《蛋白表達(dá)純化》課件

蛋白表達(dá)純化歡迎參加蛋白表達(dá)純化課程。本課程將深入探討蛋白質(zhì)表達(dá)和純化的關(guān)鍵技術(shù)，為您的研究工作提供實(shí)用指導(dǎo)。課程目標(biāo)全面理解掌握蛋白質(zhì)表達(dá)和純化的基本原理與方法。實(shí)踐技能學(xué)習(xí)各種表達(dá)系統(tǒng)和純化技術(shù)的操作步驟。問題解決培養(yǎng)優(yōu)化蛋白質(zhì)產(chǎn)量和純度的能力。應(yīng)用拓展了解蛋白質(zhì)研究的最新進(jìn)展和應(yīng)用前景。蛋白質(zhì)概述結(jié)構(gòu)單元蛋白質(zhì)是生命的基本構(gòu)建模塊，由氨基酸鏈組成。功能多樣蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)執(zhí)行各種關(guān)鍵功能，如催化、信號(hào)傳導(dǎo)等。基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的最終產(chǎn)物，反映遺傳信息。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)1四級(jí)結(jié)構(gòu)多個(gè)亞基的組合2三級(jí)結(jié)構(gòu)多肽鏈的三維折疊3二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋和β折疊4一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸序列蛋白質(zhì)功能酶催化加速生化反應(yīng)，如消化酶分解食物。信號(hào)傳導(dǎo)激素和受體蛋白參與細(xì)胞間通訊。結(jié)構(gòu)支持如肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白構(gòu)成肌肉纖維。免疫防御抗體蛋白識(shí)別和中和外來病原體。蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)原核表達(dá)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，適合簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)。真核表達(dá)酵母、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)，適合復(fù)雜蛋白質(zhì)。無細(xì)胞表達(dá)體外快速表達(dá)系統(tǒng)，適合特殊蛋白質(zhì)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)1優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)快速，表達(dá)量高，成本低。2局限性不適合表達(dá)復(fù)雜糖蛋白或膜蛋白。3應(yīng)用廣泛用于簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)的大量生產(chǎn)。酵母表達(dá)系統(tǒng)選擇菌株選擇合適的酵母菌株，如釀酒酵母。構(gòu)建載體設(shè)計(jì)并構(gòu)建表達(dá)載體，插入目標(biāo)基因。轉(zhuǎn)化培養(yǎng)將載體轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞，篩選陽性克隆。誘導(dǎo)表達(dá)添加誘導(dǎo)劑，促進(jìn)目標(biāo)蛋白表達(dá)。昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)1構(gòu)建桿狀病毒將目標(biāo)基因插入桿狀病毒基因組。2感染昆蟲細(xì)胞用重組病毒感染昆蟲細(xì)胞，如Sf9細(xì)胞。3蛋白質(zhì)表達(dá)感染細(xì)胞大量表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)。4收集純化收集培養(yǎng)上清或裂解細(xì)胞，純化目標(biāo)蛋白。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)基因構(gòu)建設(shè)計(jì)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，插入目標(biāo)基因。細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)HEK293或CHO等哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染表達(dá)使用脂質(zhì)體或病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，誘導(dǎo)表達(dá)。蛋白質(zhì)表達(dá)策略1優(yōu)化表達(dá)條件調(diào)整溫度、pH和誘導(dǎo)時(shí)間。2融合標(biāo)簽設(shè)計(jì)添加His標(biāo)簽或GST標(biāo)簽輔助純化。3密碼子優(yōu)化根據(jù)宿主偏好性優(yōu)化基因序列。4表達(dá)系統(tǒng)選擇根據(jù)蛋白特性選擇合適表達(dá)系統(tǒng)。突變體構(gòu)建定點(diǎn)突變改變特定氨基酸，研究其功能。使用PCR或基因合成技術(shù)實(shí)現(xiàn)。截短突變刪除蛋白質(zhì)的某些區(qū)域，研究結(jié)構(gòu)域功能。常用于提高可溶性。插入突變?cè)诘鞍踪|(zhì)中插入新的氨基酸序列，如標(biāo)簽或功能域。轉(zhuǎn)化與篩選1制備感受態(tài)細(xì)胞處理宿主細(xì)胞，使其能夠吸收外源DNA。2轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞。3平板篩選在含抗生素的培養(yǎng)基上篩選陽性轉(zhuǎn)化子。4鑒定驗(yàn)證通過PCR或測(cè)序確認(rèn)目標(biāo)基因的存在。誘導(dǎo)表達(dá)IPTG誘導(dǎo)用于lac操縱子控制的表達(dá)系統(tǒng)，如pET系統(tǒng)。甲醇誘導(dǎo)常用于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)。四環(huán)素誘導(dǎo)用于Tet操縱子控制的表達(dá)系統(tǒng)。熱激誘導(dǎo)利用熱激啟動(dòng)子控制表達(dá)。細(xì)胞裂解超聲破碎利用超聲波破壞細(xì)胞膜，適用于小規(guī)模樣品。高壓均質(zhì)通過高壓使細(xì)胞破裂，適合大規(guī)模制備。凍融法反復(fù)凍融使細(xì)胞破裂，溫和但效率較低。蛋白質(zhì)分離離心分離去除細(xì)胞碎片和不溶性物質(zhì)。沉淀分離利用鹽析或有機(jī)溶劑沉淀目標(biāo)蛋白。膜過濾使用不同孔徑的膜分離不同大小的蛋白。層析分離根據(jù)蛋白質(zhì)性質(zhì)進(jìn)行精細(xì)分離。層析技術(shù)親和層析原理利用蛋白質(zhì)與特定配體的特異性結(jié)合進(jìn)行分離。常用標(biāo)簽His標(biāo)簽、GST標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽等。洗脫方法競(jìng)爭(zhēng)性洗脫或pH變化洗脫。離子交換層析陽離子交換分離帶正電荷的蛋白質(zhì)。陰離子交換分離帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)。pH影響通過調(diào)節(jié)pH改變蛋白質(zhì)電荷。鹽梯度洗脫使用遞增的鹽濃度梯度洗脫蛋白質(zhì)。凝膠過濾層析1原理根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小進(jìn)行分離。2優(yōu)勢(shì)可用于蛋白質(zhì)脫鹽和分子量測(cè)定。3局限性分辨率較低，不適合分離相近大小的蛋白。4應(yīng)用常用于蛋白質(zhì)純化的最后一步。反相層析原理基于蛋白質(zhì)疏水性差異進(jìn)行分離。固定相通常使用C18或C8修飾的硅膠。洗脫使用有機(jī)溶劑濃度梯度洗脫。純化過程優(yōu)化1條件篩選優(yōu)化緩沖液、pH和鹽濃度。2多步策略組合不同純化方法提高純度。3添加劑使用使用還原劑或穩(wěn)定劑提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。4流程自動(dòng)化利用FPLC系統(tǒng)提高效率和重復(fù)性。純度分析電泳分析SDS評(píng)估蛋白質(zhì)純度和分子量。色譜分析HPLC或SEC評(píng)估純度和聚集狀態(tài)。質(zhì)譜分析精確測(cè)定蛋白質(zhì)分子量和修飾。SDS樣品制備蛋白質(zhì)與SDS變性，加熱處理。電泳分離在聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離。染色顯色使用考馬斯亮藍(lán)或銀染色顯示蛋白質(zhì)條帶。結(jié)果分析根據(jù)條帶數(shù)量和強(qiáng)度評(píng)估純度。Westernblot1電泳分離SDS分離蛋白質(zhì)。2轉(zhuǎn)膜將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF或硝酸纖維素膜上。3抗體雜交使用特異性抗體檢測(cè)目標(biāo)蛋白。4顯影檢測(cè)使用化學(xué)發(fā)光或熒光方法檢測(cè)信號(hào)。ELISA直接ELISA抗原直接吸附于板上，用標(biāo)記抗體檢測(cè)。間接ELISA使用未標(biāo)記一抗和標(biāo)記二抗檢測(cè)。夾心ELISA用捕獲抗體和檢測(cè)抗體夾心檢測(cè)抗原。競(jìng)爭(zhēng)ELISA樣品抗原與標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體。活性測(cè)定酶活性測(cè)定測(cè)量底物轉(zhuǎn)化率或產(chǎn)物生成速率。結(jié)合活性測(cè)定評(píng)估蛋白質(zhì)與配體的親和力。細(xì)胞功能測(cè)定觀察蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞行為的影響。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表征X射線晶體學(xué)高分辨率解析蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。需要獲得高質(zhì)量晶體。核磁共振(NMR)在溶液狀態(tài)下研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)。適用于小型蛋白。冷凍電鏡觀察大型蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。近年來分辨率顯著提高。結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)序列同源性建?；谝阎吹鞍捉Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)。從頭預(yù)測(cè)僅依據(jù)氨基酸序列預(yù)測(cè)三維結(jié)構(gòu)。人工智能方法如AlphaFold2，利用深度學(xué)習(xí)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。分子動(dòng)力學(xué)模擬模擬蛋白質(zhì)在溶液中的動(dòng)態(tài)行為。結(jié)構(gòu)確定1功能解析基于結(jié)構(gòu)推測(cè)蛋白質(zhì)功能2結(jié)構(gòu)精修優(yōu)化初始模型3數(shù)據(jù)收集X射線衍射或NMR譜圖4樣品制備蛋白質(zhì)結(jié)晶或同位素標(biāo)記應(yīng)用案例分享胰島素生產(chǎn)重組DNA技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素，治療糖尿病。單克隆抗體利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)治療性抗體。CRISPR/