地方標(biāo)準(zhǔn)《常見淡水養(yǎng)殖魚類疾病診治技術(shù)規(guī)范 第3部分疾病防治用藥藥效檢驗(yàn)》

ICSFORMTEXT65.150FORMTEXTB52FORMTEXTDBFORMTEXT45DBFORMTEXT45/TFORMTEXTXXXXX—FORMTEXT2016FORMTEXT常見淡水養(yǎng)殖魚類疾病診治技術(shù)規(guī)范第3部分：疾病防治用藥藥效檢驗(yàn)FORMTEXTThetechnicalregulationsofcommonfreshwaterfarmedfishdiseasediagnosisandtreatment－part3drugefficacytestfordiseasecontrolFORMDROPDOWNFORMTEXT2016-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXT2016-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實(shí)施FORMTEXT廣西壯族自治區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布目次TOC\h\z\t"前言、引言標(biāo)題,1,參考文獻(xiàn)、索引標(biāo)題,1,章標(biāo)題,1,參考文獻(xiàn),1,附錄標(biāo)識(shí),1,一級(jí)條標(biāo)題,3,二級(jí)條標(biāo)題,4"前言IV1范圍12規(guī)范性引用文件13試劑和材料13.1試劑13.1.1無菌生理鹽水13.1.2預(yù)溶劑13.1.3稀釋劑13.2材料23.2.1培養(yǎng)基23.2.2菌株23.2.3病魚樣品23.2.4病幼樣品23.2.5養(yǎng)殖池水23.2.6藥物24儀器設(shè)備與器具24.1儀器設(shè)備24.2器具25抗生素藥效檢驗(yàn)25.1培養(yǎng)基制備25.1.1肉湯培養(yǎng)基25.1.2營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板25.2百倍母液制備35.2.1試劑除菌35.2.2儲(chǔ)存液制備35.2.3儲(chǔ)存液定容35.2.4百倍母液稀釋35.3MIC范圍篩選35.3.1梯度藥液配備35.3.2菌懸液制備35.3.3菌液接種35.3.4孵育35.3.5結(jié)果觀察45.4MIC測(cè)定45.5抑菌圈測(cè)定45.5.1菌板制備45.5.2藥液配置45.5.3藥敏試驗(yàn)45.5.4抑菌圈測(cè)量45.6判定46消毒劑藥效檢驗(yàn)46.1藥物稱量46.2母液制備46.3檢驗(yàn)56.3.1養(yǎng)殖用水消毒56.3.2細(xì)菌培養(yǎng)56.4結(jié)果觀察56.5判定57殺蟲驅(qū)蟲藥藥效檢驗(yàn)57.1外用殺蟲藥57.1.1藥物稱量57.1.2母液制備57.1.3母液稀釋57.1.4檢驗(yàn)57.1.5判定57.2內(nèi)服驅(qū)蟲藥57.2.1病魚樣品暫養(yǎng)57.2.2藥物稱量67.2.3母液制備67.2.4藥餌制作67.2.5藥餌投喂67.2.6判定68水質(zhì)改良劑藥效檢驗(yàn)68.1藥物稱量68.2母液制備68.3母液稀釋68.4判定69免疫增強(qiáng)劑藥效檢驗(yàn)69.1病龜樣品暫養(yǎng)69.2藥物稱量79.3母液制備79.4藥餌制作79.5藥餌投喂79.6結(jié)果觀察79.7判定710記錄7前言DB45/T1087《常見淡水養(yǎng)殖魚類疾病診治技術(shù)規(guī)范》分為三個(gè)部分︰——第1部分︰資料記錄、病因與病損度診斷及應(yīng)對(duì)措施；——第2部分︰疾病診斷與防治；——第3部分︰疾病防治用藥藥效檢驗(yàn)。本部分為DB45/T1087的第3部分。本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1－2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位︰廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣總站、廣西大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)起草人︰胡大勝、龍光華、黃鈞、韓書煜、黃艷華、梁靜真。常見淡水養(yǎng)殖魚類疾病診治技術(shù)規(guī)范第3部分：疾病防治用藥藥效檢驗(yàn)范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了常見淡水養(yǎng)殖魚類疾病防治用藥藥效檢驗(yàn)的試劑與材料、儀器設(shè)備與器具、抗生素藥效檢驗(yàn)、消毒劑藥效檢驗(yàn)、殺蟲驅(qū)蟲藥藥效檢驗(yàn)、水質(zhì)改良劑藥效檢驗(yàn)、免疫增強(qiáng)劑藥效檢驗(yàn)與記錄。本標(biāo)準(zhǔn)適用于廣西境內(nèi)常見淡水養(yǎng)殖魚類疾病的診斷與防治。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T27623.1-2011漁用抗菌藥物藥效試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范第1部分：常量肉湯稀釋法藥物敏感性試驗(yàn)GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法試劑和材料試劑無菌生理鹽水精確稱取8.50g分析純氯化鈉，加入1L蒸餾水溶解后加熱至121℃高壓滅菌15min。預(yù)溶劑0.1M二甲基甲酰胺溶液，0.1N氫氧化鈉溶液，乙醇。各種藥物的預(yù)溶劑見表1。各種抗生素的預(yù)溶劑藥物名稱預(yù)溶劑藥物名稱預(yù)溶劑磺胺甲噁唑0.1N氫氧化鈉硫酸新霉素蒸餾水氟苯尼考0.1M二甲基甲酰胺鹽酸多西環(huán)素蒸餾水甲砜霉素0.1M二甲基甲酰胺乳酸諾氟沙星蒸餾水磺胺二甲嘧啶熱乙醇煙酸諾氟沙星蒸餾水磺胺嘧啶鈉蒸餾水稀釋劑蒸餾水，質(zhì)量符合GB/T6682要求。材料培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，肉湯培養(yǎng)基。菌株嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株或確定耐藥性消除的革蘭氏陰性病原菌。病魚樣品確診感染寄生蟲或水霉的魚種，數(shù)量≥30尾，用于殺蟲驅(qū)蟲藥藥效檢驗(yàn)。病幼樣品精神萎靡不振、兩眼暗淡無神、活動(dòng)遲緩的幼龜，數(shù)量≥30只，用于免疫增強(qiáng)劑藥效檢驗(yàn)。養(yǎng)殖池水氨氮含量＞1mg/L的養(yǎng)殖池水200L，用于水質(zhì)改良劑藥效檢驗(yàn)。藥物質(zhì)控藥物：鹽酸多西環(huán)素，含量98.5%。待檢藥物：抗生素、消毒劑、殺蟲驅(qū)蟲藥、水質(zhì)改良劑和免疫增強(qiáng)劑。儀器設(shè)備與器具儀器設(shè)備生化培養(yǎng)箱，無菌操作臺(tái)，生物顯微鏡，高壓滅菌鍋，精確度為0.1mg的分析天平，麥?zhǔn)媳壬堋Ｆ骶?0μL～200μL、100μL～1000μL和1000μL～5000μL移液器，30L、50L和250L塑料容器，槍頭，刻度吸管，洗耳球，藥勺，1L容量瓶，500mL三角燒杯，玻璃棒，涂棒，培養(yǎng)皿，接種環(huán)，酒精燈，牛津杯，氣泵?？股厮幮z驗(yàn)培養(yǎng)基制備肉湯培養(yǎng)基用干粉培養(yǎng)基制備成普通肉湯培養(yǎng)基，12l.3℃高壓滅菌20min后，4℃保存?zhèn)溆?。營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板用干粉培養(yǎng)基制備成普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，12l.3℃高壓滅菌20min后，4℃保存?zhèn)溆?。百倍母液制備試劑除菌預(yù)溶劑用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，稀釋劑高壓滅菌除菌。儲(chǔ)存液制備藥物稱量用精確度0.1mg分析天平精確稱量含有效成分1000mg的藥物，置于1L燒杯中。某廠家生產(chǎn)的某品牌含量10%氟苯尼考，稱量時(shí)，準(zhǔn)確稱取10g，置于1L燒杯中。藥物預(yù)溶按稱量藥物重量的3倍加預(yù)溶劑到燒杯中，充分?jǐn)嚢枞芙?。?chǔ)存液定容向加入容量瓶加入蒸餾水稀釋，最后定容1000mL，過濾冷藏可儲(chǔ)存7d。百倍母液稀釋另取一個(gè)500mL燒杯，加入100mL蒸餾水，用移液器精確吸出10mL蒸餾水，再用移液器精確吸取定容儲(chǔ)存液10mL加入燒杯充分混勻。MIC范圍篩選梯度藥液配備參照GBT27623.1執(zhí)行。取10支試管，第1管加入10mL普通肉湯培養(yǎng)基，第2～10管分別加入4mL普通肉湯培養(yǎng)基。第1管吸出2mL培養(yǎng)基，加入2mL百倍母液混勻，吸出2mL棄掉，吸4mL加入第2管混勻，再吸4mL加入第3管混勻，以此類推到第8管；第8管混勻后吸出4mL棄掉，配置成20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.312μg/mL和0.156μg/mL8個(gè)梯度藥液。第9管和第10管不加藥物，第9管作細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)照，第10管作無菌控制對(duì)照。配置磺胺類藥物的梯度濃度時(shí)，第1管吸出5.12mL培養(yǎng)基，加入5.12mL儲(chǔ)存液混勻，吸出2mL棄掉，吸4mL加入第2管混勻，再吸4mL加入第3管混勻，以此類推到第8管；第8管混勻后吸出4mL棄掉，配置成512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL和4μg/mL8個(gè)梯度藥液。菌懸液制備取經(jīng)配套營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板新鮮培養(yǎng)的待檢菌株，用0.85%無菌生理鹽水洗到已滅菌的試管中，加0.85%無菌生理鹽水至菌液濃度為0.5×108CFU/mL。菌液濃度用麥?zhǔn)媳壬苄Ｕ＞航臃N菌液制備好后，應(yīng)在≤15min加入第1～9管試管中，第10管不加。菌液接種后的最終濃度為5×105CFU/mL。菌液濃度用麥?zhǔn)媳壬苄Ｕ?。孵育菌液接種后，于28℃生化培養(yǎng)箱孵育24h。結(jié)果觀察取出試管觀察：試管中液體澄清為無菌生長(zhǎng)、半渾濁為少量菌生長(zhǎng)、渾濁為大量菌生長(zhǎng)，細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)照管渾濁、無菌控制對(duì)照管澄清。記錄試管中液體澄清的最小藥液濃度和半渾濁的藥液濃度。MIC測(cè)定根據(jù)最小藥液濃度和半渾濁的藥液濃度配置梯度藥液，按照5.3操作重做試驗(yàn)，讀取并記錄最小抑菌濃度（MIC）。質(zhì)控藥物的MIC在0.5μg/mL~2μg/mL范圍內(nèi)，試驗(yàn)有效。抑菌圈測(cè)定菌板制備取上述菌懸液100μL，注入營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中，用三角涂棒將菌懸液均勻涂抹于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上。藥液配置按照MIC的2、4、6、8、10、12、14、16、18、20倍濃度分別配置藥液。藥敏試驗(yàn)無菌條件下，將經(jīng)酒精燈火焰燒熱一端的牛津杯放置在涂抹了菌懸液的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，間距3cm，每個(gè)培養(yǎng)基平板放置5個(gè)。將配置好的各種濃度藥液加入牛津杯杯體中，藥液加至滿而不溢為止。將營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板置37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。抑菌圈測(cè)量取出營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，測(cè)量記錄抑菌圈直徑，并按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）最新版的藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)判斷各種濃度藥液是否敏感。判定抑菌圈測(cè)定敏感的最小藥物濃度＜說明書的用藥濃度，判定該抗生素有效。消毒劑藥效檢驗(yàn)藥物稱量按藥物使用說明書用量的1000倍，用精確度為0.1mg的分析天平精確稱量藥物，置于1L容量瓶中。某廠家生產(chǎn)的某品牌含量8%二氧化氯，說明書治療用量為每667m3水體用100g～150g。取最大用量150g，用藥濃度為0.2249mg/L。稱量時(shí)，準(zhǔn)確稱取224.9mg二氧化氯，置于1000mL容量瓶中。母液制備向容量瓶加入蒸餾水溶解、稀釋，充分?jǐn)噭?，最后定?000mL。檢驗(yàn)養(yǎng)殖用水消毒取30L塑料容器加入20L養(yǎng)殖用水，然后從容器中準(zhǔn)確取出20mL水再加20mL母液，混勻靜置消毒2h。細(xì)菌培養(yǎng)分別取養(yǎng)殖用水和消毒2h后水體各100μL，在無菌條件下，分別涂布于無菌平板上，28℃培養(yǎng)24h。結(jié)果觀察培養(yǎng)24h后，取出平板觀察菌落生長(zhǎng)情況。判定涂布養(yǎng)殖用水平板長(zhǎng)菌，涂布消毒2h后水體平板不長(zhǎng)菌，判定該消毒劑有效。殺蟲驅(qū)蟲藥藥效檢驗(yàn)外用殺蟲藥藥物稱量按藥物使用說明書用量的1000倍，用精確度為0.1mg的分析天平精確稱量藥物，置于1L容量瓶中。如1包200g的殺蟲藥可用于8畝1m水深池塘，即每667m3水體用25g，用藥濃度為0.0375mg/L。稱量時(shí)，準(zhǔn)確稱取37.5mg殺蟲藥，置于1000mL容量瓶中。母液制備向加入容量瓶加入蒸餾水溶解、稀釋，充分?jǐn)噭?，最后定?000mL。母液稀釋取50L塑料容器4個(gè)，分別加入40L水，然后分別從容器中準(zhǔn)確移出40mL水再加40mL母液，充分?jǐn)噭?。再?0L塑料容器1個(gè)，加入40L水，作為對(duì)照。檢驗(yàn)向4個(gè)容器分別放6尾～8尾確診感染寄生蟲的魚種入稀釋母液的容器，30min后用生物顯微鏡逐一檢查魚體表或鰓上寄生蟲的脫落或死亡情況。判定2h內(nèi)，檢驗(yàn)組魚體表或鰓上寄生蟲大部分脫落或死亡，對(duì)照組魚體表或鰓上寄生蟲沒有脫落，判定該殺蟲藥有效。內(nèi)服驅(qū)蟲藥病魚樣品暫養(yǎng)取250L塑料容器4個(gè)，3個(gè)為檢驗(yàn)組，1個(gè)為對(duì)照組；分別加入養(yǎng)殖用水150L，各放養(yǎng)確診感染體內(nèi)寄生蟲的魚種7尾～8尾，不間斷充氣增氧，投喂飼料1次/d，吸污1次/d。魚種放養(yǎng)前稱量總重。藥物稱量根據(jù)暫養(yǎng)魚種總重和藥物使用說明書，計(jì)算出魚種用藥總量，按魚種用藥總量的1000倍精確度稱量藥物，置于1L容量瓶中。母液制備向容量瓶加入蒸餾水溶解、稀釋，充分?jǐn)噭?，最后定?000mL。藥餌制作根據(jù)魚種總重，按投率2.5%計(jì)算出飼料日投喂量。準(zhǔn)確吸取1mL母液，用蒸餾水稀釋5倍～10倍，均勻拌入飼料中，靜置15min。藥餌投喂按說明書給檢驗(yàn)組的魚投喂藥餌1個(gè)療程，1次/d；對(duì)照組投喂飼料1次/d。判定投喂藥餌1個(gè)療程后次日，逐一解剖魚，檢查體內(nèi)寄生蟲，檢驗(yàn)組魚無寄生蟲的，對(duì)照組魚有寄生蟲的，判定該驅(qū)蟲藥有效。水質(zhì)改良劑藥效檢驗(yàn)藥物稱量根據(jù)藥物使用說明書計(jì)算出10L水的用藥量，按10L水用藥量的1000倍，精確稱量藥物，置于30L塑料容器中。母液制備向塑料容器加入蒸餾水，充分?jǐn)噭?，最后定?0L。母液稀釋取250L塑料容器加入200L養(yǎng)殖池水，用快速水質(zhì)監(jiān)測(cè)儀檢測(cè)水體的氨氮，確定氨氮含量＞1mg/L；然后從容器中準(zhǔn)確取出2L水再加2L母液，充分?jǐn)噭?，靜置1h后再檢測(cè)水體的氨氮。判定用藥前水質(zhì)的氨氮含量＞1mg/L，用藥1h后水質(zhì)的氨氮≤0.3mg/L，判定該水質(zhì)改良劑有效。免疫增強(qiáng)劑藥效檢驗(yàn)病龜樣品暫養(yǎng)取50L塑料容器4個(gè)，3個(gè)為檢驗(yàn)組，1個(gè)為對(duì)照組；分別加入養(yǎng)殖池水20L，放養(yǎng)精神萎靡不振、兩眼暗淡無神、活動(dòng)遲緩的幼龜7只～8只，投喂飼料1次/d，換水1次/d。幼龜放養(yǎng)前稱量總重。藥物稱量根據(jù)暫養(yǎng)幼龜總重和藥物使用說明書計(jì)算出幼龜用藥總量，按幼龜用藥總量的1000倍精確稱量藥物，置于1000mL容量瓶中。母液制備向容量瓶加入蒸餾水溶解、稀釋，充分?jǐn)噭?，最后定?000mL。藥餌制作根據(jù)幼龜總重，按投率2.5%計(jì)算出飼料