晚期氧化蛋白產(chǎn)物（AOPP）檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案

晚期氧化蛋白產(chǎn)物（AOPP）檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理晚期氧化蛋白產(chǎn)物（AOPP）是新近發(fā)現(xiàn)的一類具有促炎活性的尿毒癥毒素，是血漿蛋白遭受活性氧系（ROS）攻擊后形成的氧化修飾產(chǎn)物。AOPP能激發(fā)單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，刺激以腫瘤壞死因子TNF-ɑ為主的大量促炎性細(xì)胞因子的合成、釋放，促進(jìn)產(chǎn)生更多的活性氧，從而誘導(dǎo)和加重全身氧化應(yīng)激和炎癥狀態(tài)。AOPP與晚期糖基化終末產(chǎn)物（AdvancedGlycationEnd-Product,AGE）蛋白很相似，也發(fā)揮著相似生物功能。AOPP是腎并發(fā)癥、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、代謝綜合征、免疫性疾病和惡性腫瘤等疾病的重要檢測(cè)指標(biāo)。CheKine?晚期氧化蛋白產(chǎn)物（AOPP）檢測(cè)試劑盒（微量法）可定量檢測(cè)血漿、血清、動(dòng)物組織和細(xì)胞等樣本中AOPP的含量。樣品或標(biāo)準(zhǔn)品與引發(fā)劑和終止液反應(yīng)，產(chǎn)物在340nm處有吸收峰，通過(guò)檢測(cè)340nm處OD值，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，確定樣品中AOPP的含量。自備耗材·酶標(biāo)儀或紫外分光光度計(jì)（能測(cè)340nm處的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·制冰機(jī)、低溫離心機(jī)、水浴鍋·去離子水·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備ExtractionBuffer(1×)：臨用前配制，用去離子水按1:9稀釋至1×，混勻備用。ReagentⅠ：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。ReagentⅡ：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。Standard：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。注意：ReagentⅡ和Standard有一定的刺激性，建議在使用過(guò)程中做好個(gè)人防護(hù)。WorkingAOPP-HSAPositiveControl：臨用前配制，用ExtractionBuffer(1×)按1:19稀釋，混勻備用。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個(gè)月，避免反復(fù)凍融。WorkingFree-HSANegativeControl：臨用前配制，用ExtractionBuffer(1×)按1:19稀釋，混勻備用。用不完的試劑-20℃避光分裝保存1個(gè)月，避免反復(fù)凍融。標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)置：按照如下表格，用去離子水將1,000μmol/L標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為100、80、60、40、20、10、5μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。序號(hào)1,000μmol/L標(biāo)準(zhǔn)品體積（μL）去離子水體積（μL）標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/L）Std.1100900100Std.28092080Std.36094060Std.44096040Std.52098020Std.61099010Std.759955Std.801,0000注意：每次實(shí)驗(yàn)都要做一次標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，制作標(biāo)曲；稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品溶液不穩(wěn)定，必須在4小時(shí)內(nèi)使用。樣本制備1.細(xì)胞：收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，棄上清，按照每500萬(wàn)個(gè)細(xì)胞加入1mLExtractionBuffer(1×)，超聲波破碎細(xì)胞5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），13,000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。2.動(dòng)植物組織：稱取約0.1g組織，加入1mLExtractionBuffer(1×)，進(jìn)行冰浴勻漿，13,000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。3.血清和血漿：用ExtractionBuffer(1×)稀釋5倍后直接檢測(cè)。注意：如需用蛋白濃度計(jì)算，推薦使用Abbkine貨號(hào)：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。實(shí)驗(yàn)步驟1.酶標(biāo)儀或紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340nm。紫外分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。2.96孔UV板或微量石英比色皿中按順序加入下列試劑：試劑測(cè)定孔（μL）空白孔（μL）標(biāo)準(zhǔn)孔（μL）陽(yáng)性對(duì)照孔（選做）（μL）陰性對(duì)照孔（選做）（μL）樣本2000000ExtractionBuffer（1×）0200000WorkingAOPP-HSAPositiveControl0002000WorkingFree-HSANegativeControl0000200Standard0020000ReagentⅠ1010101010ReagentⅡ2020202020混勻，37℃孵育5min，記錄340nm處的吸光值，計(jì)算測(cè)定孔ΔA測(cè)=A測(cè)定-A空白，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白，陽(yáng)性對(duì)照孔ΔA陽(yáng)對(duì)=A陽(yáng)對(duì)-A空白和陰性對(duì)照孔ΔA陰對(duì)=A陰對(duì)-A空白。注意：對(duì)照孔、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需做1-2次。實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA測(cè)定小于0.002可適當(dāng)加大樣本量。如果ΔA測(cè)定大于100μmol/L的ΔA標(biāo)準(zhǔn)，樣本可用ExtractionBuffer(1×)進(jìn)一步稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過(guò)程計(jì)算公式和簡(jiǎn)潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡(jiǎn)潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。1.以各標(biāo)準(zhǔn)品濃度為y軸，ΔA標(biāo)準(zhǔn)為x軸，做標(biāo)準(zhǔn)曲線得到方程，將ΔA測(cè)帶入方程，得到y(tǒng)(μmoL/L)。2.樣本中AOPP濃度計(jì)算(1)按照蛋白濃度計(jì)算AOPP含量(μmol/g)=(y×V樣)÷(V樣×Cpr)×稀釋倍數(shù)=y÷Cpr×n(2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算AOPP含量(μmol/g)=(y×V樣)÷(W×V樣÷V提取)×稀釋倍數(shù)=y÷W÷1,000×n(3)按照血清和血漿計(jì)算AOPP含量(μmol/L)=y×n(4)按照細(xì)胞密度計(jì)算AOPP含量(nmol/104cells)=(y×V樣)÷(500×V樣÷V提取)=y÷500V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.2mL；V提?。杭尤胩崛∫后w積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)；n：樣品稀釋倍數(shù)。結(jié)果展示Figure1.AOPP標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure2.不同樣品AOPP檢測(cè)值Figure3.Free-HSA陰性對(duì)照組和AOPP-HSA陽(yáng)性對(duì)照組在340nm檢測(cè)的OD值相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB1030CheKine?超氧化物歧化酶（SOD）活力檢測(cè)試劑盒（微量法）KTB1040Ch