保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定方法 高效液相色譜法 編制說(shuō)明

《保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定（征求意見(jiàn)稿）編制說(shuō)明根據(jù)《國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)關(guān)于下達(dá)2023年第二批推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)外文版計(jì)劃的通知》（國(guó)標(biāo)委發(fā)〔2023〕37號(hào)），《保健食品中大識(shí)別并作用于下丘腦、垂體等組織的雌激素受體（ER），影響動(dòng)物內(nèi)源性激素糖苷（Glucoside）、乙酰基葡萄糖苷（Acetylglucoside）、丙二?；咸烟擒眨∕alonylglucoside）的形式存在，具體有大豆苷、染料木苷、黃豆苷、乙酰大黃豆黃苷；二是游離的苷元型大豆異黃酮（Aglycone），只占總大豆異黃酮的圖1各類大豆異黃酮苷元及苷的結(jié)構(gòu)式A）大豆苷元（A1）大豆苷（A2）乙酰大豆苷（A3）丙二酰大豆苷（B）染料木素（B1）染料木苷（B2）乙酰染料木苷（B3）丙二酰染料木苷（C）黃豆黃素（C1）黃豆黃苷（C2）乙酰黃豆黃苷（C3）丙二酰黃豆黃苷。表1不同類型大豆異黃酮分子量名稱苷元形式苷形式乙酰糖苷形式丙二酰糖苷形式大豆苷元254.24416.38458.41502.42黃豆黃素284.26446.40488.44532.45染料木素270.24432.38474.41518.42保健食品產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)與審評(píng)有關(guān)規(guī)定的通知根據(jù)國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局官網(wǎng)有關(guān)大豆異黃酮保健食品注冊(cè)信息，截至在檢測(cè)方法方面，大部分企業(yè)采用GB/T23788規(guī)定的測(cè)量方法，大豆異黃分企業(yè)采用《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年版）中“金雀異黃素的測(cè)也有報(bào)道采用酶聯(lián)免疫法及毛細(xì)管電泳法測(cè)定。GB/T23788-2009《保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定方法-高效液相色譜法》為目前用于保健食品中測(cè)定大豆異黃大豆異黃酮相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)共5種，包括2種國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、2種農(nóng)業(yè)表2國(guó)內(nèi)不同大豆異黃酮的檢測(cè)方法NY/T3112-2017NY/T1252-2006豉量波清洗器中60℃提萃取柱中，用萃取柱中，用粒度5μm不銹鋼色RPC18柱流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相A：0.1%乙流動(dòng)相A：含有//甲醇水溶液，以80%甲醇為主；檢測(cè)波長(zhǎng)多為260nm，與實(shí)際紫外吸收光譜圖如果縮短大豆異黃酮的檢測(cè)時(shí)間，通常使用超高效液相色譜法，檢測(cè)時(shí)間為表3不同文獻(xiàn)中關(guān)于大豆異黃酮的測(cè)定方法文獻(xiàn)超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定種大豆異飼料中大豆異黃酮檢測(cè)方法豆芽發(fā)芽過(guò)程中黃酮類成分的檢測(cè)及超高效液相色譜法檢測(cè)保健品中的大豆異黃酮高效液相色譜法測(cè)定保健食品中大豆異黃酮含量的方法改進(jìn)豆?jié){中水溶性大豆異黃酮檢超高效液高效液相高效液相超高效液相高效液相色高效液相色譜法檢測(cè)料木素和豆黃素和大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料大豆苷、大豆黃素、染料木苷、大豆素、大豆黃苷、染料提取超聲提取甲醇超聲70%甲醇超超聲提取80%甲醇超水色譜柱HC18色譜柱AgilentZOR流動(dòng)相乙腈（A）流動(dòng)相A為磷酸水乙腈；流動(dòng)色譜流動(dòng)相A的0~磷酸水溶液至14~磷酸水溶液25~磷酸水溶液檢測(cè)GB/T23788-2009《保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定方法高效液相色譜法》于以下問(wèn)題1）缺少大豆異黃酮樣品制備步驟2）大豆異黃酮現(xiàn)有色譜條件需優(yōu)化3）現(xiàn)有色譜條件易與其他類黃酮類物質(zhì)（芍藥苷）保留時(shí)間重合；“14項(xiàng)保健食品分析方法標(biāo)準(zhǔn)啟動(dòng)會(huì)”修訂工作啟動(dòng)會(huì)，會(huì)上討論了《保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定》的修訂方案。組織各參與單位開展新修訂保健食品中大豆異黃酮測(cè)定方法的實(shí)驗(yàn)室間方法驗(yàn)本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》和GB/T20001.4-2015《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則》的要求進(jìn)行編寫，按照GB/T23788-2009《保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定方法高效液相色譜法》描保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定基本采用高效液相色譜法，以GB/T23788-2009為基礎(chǔ)修訂后的標(biāo)準(zhǔn)，適用于片劑、膠囊、口服液和酒劑等劑用性不足。通過(guò)多方面分析和驗(yàn)證，本次標(biāo)表4標(biāo)準(zhǔn)主要修訂要點(diǎn)苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素這6原標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品名稱有通效液相色譜儀分析（C18柱分離），依據(jù)分析（C18柱分離標(biāo)準(zhǔn)溶液原標(biāo)準(zhǔn)稱取4mg標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品稱取25mg標(biāo)準(zhǔn)品，先用二甲基亞溶解后即可使用甲醇定容至刻度。參考真實(shí)樣品測(cè)試數(shù)據(jù)，在大豆異黃酮保健食品試樣前處理色譜柱粒度5μm不銹鋼色譜烷基鍵合的表面多孔型反相色譜柱，4.6流動(dòng)相流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)公式根據(jù)市售大豆異黃酮樣品進(jìn)檢出限定5mg/kg，液體檢出限素）和9種糖苷（大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、乙酰大豆苷、乙酰黃豆黃苷、乙酰染料木苷、丙二酰大豆苷、丙二酰黃豆黃苷、丙二酰染料木苷），修改后，），babadcdc圖2不同溶劑稀釋大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（a50%二甲基亞砜，b50%甲醇稀釋，c80%范圍，在試樣處理步驟增加“必要時(shí)，可適當(dāng)增加或減少稀釋倍數(shù)f，使試樣中取片劑、顆粒劑（不低于20?；?0g）試樣，經(jīng)高速粉碎機(jī)或研缽磨成粉狀，原標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定稱樣量為0.05~0.5g，在本次修訂過(guò)程中修改了樣品的取樣量：醇提取，為驗(yàn)證提取溶劑有效性，考察了40%乙腈、80%乙腈、80%甲醇、80%乙醇、70%甲醇、90%甲醇作為提取溶液的提取效率。從測(cè)定結(jié)果看（表5），于40%乙腈，片劑使用40%乙腈提取效果最好，綜合考慮，沿用原標(biāo)準(zhǔn)的提取表5不同提取溶劑對(duì)大豆異黃酮測(cè)定結(jié)果/原標(biāo)準(zhǔn)中使用50mL棕色容量瓶超聲震蕩結(jié)果顯示，大豆苷和大豆苷元在250nm處有最大吸收，黃豆黃苷和黃豆黃素在258nm處有最大吸收，染料木苷和染料木素在260nm處有最大吸收，綜合操作圖3大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素的紫外光譜圖中有些成分可能會(huì)對(duì)大豆異黃酮定量有影響。在前期的實(shí)ZORBAXEclipseXDB-C18色譜柱）對(duì)多種黃酮類物質(zhì)分離效果有限，芍藥苷在adadbebecfcfe賽默飛測(cè)定大豆異黃酮6種標(biāo)準(zhǔn)品，f賽默飛測(cè)定大豆異黃酮6種標(biāo)準(zhǔn)品和芍制流程。參考文獻(xiàn)，選擇0.01%磷酸水溶液和0.1%乙酸水溶液。如圖5所示，adadbebecfcf水溶液，b安捷倫0.01%磷酸水溶液，c安捷倫0.1%乙酸水溶液，d月旭pH=3附。比較離心、棄初濾液1mL、棄少量1mL）初濾液3種方式對(duì)不同基質(zhì)1mL）初濾液會(huì)降低各組份濃度，造成結(jié)果偏差。表6不同過(guò)膜方式對(duì)大豆異黃酮濃度的影響內(nèi)大豆異黃酮注冊(cè)產(chǎn)品主要以g/100g和g/100mL為單位，因此將標(biāo)回收率在92.20%~98.91%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在0.79高水平方法加標(biāo)試驗(yàn)中，四種基質(zhì)中大豆苷的加標(biāo)回收率在收率在94.75%~98.56%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在0.回收率在95.54%~98.20%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在0.5場(chǎng)監(jiān)督的有效性。綜上所述，修訂后的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)方法學(xué)驗(yàn)證滿足AOAC2008.03和美國(guó)藥典（USP）收載的大豆異黃酮測(cè)定方法均采用了標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對(duì)法，實(shí)現(xiàn)了通過(guò)6種異黃酮（大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃素黃素、的結(jié)果偏差（圖6AOAC2008.03規(guī)定了兩種異黃酮總量計(jì)算的兩種方式：一7），先將乙酰類及丙二酰類大豆異黃酮苷進(jìn)行皂化水解，當(dāng)全部轉(zhuǎn)表7AOAC關(guān)于大豆異黃酮測(cè)定的方法標(biāo)準(zhǔn)號(hào)AOACOfficialMethod2001.10IsoflavonesinSoyandSelectedFoodsContainingSoyExtraction,Saponification,andLiquidChromatographyFirstAction2001AOACOfficialMethod2008.03TotalSoyIsoflavonesinDietarySupplements,SupplementIngredients,andSoyFoodsHigh-PerformanceLiquidChromatographywithUltravioletDetectionFirstAction2008基質(zhì)大豆提取物、大豆飲料、大豆粉等商業(yè)膳食補(bǔ)充劑中總大豆異黃酮、用于制造膳食補(bǔ)充劑的大豆異黃酮濃縮物以及含有至少0.5mg/g總異黃酮的大豆食品標(biāo)準(zhǔn)品大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃素黃素、染料木苷、染料木素大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木苷、染料木素方法高效液相色譜法高效液相色譜法提取方式將樣品使用80%甲醇在65°C水浴中振搖提取2h，冷卻至室溫，加入3mL2mol/L氫氧化鈉。置搖床旋搖10min后加入1mL冰醋酸，定容后稀釋上機(jī)將樣品使用40%乙腈振蕩60min，振蕩結(jié)束后，稀釋含有80%乙腈溶液，稀釋上機(jī)流動(dòng)相流動(dòng)相A：水：甲醇：乙酸=88+10+2，流動(dòng)相B：甲醇：乙酸=98+2流動(dòng)相A：0.05%磷酸，流動(dòng)相B：乙腈測(cè)定時(shí)間45min73min標(biāo)準(zhǔn)品大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷大豆苷元、黃豆黃素、染料木素大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷大豆苷元、黃豆黃素、染料木素注：圖譜比對(duì)法，需要用標(biāo)準(zhǔn)大豆粉定性乙酰和丙二酰異黃酮苷計(jì)量方式異黃酮總量：以異黃酮苷元及異黃酮苷相當(dāng)于苷元的總和計(jì)（1）異黃酮總量：以12種異黃酮形式的總和計(jì)（2）異黃酮總量：以異黃酮苷元及異黃酮苷相當(dāng)于苷元的總和計(jì)圖6AOAC2008.03色譜圖（a.大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品圖譜，b.某軟膠囊大豆異黃酮圖譜，c.加熱后的大豆粉，d.未加熱的大豆粉）圖7AOAC2001.10色譜圖（a.大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品圖譜，b.某軟膠囊大豆異黃酮圖譜）附件一保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證表8空白基質(zhì)雜質(zhì)峰和色譜峰保留時(shí)間碼苷苷元素素///準(zhǔn)圖8空白基質(zhì)色譜圖圖9空白基質(zhì)和目標(biāo)峰色譜圖測(cè)定：選取空白樣品基質(zhì)20個(gè)平行樣，分別添加估算檢出限濃度的目標(biāo)分表9方法檢出限驗(yàn)證結(jié)果基質(zhì)目標(biāo)分析物檢出數(shù)量目標(biāo)分析物檢出率硬膠囊20軟膠囊20片劑20液體口服液20接受標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)分析物檢出率≥95%結(jié)論空白輔料不干擾主成分測(cè)定表10保健食品分析方法定量限驗(yàn)證估算結(jié)果測(cè)定：采用估算定量限濃度水平的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行獨(dú)立檢測(cè)，表11方法定量限驗(yàn)證結(jié)果123456囊苷NDNDNDNDNDND囊苷NDNDNDND10NDND苷NDNDNDND0ND0ND苷NDNDNDNDNDNDND：未檢出表12方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線12345收率在94.75%~98.56%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在0.回收率在95.54%~98.20%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在0.5GB5009.295-2023《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)分析方法表13低水平方法正確度和重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果123456囊苷NDgNDgNDgNDgNDgNDg囊苷NDgNDgNDgNDg1NDgNDg苷NDgNDgNDgNDgNDgNDg苷NDNDNDNDNDNDND：未檢出表14中水平方法正確度和重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果)123456大豆苷ND黃豆ND染料ND大豆ND黃豆ND染料ND大豆苷ND黃豆ND染料ND大豆ND黃豆ND染料ND大豆苷ND黃豆ND染料ND大豆ND黃豆ND染料ND大豆苷ND黃豆ND染料ND大豆ND黃豆ND染料NDND：未檢出表15高水平方法正確度和重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果123456苷NDNDNDNDNDND苷NDNDNDNDNDND苷NDNDNDNDNDND苷NDNDNDNDNDNDND：未檢出表16標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液穩(wěn)定性結(jié)果17結(jié)果，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表17。標(biāo)準(zhǔn)方法修訂后不會(huì)對(duì)市場(chǎng)上的該類保健食品監(jiān)管產(chǎn)表17不同大豆異黃酮實(shí)際測(cè)量值黃豆染料木大豆苷黃豆黃染料木大豆異黃編大豆苷新標(biāo)準(zhǔn)/名稱劑型方法黃苷苷元素素酮總含量號(hào)g/100g原標(biāo)準(zhǔn)g/100gg/100gg/100gg/100gg/100gg/100g1樣品1軟膠囊新標(biāo)準(zhǔn)2.730.880.230.075.22101.35%原標(biāo)準(zhǔn)2.680.860.230.07標(biāo)簽值2.00/0.88/0.073.002樣品2硬膠囊新標(biāo)準(zhǔn)8.914.450.220.0715.94100.67%原標(biāo)準(zhǔn)8.814.412.200.220.0715.83標(biāo)簽值//////11.503樣品3軟膠囊新標(biāo)準(zhǔn)2.870.714.870.048.86101.21%原標(biāo)準(zhǔn)2.780.684.870.048.76標(biāo)簽值/2.550.04/0.014.474樣品4軟膠囊新標(biāo)準(zhǔn)0.242.600.280.070.265.37原標(biāo)準(zhǔn)0.232.640.280.070.265.36標(biāo)簽值3.4mg3.5mg0.08mg0.02mg7mg5樣品5片劑新標(biāo)準(zhǔn)0.720