（高清版）DB37∕T 3128.1-2018 群禽腺病毒感染診斷技術(shù) 第1部分：病毒分離鑒定

DB37/T3128.1—2018l群禽腺病毒感染診斷技術(shù)第1部分：病2018-02-02發(fā)布2018-03-02實(shí)施IDB37/T3128.1—2018本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：刁有祥、陳浩、唐熠、竇硯國(guó)、鄭肖強(qiáng)。1DB37/T3128.1—2018l群禽腺病毒感染診斷技術(shù)第1部分：病毒分離鑒定本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了I群禽腺病毒樣品的采集與保存、病毒的分離和鑒定等的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)中I群禽腺病毒分離與鑒定技術(shù)適用于I群禽腺病毒中12種血清型病毒的分離鑒定、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)適用于上述病毒的檢測(cè)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)適用于對(duì)工群禽腺病毒12種血清型病毒的鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫是引起家禽包涵體肝炎和肝炎-心包積液綜合征的病原，基于交叉中和試驗(yàn)結(jié)果，該病毒可分為12種血清型。用對(duì)應(yīng)某一種抗原的抗體(這里被稱(chēng)為一抗)與細(xì)胞孵育結(jié)合，在采用對(duì)應(yīng)一抗(也就是抗一抗)的抗體(這里被稱(chēng)為二抗，二抗上偶聯(lián)有熒光素分子)與細(xì)胞孵育結(jié)合后在熒光顯微鏡下觀察，出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)為陽(yáng)性反應(yīng)。利用限制性?xún)?nèi)切酶能識(shí)別DNA分子的特異序列，并在特定序列處切開(kāi)DNA分子，即產(chǎn)生限制性片段的特性，用于檢測(cè)DNA序列多態(tài)性。3.42DB37/T3128.1—2018雞胚肝癌上皮細(xì)胞系，來(lái)源于雄性雞肝臟腫瘤。4實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制4.1實(shí)驗(yàn)室符合GB19489和GB/T27401要求，實(shí)驗(yàn)室必須為生物安全Ⅱ級(jí)(BSL-2級(jí))及以上實(shí)驗(yàn)室。4.1.1操作中注意事項(xiàng)4.1.1.1從事PCR工作的實(shí)驗(yàn)室盡可能分區(qū)，根據(jù)條件劃分出前處理區(qū)、核酸提取區(qū)、核酸擴(kuò)增區(qū)、電泳檢測(cè)區(qū)，盡可能形成有效的物理隔離，且為單一流向，不得倒流。4.1.1.2特別注意電泳后的瓊脂凝膠要及時(shí)處理，避免對(duì)實(shí)驗(yàn)室造成污染。4.1.1.3病毒分離區(qū)域的雞胚接種操作區(qū)和細(xì)胞培養(yǎng)操作區(qū)也應(yīng)遵循一定的布局原則，避免交叉污染。4.1.2注意個(gè)人防護(hù)和環(huán)境保護(hù)，電泳中用到的EB可誘發(fā)基因突變，試驗(yàn)中被EB污染的物品要有專(zhuān)用收集處，并通過(guò)適當(dāng)?shù)姆绞?如焚燒、或送有資質(zhì)的醫(yī)用垃圾處理公司)進(jìn)行無(wú)害化處理。4.1.3生物樣品應(yīng)嚴(yán)格控制對(duì)環(huán)境的污染，試驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)將相關(guān)樣品收集高壓滅菌后，送有資質(zhì)的醫(yī)用垃圾處理公司做最終處理。4.2人員操作人員應(yīng)接受實(shí)驗(yàn)室生物安全、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理、細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)培訓(xùn)。熟悉生物樣品處理、細(xì)胞培養(yǎng)、以及核酸提取、基因擴(kuò)增等分子生物學(xué)技術(shù)。4.3儀器設(shè)備a)生物安全柜；c)CO?恒溫培養(yǎng)箱(37℃恒溫);d)臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(最大轉(zhuǎn)速12000r/min);g)紫外凝膠成像儀；j)微量移液器(最大量程分別為10μL、20μL、100μL、1000μL),帶濾芯的槍頭；k)孵化器(37℃恒溫);m)電子天平精度為：0.001g;n)電磁爐或微波爐；o)熒光倒置顯微鏡(FITC)。4.4試劑和材料除另有規(guī)定外，所有生化試劑均為分析純。a)磷酸鹽緩沖液(pH=7.0～7.4),見(jiàn)A.1;b)細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%血清的DMEM培養(yǎng)基);c)細(xì)胞維持液(含1%血清的培養(yǎng)基);d)甲醇：丙酮(1:1)固定液；e)抗體稀釋液PBST,見(jiàn)A.2;3DB37/T3128.1—2018f)商品化的FITC標(biāo)記鼠抗兔熒光抗體；g)兔抗I群禽腺病毒多克隆抗體(滅活疫苗免疫兔制備);m)商品化的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，要求在100bp～2000bp之間，有5條以上的指示條帶；n)1.5%瓊脂糖凝膠，見(jiàn)B.1;o)1×TAE緩沖液，見(jiàn)B.2;p)溴化乙錠(10μg/μL),見(jiàn)B.3;q)核酸電泳加樣緩沖液，見(jiàn)B.4;t)陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，I群禽腺病毒細(xì)胞培養(yǎng)物；u)陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，高壓滅菌的蒸餾水；v)本標(biāo)準(zhǔn)中使用的水均按照GB/T6682制備和使用；y)Hexon基因擴(kuò)增引物。FAV-AF:5'-TGGACATGGGGGCGACCTA-3';FAV-BF:5'-AACGTCAATCCCTTCAACCACC-3';上述引物濃度均為50μmol/L。采集疑似I群禽腺病毒感染死亡家禽肝臟、脾臟和腎臟等組織樣品，進(jìn)行分別處理或同時(shí)處理；活禽采集泄殖腔拭子。樣品置于密閉容器中冷藏運(yùn)輸，儲(chǔ)藏溫度不超過(guò)4℃,時(shí)間不超過(guò)24h。5.2.1室溫條件下樣品在1h~2h內(nèi)處理完畢，未能及時(shí)處理的樣本在4℃冰箱中存放，不超過(guò)24h;也可于-20℃低溫條件下保存，不超過(guò)30d;-70℃貯存最佳，不超過(guò)1年。5.2.2組織研磨液和泄殖腔拭子懸液置于-20℃低溫條件下保存，不超過(guò)2周；-70℃貯存不超過(guò)30d。5.3.1在生物安全柜中，取10g~20g樣品放入滅菌的研缽中，無(wú)菌條件下磨碎。5.3.2用含有抗生素(青霉素(2000IU/mL)、鏈霉素(2mg/mL)、慶大霉素(50μg/mL)和制霉菌素(1000IU/mL)等滲磷酸鹽緩沖液(PBS,pH值7.0~7.4,附錄A.1)配成10%～20%(g/mL)的懸液；泄殖腔拭子懸液中抗生素濃度提高5倍。加入抗生素后pH調(diào)至7.0~7.4。45.3.35.3.3樣本組織懸液反復(fù)凍融3次，經(jīng)8000r/min離心10min,取上清并置4℃過(guò)夜，次日接種SPF雞胚或LMH細(xì)胞系。6病毒分離6.1雞胚接種6.1.1將處理后的樣品上清，每份尿囊腔接種(3枚~5枚)9日齡~11日齡SPF雞胚，0.2mL/胚，置于孵化器中，37℃孵化120h。6.1.2棄去24h內(nèi)死亡胚，24h~120h內(nèi)死亡和存活雞胚置4℃冰箱過(guò)夜或-20℃冷凍1h,分別無(wú)菌收集尿囊液并進(jìn)行無(wú)菌檢查，無(wú)菌尿囊液盲傳三代。6.2細(xì)胞接種6.2.1將處理后的樣品上清接種單層LMH細(xì)胞，孵育1h,吸棄上清，用PBS緩沖液輕輕洗滌2次，吸棄后加入細(xì)胞維持液。6.2.270%以上單層細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后，轉(zhuǎn)移至凍存管置于-70℃保存，不超過(guò)3年。7病毒鑒定7.1.1細(xì)胞固定緩沖液輕輕洗滌3次~4次，吸棄液體。每孔加入用-20℃預(yù)冷的甲醇：丙酮(1:1)固定液150μL,置于-20℃孵育10min,吸棄固定液。干燥后用PBS緩沖液洗滌7.1.2一抗孵育用抗體稀釋液(PBST,見(jiàn)附錄A.2)將兔抗工群禽腺病毒多克隆抗體作1:200倍稀釋?zhuān)靠准尤?00μL,置于濕盒中，37℃孵育1h。吸棄后用PBS洗滌3次。7.1.3二抗孵育避光條件下，用PBST將FITC標(biāo)記鼠抗兔抗體作1:200倍稀釋?zhuān)靠准尤?00μL,置于濕盒中，37℃孵育1h。吸棄后用PBS洗滌3次。7.1.4封片觀察加入數(shù)滴50%甘油(附錄A.3)封片，置于熒光倒置熒光顯微鏡(FITC熒光目鏡)下，觀察是否出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)。7.2限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析按照商品化DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒細(xì)胞培養(yǎng)物中的總DNA,以此為模板分別擴(kuò)增Hexon基因5DB37/T3128.1—20187.2.2PCR反應(yīng)體系10×PCRBuffer2.5μL,dNTPs(2.5mmol/L)2μL,上游引物(50μmol/L)和下游引物(5094°C預(yù)變性5min;94℃30s,50℃30s,72℃2min,進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。7.2.4瓊脂糖凝膠電泳當(dāng)加樣緩沖液中溴酚藍(lán)電泳過(guò)半至凝膠下2/5處時(shí)，停止電泳。將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀下觀7.2.6PCR產(chǎn)物純化按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)陽(yáng)性條帶回收、純化，溶解于30μLddH20中。測(cè)定核酸濃度，確保核酸濃度≥10ng/μL。7.2.7分子克隆測(cè)序反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物(片段A或B)17μL、10×緩沖液2μL、HaeⅡ限制性?xún)?nèi)切酶1μL,總體積為20μL。反應(yīng)條件：37℃孵育1h,72℃作用5min。7.2.9酶切產(chǎn)物電泳取酶切產(chǎn)物9μL,按照7.2.4的步驟進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。7.2.10序列酶切位點(diǎn)分析每次檢測(cè)，用相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品(LMH細(xì)胞),至少設(shè)置一個(gè)或一個(gè)以上的信號(hào)。在陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)，陰性對(duì)照無(wú)條帶出現(xiàn)(引物二聚體除外)時(shí)，檢測(cè)樣品陽(yáng)性的表明樣品中存在I群禽腺病毒，陰性樣品中無(wú)I群禽腺病毒。6DB37/T3128.1—20188.2陽(yáng)性對(duì)照接種細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，IFA檢測(cè)顯示胞漿出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)(附錄C),陰性對(duì)照無(wú)細(xì)胞病變，胞漿未出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)時(shí)