素

0.6%、KH2PO4

0.1%、MgSO4.7H2O

0.04%、玉米漿

2.3~3.0ml、pH

7.0；二級種子：水解糖

3.0%、尿素

0.6%、玉米漿

0.5~0.6ml、K2HPO4

0.1~0.2%、MgSO4.7H2O

0.04%、pH

7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：水解糖12~14%、尿素

0.5~0.8%、玉米漿

0.6ml、MgSO4.7H2O

0.06%、KCl

0.05%、Na2HPO4

0.17%、pH

7.0

。3.發(fā)酵條件的控制

（1）溫度谷氨酸發(fā)酵前期(0~12h)是菌體大量繁殖階段，在此階段菌體利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)來合成核酸、蛋白質(zhì)等，供菌體繁殖用，而控制這些合成反應的最適溫度均在30~32℃。在發(fā)酵中、后期，是谷氨酸大量積累的階段，而催化谷氨酸合成的谷氨酸脫氫酶的最適溫度在32~36℃，故發(fā)酵中、后期適當提高罐溫對積累谷氨酸有利。（2）pH值發(fā)酵液的pH影響微生物的生長和代謝途徑。發(fā)酵前期如果pH偏低，則菌體生長旺盛，長菌而不產(chǎn)酸；如果pH偏高，則菌體生長緩慢，發(fā)酵時間拉長。在發(fā)酵前期將pH值控制在7.5~8.0左右較為合適，而在發(fā)酵中、后期將pH值控制在7.0~7.6左右對提高谷氨酸產(chǎn)量有利。（3）通風在谷氨酸發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期以低通風量為宜；發(fā)酵中、后期以高通風量為宜。實際生產(chǎn)上，以氣體轉(zhuǎn)子流量計來檢查通氣量，即以每分鐘單位體積的通氣量表示通風強度。另外發(fā)酵罐大小不同，所需攪拌轉(zhuǎn)速與通風量也不同。（4）泡沫的控制消泡方法：機械消泡(耙式、離心式、刮板式、蝶式消泡器)，化學消泡(天然油脂、聚酯類、醇類、硅酮等)。（5）發(fā)酵時間不同的谷氨酸產(chǎn)生菌對糖的濃度要求也不一樣，其發(fā)酵時間也有所差異。低糖(10%~12%)發(fā)酵，其發(fā)酵時間為36~38h，中糖(14%)發(fā)酵，其發(fā)酵時間為45h。發(fā)酵過程中各種參數(shù)的變化情況如圖所示。最后的發(fā)酵液中谷氨酸的濃度很低，發(fā)酵周期較長，而這段時間卻有大量的葡萄糖被消耗，那么，這些被消耗的葡萄糖到哪里去了？出現(xiàn)這種情況的原因：發(fā)酵過程中感染了雜菌，造成了大量的葡萄糖被消耗，但是并沒有產(chǎn)生谷氨酸；發(fā)酵液的pH值控制的不合適或者是發(fā)酵液NH4＋濃度過高，使得產(chǎn)生的谷氨酸轉(zhuǎn)變成谷氨酰胺。例子?顯然，發(fā)酵過程中出現(xiàn)了異常情況，找出真正的原因。須根據(jù)發(fā)酵過程中其他參數(shù)如溶氧濃度的變化，結(jié)合菌體形態(tài)觀察等進一步分析，是由于發(fā)酵用培養(yǎng)基中添加的玉米漿過量，導致生物素濃度過高，這樣菌體不能順利地實現(xiàn)從生長型到產(chǎn)物積累型的轉(zhuǎn)變，因而出現(xiàn)了這種在工業(yè)生產(chǎn)上稱之為“只長菌，不產(chǎn)酸”的發(fā)酵異?，F(xiàn)象。五、谷氨酸提取工藝

（一）等電點法提取操作簡單，收率60％。周期長，占地面積大谷氨酸：α-型斜方晶體（好），β-型(輕麩酸)鱗片狀晶體；α型結(jié)晶水分在5～10%，而β型結(jié)晶水分則高達15～20%。生產(chǎn)上應防止β型晶體的生成。注意三個方面發(fā)酵液純度高：谷氨酸/殘?zhí)潜戎蹈?，膠體少，提前除菌體最好；發(fā)酵液處理要及時；加酸調(diào)pH、溫度、育晶時間、攪拌等服從結(jié)晶規(guī)律。20BeHClpH4.5~4.02h慢加酸發(fā)酵液第一中和點停酸育晶等電點pH5.0時慢加pH3.0~3.2

低速攪拌結(jié)晶靜止沉降濕谷氨酸離心分離谷氨酸20h母液谷氨酸解離常數(shù)和等電點pK1(—COOH)pK2(—NH3+)pKR(R基)pI谷氨酸2.199.674.25（γ-COOH）3.221.等電點法提取谷氨酸原理等電點時谷氨酸四種離子方式在水溶液中所占的比例：GA+:7.861%，GA±:84.24%，GA-:7.861%，GA=:0.2789×10-5%谷氨酸在等電點時，絕大部分以偶極離子(GA±，正負電荷相等)狀態(tài)存在，并含有等量的帶不同電荷的陽離子(GA+)和陰離子(GA-)，因此溶液中總靜電荷等于零。由于谷氨酸分子間相互碰撞，通過靜電引力的作用，結(jié)合成較大的聚合體而被沉淀析出，因而處于等電點時GA的溶解度最小。溫度對GA的溶解度影響很大，溫度越低溶解度越小，生產(chǎn)上多采用0～4℃。2.影響結(jié)晶的主要因素創(chuàng)造一定的過飽和度控制加酸的速度，不能太快，避免形成大量晶核；晶粒形成溫度30~25℃，不能高于30℃?，溫度不能回升，控制酸的流加速度來防止回升。添加α型晶種：0.2%~0.3%。谷氨酸含量5%以上，pH4.5~4.0時投種；谷氨酸含量4%~5%時pH4.0時投種。?pH影響溶液溶解度，使溶液中過飽和度合適。攪拌轉(zhuǎn)速適當30~35rpm；天門冬氨酸、苯甲氨酸、酪氨酸、脯氨酸等促進α型生成；Ca2+、Mg2+影響結(jié)晶（>0.34g/100ml）*在介穩(wěn)區(qū)內(nèi)結(jié)晶析出溫度低于相轉(zhuǎn)變溫度時，α型穩(wěn)定，β型不穩(wěn)定，過飽和溶液將主要析出α晶體。在低于相轉(zhuǎn)變溫度的范圍內(nèi)，β晶相有向α晶相轉(zhuǎn)變的趨勢。即，飽和溶液中α和β晶相同時存在，由于β晶相不穩(wěn)定易溶解，α晶相將長大。谷氨酸水溶液的相轉(zhuǎn)變溫度為40℃，實際生產(chǎn)的溫度應該<40℃。酸的流加速度：創(chuàng)造一定的合適的過飽和度同一溫度下微小晶體的溶解度高于粒度較大的晶體，大量晶體存在時，微小晶體溶解，而大晶體長大，直至小晶體完全消失。流加過程中，可以通過暫停流加進行一段時間育晶，從而使小的不良的晶體慢慢溶解，系統(tǒng)中的晶核數(shù)量減少，產(chǎn)品的粒度分布改善，提高產(chǎn)品的質(zhì)量。1.離子交換法提取GA的原理當氨基酸pH值大于3.22時羧基離解而帶負電，它能被陰離子交換樹脂吸附；當pH小于3.22時氨基離解而帶正電，能被陽離子交換樹脂吸附。利用陽離子交換樹脂對GA陽離子的選擇性吸