體外診斷試劑培訓

體外診斷產(chǎn)品的生產(chǎn)監(jiān)管北京市醫(yī)療器械檢查所

重要內(nèi)容體外診斷產(chǎn)品的種類體外診斷產(chǎn)品生產(chǎn)的基本原理生化類產(chǎn)品免疫類產(chǎn)品分子類和血液類溯源性問題

體外診斷作用“醫(yī)生的眼睛”預測和診斷功能，如：血細胞抗體（肝炎、艾滋、IGE）基因（唐氏、小兒耳聾、遺傳缺陷基因BRCA1）。療效和健康監(jiān)測，如：代謝物（血糖）標志物（AFP、PSA、HPV）蛋白、微量元素（白蛋白、Ca);

體外診斷產(chǎn)品的類別體外診斷根據(jù)風險分3類：III類：致病性病原體抗原、抗體以及核酸、人類基因檢測、腫瘤標志物、血型、組織配型、變態(tài)反應（過敏原）等；II類：除III、I類，如：蛋白質(zhì)、糖類、酯類、酶類、維生素、無機離子、激素等；I類：微生物培養(yǎng)基（不用于微生物鑒別和藥敏試驗）、樣本處理用產(chǎn)品，如溶血劑、稀釋液、染色液等。

體外診斷產(chǎn)品的類別體外診斷專業(yè)分類:生化、免疫、分子生物學、微生物、體液等,臨床使用超過千種。生化：生物化學反應或免疫反應(生化儀的項目），酶類、糖類、脂類、蛋白、無機元素、肝功能、腎功等指標。免疫：抗原與抗體相結(jié)合的特異性反應，傳染性疾病、內(nèi)分泌、腫瘤、藥物檢測、血型鑒定等。分子診斷：分子生物學措施檢測患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的構(gòu)造或體現(xiàn)水平的變化，重要用于肝炎、性病、優(yōu)生優(yōu)育、遺傳病基因、腫瘤等檢測。

體外診斷產(chǎn)品的類別微生物：通過培養(yǎng)鑒別細菌等微生物的措施。血液學：通過電阻抗、激光和高能電磁波等技術檢測血液中血細胞的數(shù)量和分類的措施。

生化類產(chǎn)品基本措施生化分析儀反應的一般稱為生化試劑兩點法、終點法、速率法、比濁法兩點法：測定酶反應開始后某一時間內(nèi)(t1到t2)產(chǎn)物或底物濃度的總變化量以求取酶反應初速度的措施。終點法：通過測定酶反應開始到反應到達平衡時產(chǎn)物或底物濃度總變化量，以求出酶活力的措施，亦稱平衡法。

速率法：是指持續(xù)測定(每15秒~1分鐘監(jiān)測一次)酶反應過程中某一反應產(chǎn)物或底物的濃度隨時間的變化來求出酶反應的初速度的措施，即持續(xù)監(jiān)測法。透射比濁法透射比濁法可用于測定產(chǎn)生濁度反應的項目。

生化類產(chǎn)品基本措施

終點法常用的有總膽紅素（氧化法或重氮法）、結(jié)合膽紅素（氧化法或重氮法）、血清總蛋白（雙縮脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、總膽汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、總膽固醇（膽固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白膽固醇（直接測定法）、鈣（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、鎂（二甲苯胺藍法）。兩點法：

苦味酸法測定肌酐采用此法速率法對于酶活性測定，如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、γ谷氨氨?；D(zhuǎn)移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。某些代謝物酶法測定的項目如己糖激酶法測定葡萄糖、脲酶偶聯(lián)法測定尿素等，也可用持續(xù)監(jiān)測法。（7個酶加葡萄糖、尿素）免疫比濁法載脂蛋白、免疫球蛋白、補體、抗“O”、類風濕因子，以及血清中的其他蛋白質(zhì)如前白蛋白、結(jié)合珠蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等均可用此法。(蛋白）

生化類產(chǎn)品闡明書

生化分析儀闡明書除法規(guī)有關規(guī)定外，還至少包括：合用機型反應溫度（37度）主波長、次波長

孵育時間（終點法或兩點法）延遲時間（持續(xù)監(jiān)測法）、持續(xù)監(jiān)測時間在延遲時間之后即開始，一般為60～120s不少于4個吸光度檢測點（3個吸光度變化值）；加樣量校準液個數(shù)（非線性必須兩個以上）等。

原則液個數(shù)的原因校準液個數(shù)濃度校準曲線線性好并通過坐標零點的，可采用一種校準液；線性好但不通過坐標零點，應使用兩個校準液；對于校準曲線呈非線性者，必須使用兩個以上校準液。每一種校準液都要有一種合適的濃度。吸光度濃度105600030008生化類產(chǎn)品基本原理氧化反應:還原反應：

生化類產(chǎn)品質(zhì)量風險點分析原材料(輔酶I)（進貨檢查記錄或生產(chǎn)記錄中，應包括輔酶空白吸光度的檢查記錄，且不一樣的類別符合下述特點）還原性輔酶I重要用于下降反應，當還原性輔酶I質(zhì)量出現(xiàn)問題時，試劑的空白吸光度減少，導致試劑測量成果的不確定度變大，測量的敏捷度也隨之減少，測量線性范圍變小。氧化性輔酶I重要用于上升反應，當氧化性輔酶I質(zhì)量出現(xiàn)問題時，試劑的空白吸光度升高，導致試劑測量成果的不確定度變大，測量的敏捷度也隨之減少，測量線性范圍變小。

生化類產(chǎn)品質(zhì)量技術風險點分析生產(chǎn)記錄中應包括試劑用水的電導率、PH值及微生物檢查記錄生化類產(chǎn)品質(zhì)量風險點分析

免疫類產(chǎn)品基本原理Elisa反應的基本原理（酶標儀、發(fā)光儀等）將具有已知抗體的抗血清吸附在微量滴定板上的小孔里，洗滌一次；②加待測抗原，如兩者是特異的，則發(fā)生結(jié)合，然后把多出抗體洗除；③加入與待測抗原呈特異反應的酶聯(lián)抗體（二抗），使形成“夾心”；④加入該酶的底物，若看到有色的酶解產(chǎn)物產(chǎn)生，闡明在孔壁上存在對應的抗原。

免疫類產(chǎn)品質(zhì)量技術風險點分析辣根過氧化物酶過氧化物酶（HRP）廣泛分布于植物中，辣根中含量最高，從辣根中提取的稱辣根過氧化物酶（HRP），酶蛋白和輔基的最大吸取光譜分別為275nm和403nm。酶的純度以RZ表達：RZ=OD403/OD275純酶的RZ多在3.0以上，最高為3.4。RZ在0.6如下的酶制品為粗酶，非酶蛋白約占75%，不能用于標識。RZ在2.5以上者方可用于標識。（檢查進貨檢查記錄或生產(chǎn)過程記錄）

免疫產(chǎn)品質(zhì)量風險點分析酶與抗體的活性常用瓊脂擴散或免疫電泳法，使抗原與抗體形成沉淀線，經(jīng)PBS漂洗1天，再以蒸餾水浸泡1小時，將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色，假如出現(xiàn)應有的顏色反應，再用生理鹽水浸泡，顏色仍然不褪，表達結(jié)合物既有酶的活性，也有抗體活性。良好的結(jié)合物在顯色后，瓊擴滴度應在1:16以上。另一種測定措施是用系列稀釋的酶標抗體直接以ELISA措施進行方陣滴定，此法不僅可以測定標識效果，還可以確定酶標抗體的使用濃度。

免疫類產(chǎn)品質(zhì)量風險點分析在產(chǎn)品進貨檢查記錄或生產(chǎn)記錄中檢查如下內(nèi)容：1、酶標識二抗的活性；2、用于ELISA的結(jié)合物的酶量為400(g/ml時效果一般，為500(g/ml時效果很好，達1000(g/ml時效果最佳；3、酶結(jié)合率為7%時效果一般，為9%－10%很好，達30%以上最佳；4、一抗進貨檢查記錄，單抗還是多抗，也可小樣測試活性；5、一抗包被的工藝記錄與質(zhì)量體系文獻中規(guī)定與否一致；5、儲存環(huán)境同生化產(chǎn)品；

分子類產(chǎn)品基本原理PCR(聚合酶鏈式反應）是運用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（常常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基于聚合酶制造的PCR儀實際就是一種溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。

分子類產(chǎn)品質(zhì)量風險點

1、引物質(zhì)量，多為購置，可做小樣，采購記錄中查小樣測試記錄；2、聚合酶質(zhì)量，多為購置，可測定，可做小樣，采購記錄中查小樣測試記錄；3、內(nèi)標：已知帶有引物片段樣本，與被測樣本同步擴增，應顯示陽性，檢查測試記錄；4、PCR生產(chǎn)企業(yè)控溫精度（95度、55度和75度）和變化率的記錄。5、實地檢查PCR試劑的質(zhì)控（內(nèi)標）和生產(chǎn)與否在各自獨立的建筑中進行。并且試驗室分為試劑配制區(qū)、樣品處理區(qū)、核酸擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)。并且考慮房間的正負壓保護樣本不被污染、人員不被感染。95度(高溫）55度低溫75度（反應溫度）95度

血液類產(chǎn)品基本原理懸浮在電解液中的顆粒/細胞，隨電解液通過小孔管時，因取代了相似體積的電解液，在恒電流設計的電路中導致小孔管內(nèi)外兩電極間電阻發(fā)生瞬時變化，而產(chǎn)生了電位脈沖。脈沖信號的大小和次數(shù)與顆粒的大小和數(shù)目成正比。

血液類產(chǎn)品質(zhì)量控制點1、生產(chǎn)記錄中檢查溶血劑、稀釋液的顆粒物、微生物檢查記錄；2、血細胞分析儀稀釋液生產(chǎn)車間需控制潔凈度和菌落數(shù)；3、檢查室的血液分析儀與否采用定值血定期校準；4、檢查室的血液分析儀內(nèi)部質(zhì)控成果，紅白偏差與否符合規(guī)定（尤其是血小板）。

體外診斷試劑溯源校準液個數(shù)濃度校準曲線線性好并通過坐標零點的，可采用一種校準液；線性好但不通過坐標零點，應使用兩個校準液；對于校準曲線呈非線性者，必須使用兩個以上校準液。每一種校準液都要有一種合適的濃度。吸光度濃度105600030008國家食品藥物監(jiān)督管理局

體外診斷試劑監(jiān)督抽驗—61個國產(chǎn)TG試劑新鮮混合血清最大正偏倚為22.1％，最大負偏倚為-18.9％，39%bias＜±5％

體外診斷試劑溯源校準品與質(zhì)控品區(qū)別校準品目的是為了產(chǎn)品的精確性，溯源性是必須的；質(zhì)控品目的是為了產(chǎn)品的精密度，穩(wěn)定性是必須的，可不具有溯源性。溯源性有多重要？臨床檢查：對搜集的患者標本只做一次檢查，就發(fā)出匯報精確性局限性是重要的臨床檢查質(zhì)量問題影響檢查成果“臨床精確性”的原因是多方面的－樣品采集與處理，病人準備，(生物變異)，人為錯誤－措施：對的度（校準）、精密度、特異性、線性、檢測限等溯源理論上處理的是對的度問題(校準問題)

體外診斷試劑溯源

體外診斷試劑溯源原則物質(zhì)制造商選定措施主校準品制造商常設措施產(chǎn)品校準品常規(guī)措施血樣

體外診斷試劑溯源1、有溯源性才能判斷精確性；2、檢查成果才能互認；目前問題1、CRM缺乏；2、反應原理差異，導致成果有差異，但Cutoff值也不一樣，不影響臨床判斷，成果無法互認；3、各自溯源途徑不一樣，成果存在差異。

體外診斷試劑溯源目前采用的精確性評價措施1.國標物質(zhì)、國際原則物質(zhì)（有溯源性）（查驗原則物質(zhì)證明材料，一般為證書）2.回收試驗（有一定溯源性）（添加物質(zhì)純度，試驗記錄）3