乙醛脫氫酶（ALDH）活性檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案

乙醛脫氫酶（ALDH）活性檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理乙醛脫氫酶（EC0，ALDH）是醛脫氫酶的一種，廣泛存在于各種動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)。主要作用是將乙醛氧化成乙酸，在酒精代謝中起主要作用。在人類和許多動(dòng)物體內(nèi)，線粒體乙醛脫氫酶能把對(duì)生物體有害的醇類轉(zhuǎn)化，所以在細(xì)胞解毒研究中乙醛脫氫酶受到高度關(guān)注；同時(shí)，乙醛脫氫酶在分子生物學(xué)以及相關(guān)疾病的檢測方面有較廣泛的研究應(yīng)用。在輔酶Ⅰ存在的條件下，乙醛脫氫酶催化乙醛和NAD+轉(zhuǎn)化為乙酸和NADH，在340nm處的吸光值會(huì)增加，測定340nm處的吸光值變化，可計(jì)算得出乙醛脫氫酶的活性。自備耗材·酶標(biāo)儀或紫外分光光度計(jì)（能測340nm處的吸光度）·96孔UV板或微量石英比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·恒溫水浴鍋、制冰機(jī)、離心機(jī)·去離子水·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。ReagentI：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃保存。ReagentII：即用型；使用前，平衡到室溫。4℃避光保存。注意：ExtractionBuffer和ReagentII有刺激性氣味，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。WorkingReagent：臨用前配制；根據(jù)樣本數(shù)量，按ReagentI：ReagentII=200μL:10μL的比例混合，充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣本可在-80℃保存1個(gè)月。測定時(shí)，應(yīng)控制解凍的溫度和時(shí)間。室溫環(huán)境下解凍時(shí)，需在4h內(nèi)完成樣品解凍。組織：稱取約0.1g樣本，加入1mLExtractionBuffer，冰浴勻漿，10,000g，4℃離心20min，取上清液，置冰上待測。細(xì)胞：收集500萬細(xì)胞到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細(xì)胞，離心后棄上清，加入1mLExtractionBuffer，冰浴超聲波破碎細(xì)胞3min（功率300W，超聲3s，間隔7s，總時(shí)間3min），然后10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測。血清（漿）等液體樣本：直接測定。若溶液有渾濁則離心后取上清進(jìn)行測定。注意：如需測定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號(hào)：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測定。實(shí)驗(yàn)步驟酶標(biāo)儀或紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到340nm。紫外分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。將WorkingReagent在37℃預(yù)熱10min以上。操作表（下述操作在96孔UV板或微量石英比色皿中進(jìn)行）：試劑測定孔（μL）樣本上清20WorkingReagent180充分混勻，于340nm處測定初始吸光值A(chǔ)1，37℃孵育30min后于340nm處測定吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A2-A1。注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果ΔA小于0.01可適當(dāng)加大樣本量或適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間（比如反應(yīng)60min）。如果ΔA大于1.0，樣本可用ExtractionBuffer進(jìn)一步稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過程計(jì)算公式和簡潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。使用96孔UV板測定的計(jì)算公式如下（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：酶活單位定義：每mg蛋白每分鐘催化還原1nmolNAD+的酶量為1個(gè)酶活單位。ALDH(U/mgprot)=ΔA÷(ε×d)×V反總÷(V樣×Cpr)÷T=107.17×ΔA÷Cpr（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算:酶活定義：每g樣品每分鐘催化還原1nmolNAD+的酶量為1個(gè)酶活單位。ALDH(U/g鮮重)=ΔA÷(ε×d)×V反總÷(V樣×W÷V樣總)÷T=107.17×ΔA÷W（3）按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算:酶活定義：每104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化還原1nmolNAD+的酶量為1個(gè)酶活單位。ALDH(U/104cell)=ΔA÷(ε×d)×V反總÷(V樣×500÷V樣總)÷T=107.17×ΔA÷500（4）按液體體積計(jì)算:酶活定義：每mL樣本每分鐘催化還原1nmolNAD+的酶量為1個(gè)酶活單位。ALDH(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×V反總÷V樣÷T=107.17×ΔAε：NADH微摩爾消光系數(shù)，6.22×10-3L/μmol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V樣總：加入ExtractionBuffer體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；500：細(xì)胞總數(shù)，5×106。使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式將上述計(jì)算公式中光徑d:0.5cm調(diào)整為d:1cm進(jìn)行計(jì)算即可。注意事項(xiàng)ReagentII有毒性，實(shí)驗(yàn)時(shí)請(qǐng)佩戴口罩手套等防護(hù)措施。結(jié)果展示Figure1.本試劑盒測定小鼠肝臟和玉