《煙用添加劑中對(duì)乙氧基苯脲的測(cè)定 高效液相色譜法編制說(shuō)明》

《煙用添加劑中對(duì)乙氧基苯脲的測(cè)定高效液相色譜法》標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目編制說(shuō)明1工作簡(jiǎn)況1.1任務(wù)來(lái)源根據(jù)國(guó)家煙草專賣局國(guó)煙科[2010]91號(hào)計(jì)劃下達(dá)的工作計(jì)劃，制訂《煙用添加劑中對(duì)乙氧基苯脲的測(cè)定高效液相色譜法》行業(yè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。1.2項(xiàng)目承擔(dān)單位、協(xié)作單位及主要分工根據(jù)國(guó)家煙草專賣局標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目專項(xiàng)合同（合同號(hào)：2010B039），該項(xiàng)工作由云南煙草科學(xué)研究院牽頭承擔(dān)，主要負(fù)責(zé)本標(biāo)準(zhǔn)的研究、組織以及起草工作。紅云紅河煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司、紅塔煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司兩家相關(guān)單位作為協(xié)作單位參與了本標(biāo)準(zhǔn)的共同實(shí)驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)文本的起草工作。云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)站、上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司、湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司等三家單位作為共同實(shí)驗(yàn)方也參與了該標(biāo)準(zhǔn)的共同實(shí)驗(yàn)相關(guān)工作。1.3主要工作過(guò)程該項(xiàng)工作主要分四個(gè)階段。第一階段前期調(diào)研階段項(xiàng)目組成立后，首先查閱收集了國(guó)內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)資料。查閱結(jié)果表明：國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織未制定煙用添加劑中對(duì)乙氧基苯脲的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，有關(guān)對(duì)乙氧基苯脲的檢測(cè)技術(shù)的報(bào)道較少。目前能檢索到的食品、飲料中對(duì)乙氧基苯脲測(cè)定的權(quán)威相關(guān)文獻(xiàn)主要有：①美國(guó)AOAC17th,2000官方方法957.11規(guī)定食品中對(duì)乙氧基苯脲的測(cè)定,原理是比色法，先用薄層色譜分離，再用比色法來(lái)進(jìn)行定性和半定量分析，雖然薄層色譜兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)快速，價(jià)格低廉，但分析時(shí)間長(zhǎng)、準(zhǔn)確度較差，無(wú)準(zhǔn)確的定量結(jié)果。②2009年英國(guó)頒布了測(cè)定食品中9種甜味劑的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)(標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：09/30197132DC)，該標(biāo)準(zhǔn)方法的前處理步驟包括：取5克均質(zhì)樣品至50mL容量瓶，用pH4.5的緩沖液溶解稀釋至刻度，振蕩超聲15分鐘，然后以10分鐘4000轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速離心。離心上清液經(jīng)C18固相萃取柱凈化，緩沖溶液清洗、甲醇洗脫之后，用液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC-ELSD）同時(shí)檢測(cè)包括對(duì)乙氧基苯脲在內(nèi)的9種甜味劑。此外，在早期測(cè)定對(duì)乙氧基苯脲的方法中還出現(xiàn)了分光光度法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法、液相色譜法。其中分光光度法是通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的熒光性間接測(cè)定對(duì)乙氧基苯脲；氣相色譜法的前處理過(guò)程需多次有機(jī)溶劑提取與萃取，導(dǎo)致方法回收率較差；而對(duì)于毛細(xì)管電泳法而言，該方法是一種有特色的方法，但由于該儀器設(shè)備的普及性問(wèn)題影響了該方法的發(fā)展。因此這些早期的方法因?yàn)楦鞣N各樣的問(wèn)題，并不是檢測(cè)對(duì)乙氧基苯脲的主流方法。文獻(xiàn)調(diào)研表明：對(duì)于煙用香精及料液樣品，液相色譜法的前處理步驟較氣相色譜法有著明顯的優(yōu)勢(shì)：無(wú)需過(guò)多的提取、凈化、濃縮等過(guò)程，是目前檢測(cè)對(duì)乙氧基苯脲的主流方法。項(xiàng)目組在充分考慮行業(yè)內(nèi)各卷煙企業(yè)的現(xiàn)有設(shè)備技術(shù)狀況的基礎(chǔ)上，根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果，項(xiàng)目組進(jìn)行了煙用添加劑中對(duì)乙氧基苯脲的高效液相色譜檢測(cè)方法的研究工作，以此法作為煙用添加劑中對(duì)乙氧基苯脲的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法，力求使標(biāo)準(zhǔn)既具有科學(xué)性、先進(jìn)性，又具有適用性和可操作性。同時(shí)也充分考慮到在實(shí)際工作中，如果需要對(duì)色譜峰進(jìn)行定性確認(rèn)時(shí)，可以將所建立的高效液相色譜法移置到高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）檢測(cè)方法中，解決實(shí)際樣品中對(duì)乙氧基苯脲定性判斷問(wèn)題。第二階段試驗(yàn)研究階段項(xiàng)目組根據(jù)選定的檢測(cè)方法，按預(yù)定實(shí)驗(yàn)方案，對(duì)檢測(cè)方法中涉及的煙用添加劑樣品稱樣量、萃取溶劑選擇、溶劑用量、萃取條件和體積的選擇、高效液相色譜條件選擇等方面進(jìn)行了嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致的試驗(yàn)和優(yōu)化，確定了檢測(cè)方法的相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件，并對(duì)方法回收率、精密度、檢出限等指標(biāo)進(jìn)行了方法評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。第三階段補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)階段2010年11月和2011年9月，項(xiàng)目組分別召開(kāi)了兩次標(biāo)準(zhǔn)制訂研討會(huì)，與會(huì)專家對(duì)項(xiàng)目組所建立的《煙用添加劑中對(duì)乙氧基苯脲的測(cè)定高效液相色譜法》標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)行了研討，根據(jù)研討意見(jiàn)，項(xiàng)目組于2010年11月-2011年10月期間進(jìn)行了補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，基本完成檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)研究。第四階段方法比對(duì)實(shí)驗(yàn)階段為了考察方法在不同實(shí)驗(yàn)室之間的再現(xiàn)性，項(xiàng)目組選取3個(gè)煙用添加劑樣品（表香、料液、浸膏），于2011年11月-2011年12月，分別在云南煙草科學(xué)研究院、云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)站、紅塔煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司、紅云紅河煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司、上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司、湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司等6家實(shí)驗(yàn)室，采用項(xiàng)目組確定方法對(duì)選定樣本進(jìn)行了重復(fù)檢測(cè)，驗(yàn)證結(jié)果表明：相同樣品在不同實(shí)驗(yàn)室的測(cè)試結(jié)果具有良好的再現(xiàn)性。1.4標(biāo)準(zhǔn)主要起草人及其所做的工作張承明：試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與研究；陳永寬、繆明明：試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與技術(shù)指導(dǎo)；孫文梁：技術(shù)指導(dǎo)、標(biāo)準(zhǔn)起草指導(dǎo)；李勁竹、庹蘇行、朱麗、王素娟、李雪梅、王璐、賀兵、譚建林：方法研究與比對(duì)實(shí)驗(yàn)。2相關(guān)領(lǐng)域的國(guó)、內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)研究和制修訂情況2.1相關(guān)領(lǐng)域的國(guó)、內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)研究情況國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）未制定煙用添加劑中對(duì)乙氧基苯脲的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。2.2標(biāo)準(zhǔn)編制原則及主要內(nèi)容確定的依據(jù)2.2本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了煙用添加劑中對(duì)乙氧基苯脲的高效液相色譜測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于煙用香精及料液中對(duì)乙氧基苯脲的測(cè)定。2.2根據(jù)國(guó)家煙草專賣局國(guó)煙科[2010]91號(hào)下達(dá)的工作計(jì)劃，進(jìn)行《煙用添加劑中對(duì)乙氧基苯脲的測(cè)定高效液相色譜法》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制訂。項(xiàng)目組充分考慮行業(yè)內(nèi)各卷煙企業(yè)的現(xiàn)有設(shè)備以及文獻(xiàn)檢測(cè)方法所涉及的儀器設(shè)備兩方面情況的前提下，采用高效液相色譜法作為煙用添加劑中對(duì)乙氧基苯脲的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法。并遵照科學(xué)性、先進(jìn)性、適用性和可操作性標(biāo)準(zhǔn)制訂常規(guī)原則，進(jìn)行了本檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的研究制訂工作。2.2項(xiàng)目組根據(jù)選定的檢測(cè)方法，按預(yù)定實(shí)驗(yàn)方案，對(duì)檢測(cè)方法中涉及的相關(guān)條件實(shí)驗(yàn)及方法回收率、精密度、檢出限等指標(biāo)進(jìn)行了嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致的試驗(yàn)，主要內(nèi)容如下：稱取1g（精確至0.1mg）試樣于50mL具塞的錐形瓶中，加入15mL水（4.2.1），在150r/min條件下振蕩萃取10min，將振蕩萃取液移入25mL具塞容量瓶中，用5mL水（4.2.1）清洗錐形瓶，將清洗溶液注入容量瓶中，并用水（4.2.1）定容至刻度，搖勻，靜置備用。取C18固相萃取柱，分別用5mL甲醇（4.2.2）和5mL水（4.2.1）進(jìn)行活化，準(zhǔn)確移取試樣萃取上層清液5mL上柱，用5mL水（4.2.1）清洗，用6mL洗脫溶劑（4.2.9）洗脫，用洗脫溶劑（4.2.9）定容至10mL。C18固相萃取柱流速為1mL/min～2mL/min。取適量溶液過(guò)0.45μm濾膜（4.1.6），濾液用高效液相色譜儀分析。對(duì)于水不能分散的試樣，按照以下方法處理。稱取1g（精確至0.1mg）試樣于50mL具塞的錐形瓶中，加入15mL二氯甲烷（4.2.4），在150r/min條件下振蕩萃取10min，將振蕩萃取液移入25mL具塞容量瓶中，用5mL二氯甲烷（4.2.4）清洗錐形瓶，將清洗溶液注入容量瓶中，并用二氯甲烷（4.2.4）定容至刻度，搖勻，靜置備用。取NH2固相萃取柱，分別用5mL甲醇（4.2.2）和5mL二氯甲烷（4.2.4）進(jìn)行活化，準(zhǔn)確移取試樣上層清液5mL上柱，用5mL二氯甲烷（4.2.4）清洗，用6mL洗脫溶劑（4.2.9）洗脫，用洗脫溶劑（4.2.9）定容至10mL。NH2固相萃取柱流速為1mL/min～2mL/min。取適量溶液過(guò)0.45μm濾膜（4.1.6），濾液用高效液相色譜儀分析。本方法中對(duì)乙氧基苯脲的檢出限為0.42mg/kg，定量限為1.40mg/kg，回收率在92.30%～96.28%之間（具體內(nèi)容見(jiàn)試驗(yàn)報(bào)告）。3標(biāo)準(zhǔn)預(yù)期產(chǎn)生的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益對(duì)乙氧基苯脲（4-Ethoxyphenyl-urea），俗名甘素（dulcin），亦稱甘精，是一種人工合成甜味劑，甜度大約是蔗糖的250倍。對(duì)乙氧基苯脲是酰胺類物質(zhì)，也是脲中的一類?；瘜W(xué)式為C9H12N2O2，CAS號(hào)為：150-69-6。1884年被JosephBerlinerbau發(fā)現(xiàn)，由于與糖精鈉相比之下沒(méi)有后苦味，7年以后進(jìn)行大批量生產(chǎn)，在20世紀(jì)初占有很大的市場(chǎng)，作為糖尿病患者的代糖。1951年美國(guó)FDA對(duì)對(duì)乙氧基苯脲的安全性提出了質(zhì)疑，1954年經(jīng)過(guò)多次的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了其能夠水解成氨基苯酚而引發(fā)腫瘤，從而退出市場(chǎng)。對(duì)乙氧基苯脲在人體中的吸入、分布、代謝及排泄目前并無(wú)資料。經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(兔與大鼠)結(jié)果顯示，三小時(shí)內(nèi)快速吸收進(jìn)入血液，但是從體內(nèi)代謝消失卻很慢。糞便中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)代謝物，除了脂肪之外的大部分組織中對(duì)乙氧基苯脲代謝消失很慢。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織與世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）建議每日容許攝取量：禁止使用。世界上大部分國(guó)家（美國(guó)、日本、中國(guó)臺(tái)灣、中國(guó)香港）均禁止食品中使用對(duì)乙氧基苯脲。有研究表明，成人攝入20-40g會(huì)頭暈，惡心，低血壓與發(fā)紺和高鐵血紅蛋白血癥。在我國(guó)，對(duì)乙氧基苯脲不在衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB2760允許使用的甜味劑名單范圍內(nèi)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，常在蜜餞食品中檢驗(yàn)出2008年國(guó)家局為了加強(qiáng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)控體系建設(shè)，擬定了煙用添加劑中16種禁用成分名單，對(duì)乙氧基苯脲是十六種成分之一。對(duì)于我國(guó)煙草行業(yè)，建立準(zhǔn)確可靠的煙用添加劑中對(duì)乙氧基苯脲的定量檢測(cè)方法是非常有必要的。由于煙用添加劑種類繁多，成分復(fù)雜，因此建立一種能夠準(zhǔn)確測(cè)定煙用添加劑中的對(duì)乙氧基苯脲含量的方法，一直都是一項(xiàng)極富挑戰(zhàn)性的工作。本標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)是建立煙用添加劑中對(duì)乙氧基苯脲的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，為卷煙產(chǎn)品安全監(jiān)控體系的構(gòu)建提供技術(shù)支持,為低危害成分卷煙產(chǎn)品開(kāi)發(fā)奠定技術(shù)基礎(chǔ)，具有一定的社會(huì)效益及潛在經(jīng)濟(jì)效益。4采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的情況目前沒(méi)有關(guān)于煙用添加劑中對(duì)乙氧基苯脲測(cè)定的相關(guān)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)，因此沒(méi)有進(jìn)行采用。5與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系本標(biāo)準(zhǔn)按照有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)規(guī)定，無(wú)任何違背。6作為強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)或推薦性標(biāo)準(zhǔn)的建議及主要依據(jù)介于目前煙草行業(yè)內(nèi)煙用添加劑中對(duì)乙氧基苯脲的定量檢測(cè)手段、儀器設(shè)備以及相關(guān)技術(shù)的現(xiàn)實(shí)情況，建議將《煙用添加劑中對(duì)乙氧基苯脲的測(cè)定高效液相色譜法》可作為推薦性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，提供給各卷煙企業(yè)、質(zhì)檢中心以及相關(guān)研究中心等檢測(cè)部門。7標(biāo)準(zhǔn)宣貫的要求和措施建議《煙用添加劑中對(duì)乙氧基苯脲的測(cè)定高效液相