DB32T 4972.11-2024傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置技術(shù)規(guī)范 第11部分：細(xì)菌類應(yīng)急檢測技術(shù)

CCSC50江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置技術(shù)規(guī)范第11部分：細(xì)菌類應(yīng)急檢測技術(shù)2024-12-27發(fā)布2025-01-27實施江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā)發(fā)出布版Ⅰ前言 Ⅲ引言 Ⅳ 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4實驗室生物安全要求 5準(zhǔn)備工作和質(zhì)量控制 6常用顯微鏡檢查技術(shù) 7分離培養(yǎng) 8分子生物學(xué)應(yīng)急檢測技術(shù) 9免疫學(xué)應(yīng)急檢測技術(shù) 參考文獻(xiàn) Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是DB32/T4972《傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置技術(shù)規(guī)范》的第11部分。DB32/T4972已經(jīng)發(fā)布了以下部分：——第1部分：監(jiān)測預(yù)警；——第2部分：事件報告和管理；——第3部分：風(fēng)險評估；——第4部分：現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查；——第5部分：恢復(fù)評估；——第6部分：應(yīng)急消毒處置及應(yīng)急人員個人防護(hù)；——第7部分：媒介生物應(yīng)急監(jiān)測、評估與控制；——第8部分：標(biāo)本的采集、保存和運(yùn)輸；——第9部分：應(yīng)急檢測流程；——第10部分：病毒類應(yīng)急檢測技術(shù)；——第11部分：細(xì)菌類應(yīng)急檢測技術(shù)。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省衛(wèi)生健康委員會提出并組織實施。本文件由江蘇省衛(wèi)生健康標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本文件起草單位：江蘇省疾病預(yù)防控制中心、南京鼓樓醫(yī)院、江蘇省人民醫(yī)院、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所、無錫市疾病預(yù)防控制中心。Ⅳ引言傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件是江蘇省公共衛(wèi)生安全的主要威脅，對社會、經(jīng)濟(jì)和人群健康存在巨大影響。本文件為貫徹落實《中華人民共和國傳染病防治法》《中華人民共和國突發(fā)事件應(yīng)對法》《突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急條例》等法律法規(guī)對傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件的應(yīng)急處置要求，提升江蘇省傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件的應(yīng)急處置能力，保障人民群眾的生命安全和社會穩(wěn)定的目標(biāo)而制定。DB32/T4972《傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置技術(shù)規(guī)范》由以下11個部分構(gòu)成：——第1部分：監(jiān)測預(yù)警；——第2部分：事件報告和管理；——第3部分：風(fēng)險評估；——第4部分：現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查；——第5部分：恢復(fù)評估；——第6部分：應(yīng)急消毒處置及應(yīng)急人員個人防護(hù)；——第7部分：媒介生物應(yīng)急監(jiān)測、評估與控制；——第8部分：標(biāo)本的采集、保存和運(yùn)輸；——第9部分：應(yīng)急檢測流程；——第10部分：病毒類傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急檢測技術(shù)；——第11部分：細(xì)菌類傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急檢測技術(shù)。DB32/T4972的制定是對傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件處置工作相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的有力補(bǔ)充，為開展傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件的監(jiān)測預(yù)警、報告和管理、風(fēng)險評估、現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查、恢復(fù)評估、應(yīng)急消毒處置和個人防護(hù)、媒介生物的應(yīng)急監(jiān)測評估與控制、標(biāo)本的采集和檢測等應(yīng)急處置工作提供有力的科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐，對保障公眾健康和公共衛(wèi)生安全具有重要意義。1DB32/T4972.11—2024傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置技術(shù)規(guī)范第11部分：細(xì)菌類應(yīng)急檢測技術(shù)本文件規(guī)定了細(xì)菌類應(yīng)急檢測的實驗室生物安全要求、準(zhǔn)備工作和質(zhì)量控制、常用顯微鏡檢查技術(shù)、分離培養(yǎng)、分子生物學(xué)應(yīng)急檢測技術(shù)和免疫學(xué)應(yīng)急檢測技術(shù)等。本文件適用于傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置中細(xì)菌類傳染病病原體的應(yīng)急檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求WS233病原微生物實驗室生物安全通用準(zhǔn)則WS288肺結(jié)核診斷3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1致病菌pathogenicbacterium能引起人類疾病的細(xì)菌，統(tǒng)稱為致病菌或病原菌。3.2高通量測序high?throughputsequencing可在較短時間內(nèi)確定目標(biāo)區(qū)域中核苷酸的順序，用于細(xì)菌全基組或病原宏基因測的大規(guī)模并行測序技術(shù)。注：又稱“下一代”測序技術(shù)（"Next?generation"sequencingtechnology）。4實驗室生物安全要求4.1實驗人員應(yīng)根據(jù)GB19489和風(fēng)險評估的要求，配備不同類型傳染病感染的個人防護(hù)裝備，包括但不限于防護(hù)服、手套、外科口罩或醫(yī)用防護(hù)口罩、防護(hù)面屏、防護(hù)帽。防護(hù)服宜每隔4h更換一次。在發(fā)生意外暴露時，根據(jù)應(yīng)急處置預(yù)案采取必要措施。要求。4.3醫(yī)療廢物處置應(yīng)按照《醫(yī)療廢物管理條例》規(guī)定執(zhí)行。25準(zhǔn)備工作和質(zhì)量控制5.1準(zhǔn)備工作根據(jù)實驗需要，選擇相應(yīng)的生物安全柜、移液器、漩渦震蕩儀、離心機(jī)等儀器和檢測試劑耗材。5.2質(zhì)量控制每一批次反應(yīng)過程中應(yīng)至少設(shè)置一個陰性和陽性對照，必要時增加空白對照。6常用顯微鏡檢查技術(shù)6.1生理鹽水濕片鏡下檢測在玻片上滴加適量生理鹽水，將適量樣本與生理鹽水混合并涂抹均勻后，觀察中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞及其數(shù)量；觀察標(biāo)本中細(xì)菌動力特征（用暗視野顯微鏡觀察）等。6.2革蘭氏染色顯微鏡檢查6.2.1直接在玻片上涂抹標(biāo)本，涂片應(yīng)薄且均勻。自然干燥或恒溫干燥器上干燥后，經(jīng)甲醇固定或火焰快速固定3次，革蘭染色，晾干后讀片。6.2.2革蘭染色脫色時間因選用不同的脫色劑而異。使用革蘭氏染色儀染色，應(yīng)按照廠家操作說明書進(jìn)行。6.3抗酸染色顯微鏡檢查抗酸染色鏡檢操作流程應(yīng)按照WS288執(zhí)行。6.4熒光染色顯微鏡檢查熒光染色顯微鏡檢查步驟如下：a）染色：涂片經(jīng)火焰固定后，滴加金胺“O”染色劑蓋滿玻片，染色30min，流水自玻片一端輕緩沖洗，洗去染色液，瀝去玻片上剩余的水；b）脫色：涂膜上端外緣滴加脫色劑，蓋滿玻片，脫色3min或至無色，流水自玻片一端輕洗，洗去脫色劑；c）復(fù)染：加復(fù)染劑復(fù)染1min，瀝去復(fù)染液，流水自玻片一端輕洗，自然干燥后鏡檢；d）鏡檢：玻片涂膜面向上置于熒光或LED顯微鏡載物臺，并以卡尺固定后，以低倍鏡搜索發(fā)現(xiàn)疑為致病菌的熒光物質(zhì)，使用40×物鏡確認(rèn)。在暗背景下，目標(biāo)菌發(fā)出熒光，呈特征形態(tài)。6.5其他特殊染色顯微鏡檢查細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)如芽孢、鞭毛、莢膜或其他細(xì)菌結(jié)構(gòu)如細(xì)胞壁、核質(zhì)、胞質(zhì)顆粒等，采用相應(yīng)的特殊染色法進(jìn)行顯微鏡檢查。包括且不限于細(xì)胞壁染色、鞭毛染色、莢膜染色、芽孢染色、異染顆粒染色。7分離培養(yǎng)7.1無菌部位標(biāo)本一般應(yīng)在患者使用抗生素之前采集無菌部位標(biāo)本如血液標(biāo)本直接接種血培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，陽性血培養(yǎng)3物進(jìn)行固體培養(yǎng)基分離純化，并進(jìn)行后續(xù)進(jìn)一步鑒定，對血培養(yǎng)陰性的標(biāo)本盲傳一代。7.2非無菌部位標(biāo)本非無菌部位標(biāo)本，通過直接培養(yǎng)或選擇性增菌培養(yǎng)的方式，針對不同細(xì)菌采用不同培養(yǎng)基和分離程序，得到細(xì)菌純培養(yǎng)物。8分子生物學(xué)應(yīng)急檢測技術(shù)8.1核酸提取8.1.1試劑盒法提取核酸根據(jù)標(biāo)本類型選擇相應(yīng)商品化離心柱法或磁珠法基因組核酸提取試劑盒。選擇非人源性內(nèi)參時，待提取標(biāo)本中宜加入相應(yīng)的內(nèi)參模板。8.1.2常溫一步法提取核酸根據(jù)標(biāo)本類型選擇相應(yīng)商品化的裂解試劑，將試劑加入標(biāo)本中，常溫裂解。8.1.3煮沸法提取核酸8.1.3.1標(biāo)本離心、重懸后使用煮沸法進(jìn)行簡易模板制備：a）取1接種環(huán)（約2μL~5μL）擴(kuò)大培養(yǎng)物放入裝有500μL純水或TE的1.5mL離心管內(nèi)，混勻；d）吸取上清即為PCR模板。8.1.3.2選擇非人源性內(nèi)參時，在待提取標(biāo)本中宜加入相應(yīng)的內(nèi)參模板。8.2等溫擴(kuò)增技術(shù)8.2.1反應(yīng)體系配制（引物、鏈置換型核酸合成酶、基質(zhì)、模板）后置于指定溫度下（60℃~65℃),經(jīng)一個步驟即可完成。具體參照相應(yīng)細(xì)菌核酸檢測試劑盒說明書。8.2.2陰性對照、陽性對照結(jié)果成立時，可使用以下方法進(jìn)行結(jié)果判定：a）濁度檢測：肉眼觀察反應(yīng)管內(nèi)出現(xiàn)白色渾濁判定為陽性，未渾濁判為陰性；b）指示劑檢測：加入熒光等指示劑后，根據(jù)試劑盒說明書判定結(jié)果。8.3實時熒光PCR技術(shù)8.3.1反應(yīng)體系配制（PCR反應(yīng)液、酶、引物、探針及模板）及反應(yīng)程序設(shè)置（反應(yīng)溫度、循環(huán)數(shù)及熒光通道）應(yīng)參照相應(yīng)細(xì)菌核酸檢測試劑盒說明書。a）陰性顯示無Ct值、無S形擴(kuò)增曲線；b）陽性顯示Ct值小于或等于細(xì)菌核酸檢測試劑盒說明書規(guī)定值，且有S形擴(kuò)增曲線。8.4數(shù)字PCR技術(shù)8.4.1根據(jù)PCR儀器和試劑的要求制備反應(yīng)體系，將體系分配到微小分區(qū)或微滴中并封蓋，進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用熒光染料或探針監(jiān)測目標(biāo)核酸的擴(kuò)增，配套軟件統(tǒng)計分析各反應(yīng)中的陽性液滴數(shù)。8.4.2當(dāng)陰性對照、陽性對照、內(nèi)參（如有）結(jié)果成立時，進(jìn)行結(jié)果判斷，確定目標(biāo)核酸及其定量信息，包括4DB32/T4972.11—2024標(biāo)本中每個熒光通道的濃度、精度、誤差，依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行結(jié)果判讀。8.5微流體芯片檢測技術(shù)8.5.1參照相應(yīng)的多病原檢測試劑盒（微流體芯片法）說明書。8.5.2當(dāng)陰性對照、陽性對照、內(nèi)參（如有）結(jié)果成立時，進(jìn)行結(jié)果判斷，查看各標(biāo)本擴(kuò)增曲線的形態(tài)及對應(yīng)的Ct值，對照試劑盒說明書規(guī)定值進(jìn)行判讀。8.5.3確定各個病原體靶點(diǎn)陽性擴(kuò)增所對應(yīng)的標(biāo)本編號，報告該標(biāo)本為對應(yīng)病原體檢測項目陽性。8.6高通量宏基因組測序8.6.1測序時機(jī)傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急檢測中，出現(xiàn)且不限于多病原核酸檢測陰性、分離培養(yǎng)陰性、免疫學(xué)檢測陰性等情況時，宜使用宏基因組測序。8.6.2實驗過程對符合要求的核酸進(jìn)行文庫構(gòu)建、上機(jī)測序、數(shù)據(jù)分析等。具體反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照相應(yīng)測序平臺及試劑盒說明書，根據(jù)應(yīng)急檢測實際選擇是否執(zhí)行去宿主操作。8.6.3數(shù)據(jù)處理8.6.3.1數(shù)據(jù)質(zhì)量控制數(shù)據(jù)質(zhì)量控制要求如下：a）標(biāo)本經(jīng)過高通量測序得到的原始數(shù)據(jù)，應(yīng)該在去除接頭、低質(zhì)量數(shù)據(jù)和宿主基因組序列后再進(jìn)行下一步分析；b）測序完成后，對Q20和Q30進(jìn)行統(tǒng)計，標(biāo)本測序的堿基質(zhì)量應(yīng)同時符合：Q201）≥90%、Q302）≥85%；c）每個標(biāo)本的高質(zhì)量序列（Q20）數(shù)目應(yīng)大于2×107條，對于宿主含量較多而又未在核酸提取步驟進(jìn)行去宿主操作的標(biāo)本，數(shù)據(jù)量適當(dāng)增加到4×107~8×107條。注1：測序數(shù)據(jù)中，堿基識別質(zhì)量值為20的堿基識別準(zhǔn)確率為99%，或錯誤率為1%。注2：測序數(shù)據(jù)中，堿基識別質(zhì)量值為30的堿基識別準(zhǔn)確率為99.9%，或錯誤率為0.1%。8.6.3.2物種注釋數(shù)據(jù)質(zhì)控后對標(biāo)本數(shù)據(jù)進(jìn)行物種注釋，宜選用得到廣泛認(rèn)可的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，包括但不限于FoodandDrugAdministrationdAtabaseforReferenceGrademicrObialSequences（FDA?ARGOSWorldDataCentreforMicroorganisms（WDCMGenomeTaxonomyDataBase（GTDB）等。除特殊方法外，對于已知物種，數(shù)據(jù)庫中序列相似度95%以上，覆蓋度90%以上。8.6.3.3微生物豐度計算數(shù)據(jù)質(zhì)控后進(jìn)行物種相對豐度計算，并記錄計算方法或軟件。除特殊方法外，應(yīng)將高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)比對到組裝好的參考基因集或合適的數(shù)據(jù)庫上，按相似度95%以上，覆蓋度90%以上進(jìn)行統(tǒng)計，得到基因水平上的相對豐度分布情況，再將注釋到同一物種和同一屬的分類水平的基因序列相對豐度進(jìn)行疊加，得到種水平和屬水平的相對豐度結(jié)果。58.6.4結(jié)果判定結(jié)果判定規(guī)則如下。a）結(jié)合《人間傳染的病原微生物目錄》或其他相關(guān)的病原微生物目錄篩選出物種注釋中的致病菌和條件致病菌的信息，針對不同標(biāo)本類型并結(jié)合檢出病原微生物的種類進(jìn)行解讀，確認(rèn)致病微傷口）。正常有菌部位應(yīng)綜合分析檢出細(xì)菌是否為導(dǎo)致感染的致病病原。b）對于條件致病菌3）應(yīng)綜合考慮臨床表現(xiàn)和物種豐度等信息謹(jǐn)慎進(jìn)行判斷。c）對于致病菌，當(dāng)種特異性序列數(shù)較低時（小于3條）一般不考慮為致病病原，但檢出菌為敏感度較低的菌株，如結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，布魯氏菌，諾卡菌等以及烈性傳染病的時候（包括鼠疫，炭疽等應(yīng)結(jié)合臨床癥狀考慮感染可能，并使用分離培養(yǎng)、涂片染色或抗體檢測等手段予以確認(rèn)或排除。如果疑似暴發(fā)疫情標(biāo)本大部分都報告相應(yīng)序列且能夠排除標(biāo)本之間或環(huán)境污染時即可認(rèn)定其為此次疫情的致病菌。d）對于無菌部位檢出病原菌時，在排除標(biāo)本污染的情況下，高度懷疑其為致病菌。e）對于鑒定出可分離培養(yǎng)的病原菌，應(yīng)按相應(yīng)操作指南對原始標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)。注：在一定條件下，原來不致病的細(xì)菌成為致病菌，稱為條件致病菌或機(jī)會致病菌。9免疫學(xué)應(yīng)急檢測技術(shù)9.1膠體金檢測技術(shù)9.1.1檢測標(biāo)本的類型、上樣體積及操作步驟參照相應(yīng)的試劑盒說明書。9.1.2實驗完成后按照試劑盒要求的時間觀察結(jié)果，當(dāng)檢測線和質(zhì)控線均為陽性結(jié)果時，判定對應(yīng)的檢測項目陽性結(jié)果；當(dāng)質(zhì)控線為陽性結(jié)果，檢測線為陰性結(jié)果時，判定對應(yīng)的檢測項目為陰性結(jié)果；當(dāng)質(zhì)控線為陰性結(jié)果時，判定結(jié)果為無效結(jié)果，需重復(fù)實驗。9.2酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）9.2.1參照說明依次加入抗原包被（如需要）、待檢標(biāo)本及對照、酶標(biāo)記物、底物、終止液，具體流程參照相應(yīng)細(xì)菌ELISA檢測試劑盒說明書。9.2.2以空白對照調(diào)零，讀取酶標(biāo)儀器上各孔450nm和（或）4