尼帕病毒專題知識講座

一.病毒因子

1.微生物分類和實驗室及實驗室活動分級

尼帕病毒（Nipahvirus，NiV）屬于屬于副粘病毒科、副粘病毒亞科、亨尼帕（Henipavirus）病毒屬中的一員。該屬為新近分類的病毒屬，包括NiV和亨德拉病毒（HendraVirus）２個病毒成員。根據衛(wèi)生部《人間傳播的病原微生物名錄》的危害程度分類，NiV屬于第一類病原微生物，涉及病毒培養(yǎng)、未經培養(yǎng)的感染材料以及動物實驗均要在（A）BSL-4實驗室進行。1尼帕病毒專題知識講座2/16/20252.流行情況1998年9月至1999年4月馬來西亞爆發(fā)NiV疫情，257人感染，105人死亡，死亡率為40.8%；116萬多頭豬被撲殺。2001年，印度亦發(fā)生NiV傳染，死亡率為75%。2001~2011年孟加拉國先后暴發(fā)8次NiV疫情，平均死亡率為63.6%。泰國和柬埔寨均從果蝠中檢測到NiV。2009年，中國中科院武漢病毒所石正麗研究員領導的研究組首次發(fā)現中國大陸蝙蝠體內存在NiV或尼帕樣病毒抗體，提示我國存在尼帕或類似病毒的自然疫源地。2尼帕病毒專題知識講座2/16/20253尼帕病毒專題知識講座2/16/20253.病毒基因組結構及分類NiV基因組為不分節(jié)段的單股負鏈RNA，基因組大小為18252bp或18246bp，目前已獲得NiV全長基因序列。NiV有6個轉錄單位，分別編碼6個主要結構蛋白——核蛋白（N）、磷酸蛋白（P）、基質蛋白（M）、融合蛋白（F）、脂蛋白或吸附蛋白（G）、大蛋白（L）或RNA多聚酶。4尼帕病毒專題知識講座2/16/2025目前，NiV還沒有統(tǒng)一的分型方法，Chang等通過Genbank所有分離病毒株的N、M、P、F、G和L基因開放閱讀框進行序列對比和遺傳進化分析發(fā)現，NiV有三個進化分支，分別是馬來西亞經典毒株，柬埔寨分離株，孟加拉分離株。馬來西亞流行的NiV和孟加拉流行的NiV基因組差異較大（同源性為91.8%）。從柬埔寨果蝠中檢測到的NiV與馬來西亞NiV毒株相似。從泰國果蝠中檢測到NiVRNA有一份與馬來西亞NiV毒株的RNA序列類似，另外7份與孟加拉NiV毒株的RNA序列類似。經對印度分離的NiV基因序列分析表明，與孟加拉分離株的同源性在核酸水平為99.2%，氨基酸水平為99.8%，顯示了病毒的同源性。5尼帕病毒專題知識講座2/16/20256尼帕病毒專題知識講座2/16/20254.病原因子的理化特性通過負染技術可知,NiV呈多形性或圓形,由囊膜和核衣殼組成,大小為200-300nm,在細胞膜上完成發(fā)育過程,核衣殼結構呈螺旋形,核衣殼直徑13.0-18.0nm,螺距5.5-7.0nm,外由具有纖突

的囊膜所包被。NiV在體外不穩(wěn)定,對熱和消毒劑較敏感,NiV在體外不穩(wěn)定，對熱敏感，56℃30min即可使其滅活。NiV與其它副粘病毒相同，一般的消毒劑諸如0.5%次氯酸鈉、0.5%酚或75%乙醇以及肥皂等清潔劑很容易將其滅活。7尼帕病毒專題知識講座2/16/20255.病毒的培養(yǎng)特性NiV在很多哺乳動物細胞多能生長，如在Vero、BHK細胞中生長良好，但在昆蟲細胞中不能生長。在培養(yǎng)細胞中產生明顯的CPE（cytopathiceffect，致細胞病變效應）。表現為多個細胞融合成多核巨細胞形成特征性合胞體，在細胞漿中形成包涵體。將臨床標本接種細胞后5-7天就能觀察到病變，如果用高效價病毒接種Vero細胞，24小時后即可看到明顯病變。8尼帕病毒專題知識講座2/16/20256.宿主范圍NiV可以感染多種動物，如貓、狗、馬、山羊等，但豬是該病毒的主要傳染源，而果蝠是該病毒的自然宿主，在其尿樣和咬過的水果中，均能分離到到NiV9尼帕病毒專題知識講座2/16/20257.傳播途徑NiV感染患者的唾液、氣管和鼻腔的分泌物以及尿液中，均可分離到病毒。果蝠的尿液與吃剩下的水果中帶有NiV。其流產胎兒和其它分娩產物也可能含有NiV。豬的呼吸道分泌物帶有NiV，也未排除尿液中帶有病毒的可能性。已證實其它動物的感染主要是與感染豬的接觸。2001–2008年孟加拉和印度爆發(fā)疫情原因可能是：1飲食用了被感染果蝠的尿液或唾液污染了的水果或水果產品（如未加工的椰棗汁）。2密切接觸或暴露于感染病人的分泌物或排泄物（如唾液、尿液、嘔吐物或排泄物）導致的NiV直接由人傳染給人。用倉鼠進行的氣溶膠傳播實驗表明[1]，NiV通過氣溶膠傳播的可能性較低（EDWit，etal，NipahVirusTransmissioninaHamsterModel.PlosNeglectedTropicalDiseases,

2011,

5(12):e1432）10尼帕病毒專題知識講座2/16/20258.傳播速度NiV在感染豬場之間傳播很快，同一豬場內傳播可能是直接通過身體接觸，也可能是健康豬直接接觸病豬的尿、唾液、氣管分泌物等而引起。也可通過垂直傳播，此外也可能是通過使用人工授精等方式傳播。11尼帕病毒專題知識講座2/16/20259.實驗動物感染劑量金黃地鼠經鼻腔內接種NiV6×105PFU(plaqueformingunit，噬菌斑形成單位)，接種后9-21天發(fā)病死亡；

非洲綠猴經氣管內接種NiV2.5×103PFU，接種后12天即可導致動物死亡；

雪貂經口鼻途徑接種NiV500、5,000、50,000TCID50(Tissuecultureinfectivedose，50%組織細胞感染量)，可導致雪貂發(fā)熱、食欲不振、重度消沉、咳嗽、流鼻涕、呼吸困難，個別雪貂見有中樞神經障礙癥狀；

豬：經口鼻途徑實驗感染（2.5×105PFU）豬可引起輕度臨床癥狀，如體溫升高和輕度呼吸癥狀（呼吸頻率增加和輕度咳嗽），但經口腔和皮下接種感染（5×104TCID50）可導致嚴重的神經癥狀。

12尼帕病毒專題知識講座2/16/202510.臨床及病理變化NiV感染人：NiV可引起人類腦炎，進展快，病死率高。潛伏期為4-60d，90%的病例少于2周。主要臨床癥狀為體溫升高、頭痛、頭暈和嘔吐。50%以上的病例有意識減退和顯著的腦干功能障礙。其它癥狀還有節(jié)段性肌痙攣、反射消失、肌張力減退、高血壓、心動過速等。除中樞神經系統(tǒng)癥狀外，有一些病例有呼吸道癥狀，如呼吸困難、咳痰，胸部聽診雙側肺部有啰音。嚴重的病人可發(fā)生并發(fā)癥，包括敗血癥、胃腸道出血、腎功能損害等。

13尼帕病毒專題知識講座2/16/2025直接的死因主要是腦炎，特別是累及到腦干。存活者中，75%可完全康復，其余25%有殘存的神經系統(tǒng)損害。在急性期有正常意識的病人中，經過大約2周的平均病程后，均可完全康復，而在急性期有意識減低的病人中，僅15%可完全康復。此外，急性期病人的唾液、氣管和鼻腔的分泌物以及尿液中，均可分離到病毒。人感染NiV后病變最嚴重的器官是腦，其他器官（如肺、心臟和腎等）也可出現充血等相應病變，組織學檢查可見血管炎，小動脈、靜脈與毛細血管內皮損傷，血管壁壞死、出血和血栓形成等。腦、肺和腎的血管內皮有大的融合細胞形成。出現血管炎的血管周圍有微小壞死和缺血灶。免疫組化法檢測腦血管內皮細胞、周圍神經原細胞和支氣管上皮細胞，可檢NiV抗原。14尼帕病毒專題知識講座2/16/2025NiV感染豬：豬病死率低，為5-15%，感染率高達100%，潛伏期為7-14d。豬的尼帕病毒感染可出現中樞神經系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)癥狀，但臨床特征隨豬的年齡不同而異。小于６個月的豬出現急性體溫升高、呼吸困難、咳嗽、發(fā)抖、肌肉抽搐、后肢痙攣性或無力性麻痹、步態(tài)不協調等。成年豬可出現體溫升高、呼吸困難、唾液分泌增多、流涕、易激怒、頭部顫動、口緊閉、眼球震顫、抽搐，甚至突然死亡，母豬可能早產。

15尼帕病毒專題知識講座2/16/2025豬感染NiV后肺部可出現不同程度的病變、出血；氣管和支氣管充滿泡沫樣、有時血水樣液體；腦部充血、水腫；腎也有類似病變。豬的組織病理學變化與人類似，用免疫組化法檢測，在感染的血管內皮細胞和肺支氣管上皮細胞，也可檢出高濃度的尼帕病毒抗原。臨床診斷時，NiV需要與能夠引起豬急性死亡或呼吸道、神經癥狀的疾病加以鑒別。16尼帕病毒專題知識講座2/16/202511.預防與治療措施(1)特異性受體近年來,研究人員發(fā)現ephrinB2配體為尼帕病毒的特異性受體。這一發(fā)現將有助于進一步闡明其發(fā)病機制,并為促進有效藥物的研發(fā)奠定基礎。(2)疫苗研制目前處于研究階段的NiV病疫苗包括DNA疫苗、滅活疫苗、重組蛋白疫苗、病毒載體疫苗以及病毒樣粒子疫苗等，雖然在實驗研究過程中呈現了一定保護效果，但均未進入臨床應用階段。17尼帕病毒專題知識講座2/16/2025(3)治療先前的臨床試驗表明，抗病毒藥Ribavirin(利巴韋林)可減少發(fā)熱時間，緩解癥狀，降低急性腦炎死亡率，其衍生物EICAR、6-氮尿苷(6-aza-uridine)、吡唑呋喃菌素(pyrazo-furin)在體外試驗中對NiV顯示出很強的抑制作用；干擾素誘生劑poly(I)-poly(C12U)在動物模型中具有抵抗NiV致死性攻擊的作用。(GEORGES-COURBOTMC,CONTAMINH,FAUREC,etal.Poly(I)-poly(C12U)butnotribavirinpreventsdeathinahamstermodelofNipahvirusinfection[J].AntimicrobAgentsChemother,2006,50:1768-1772.

BOSSARTKN,BRODERCC.DevelopmentstowardseffectivetreatmentsforNipahandHendravirusinfection[J].ExpertRevAntiInfectTher,2006,4:43-55.)18尼帕病毒專題知識講座2/16/20251病原學檢測

1.1NiV分離鑒定NiV能夠在多種培養(yǎng)細胞中生長并快速增殖至較高的滴度。非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)和兔腎細胞RK-13細胞系對NiV尤為敏感。通常在病毒感染3d內能夠觀察到病毒病變效應(CPE)，但一般來說在細胞上傳代2次，每次5d所達到的分離效果更為穩(wěn)定。經低毒量穩(wěn)定傳代后的病毒再次感染細胞后24-48h，細胞出現以形成合胞體為特征的CPE，并且感染早期，合胞體中所有細胞核位于合胞體中央，而晚期則被運送至合胞體外，并聚集在其周圍[1]。(HYATTAD，ZAKISR，GOLDSMITHCS，etal.UltrastructureofHendravirusandNipahviruswithinculturedcellsandhostanimals[J].MicrobesInfect，2001，3：297-306)

二.實驗室診斷技術

19尼帕病毒專題知識講座2/16/20251.2分子診斷技術NiV的基因組全序列已被測出，研究者們可以在此基礎上針對NiV的分子診斷技術進行相應的研發(fā)。目前，已經被報道的針對NiV的分子檢測技術有兩種，分別為熒光定量RT-PCR和雙重套式RT-PCR。20尼帕病毒專題知識講座2/16/2025(1)熒光定量RT-PCR：該方法敏感度高、特異性強，并且不需要接觸活的感染性病毒，具有生物安全性的優(yōu)勢。其檢測靈敏度可以達到１PFU[2]

（GUILLAUMEV，LEFEUVREA，FAUREC，etal.SpecificdetectionofNipahvirususingreal-timeRT-PCR(Taqman)[J].JVirolMethods，2004，120:229-237.）并且有被學術界普遍認可的相關引物和探針：Primer1：5’—TCAGCAGGAAGGCAAGAGAGTAA—3’；Primer2：5’—CCCCTTCATCGATATCTTGATCA—3’；Taqmanprobe：5’—6FAM—CCTCCAATGAGCACACCTCCTGCAGT—AMRA—3’為NiV的實驗室快速診斷提供了技術支持[3]。(MUNGALLBA，MIDDLETOND，CRAMERIG，etal.Felinemodelofacutenipahvirusinfectionandprotectionwithasolubleglycoprotein-basedsubunitvaccine[J].Jvirol，2006，80，12293-12302)21尼帕病毒專題知識講座2/16/2025(2)雙重套式RT-PCR：Wacharapluesadee等描述了一種帶有內參的雙重套式RT-PCR檢測技術。該技術能夠用于對果蝠尿樣的檢測，并且加入內參大大降低PCR相關的抑制因素帶來的假陰性的結果，提高檢出準確率，在NiV流行病學調查時大大提高NiV監(jiān)測數據的可靠性[4]。(WACHARAPLUESADEES，HEMACHUDHAT.DuplexnestedRT-PCRfordetectionofNipahvirusR