肝素酶活性的測定 編制說明

2本標準根據(jù)國標委公布的2023年國家標準計劃項目，本項目計劃編號為力的測定分光光度法》標準項目進行了預研，起草組成員查閱資料，廣泛收集32023年推薦性國家標準計劃的通知》（生檢標[2023]41測定分光光度法》標準項目立項，計劃編號：20231639-T素酶活力的測定分光光度法》標準（征求意見稿）及其編制說明，并對全國生結構和起草規(guī)則》，并參照了GB/T6379.1-確度與精密度）第1部分總則與定義》、GB/T6肝素酶催化底物肝素或硫酸乙酰肝素裂解會生成4,5不飽和糖醛酸。4,5不飽和糖醛酸在232nm波長下有特征吸收（圖1），通過測定232nm下的吸光度的變4由于酶的活性會受到溫度、pH以及離子添加劑等多種參數(shù)的影響，因此選的最適催化溫度為30℃,而肝素酶Ⅲ的活性在20℃-40℃的范圍內隨溫度提高而反應體系pH值對于肝素酶等酶的活性影響很大，pH的改變能影響酶活性中物分子的結合和催化。而當pH過?。ㄟ^酸）或者過大（過堿）都有可能使蛋白的范圍內保持較高的活性，而肝素酶Ⅱ的最適pH為7.0，三種肝素酶在pH為9.0的條件下迅速失活。對于三種肝素酶，選取pH6前期研究表明鈣離子是肝素酶活性所必需的輔助因子。CaCl2濃度對三種肝素酶的活性影響如圖4所示，其中三種肝素酶在CaCl2濃度為0時的活性分別設為100%。CaCl2的加入使得三種肝素酶的活性均有所提高，在CaCl2濃度為1.2-5.0為肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ活性測定時的CaCl2濃度。NaCl濃度對肝素酶活性的影響如圖5所示。其中三種肝素酶在NaCl濃度為07肝素酶活性測定過程中吸光度隨時間的變化曲線如圖5所示。為保證酶活性收集到自1981年-2024年的4,5不飽和糖醛酸測定的相關文獻37篇，對于肝素酶Ⅰ活性的測定，底物溶液含20mmol/L三羥基甲基氨基甲烷（Tris）、1.2mmol/L氯化鈣（CaCl2）、200mmol/L氯化鈉素鈉，pH7.0；對于肝素酶Ⅱ活性的測定，底物溶液含2mmol/LCaCl2、50mmol/L8酶活性的測定步驟為：準確移取1000μLV1——反應底物溶液的體積，單位為微升(μLV2——酶活性測定中加入酶液的體積，單位為微升(μLk——酶活性測定中吸光度曲線斜率，單位為吸光度每分鐘（Abs/minX2——肝素酶活性，單位為酶活性單位每克（U/g）9V1——反應底物溶液的體積，單位為微升(μLV2——酶活性測定中加入酶液的體積，單位為微升(μLk——酶活性測定中吸光度曲線斜率，單位為吸光度每分鐘（Abs/minV0——溶解酶粉的液體體積，單位為毫升（mL酶法進行了實驗室間驗證。選用肝素酶Ⅰ為驗證樣品，驗證設置了3個濃度，分別