動物A型流感病毒與北美種和歐洲種豬繁殖與呼吸綜合征病毒三重實時熒光RT-PCR檢測方法征求意見稿

1動物A型流感病毒與北美種和歐洲種豬繁殖與呼吸綜合征病毒三重熒光RT-PCR檢測方法本文件規(guī)定了動物A型流感病毒與北美種和歐洲種豬繁殖與呼吸綜合征病毒三重熒光RT-PCR檢測本文件適用于動物A型流感病毒與北美種和歐洲種豬繁殖與呼吸綜合征病毒的鑒NY/T5414縮略語AIV-A：動物A型流感病毒（AnimalInfluenzaAVirus）PRRSV-EU：歐洲種豬繁殖與呼吸綜合征病毒（EuropeanPorcineRespiratoryandReproductiveHex：六氯-6-甲基熒光素（6-Hexa26.1.1病毒總核酸提取試劑TIANampVir6.1.2Path-IDTMMultiplexone-stepRT-PCRkit或者其他等效多重熒光RT-PCR試劑。將反應(yīng)體系混合液充分混合后，最后加入模板，瞬時離心，按照下列反應(yīng)程序（見表1），進行一1319.3結(jié)果描述及判定9.3.1質(zhì)控標準9.3.2結(jié)果判斷和鑒別如果Ct值仍然<40，則判定為核酸檢測陽性，如果Ct值≥40或者無Ct值，判陽性熒光信號表示PRRSV-EU核酸檢測陽性；兩種陽性熒光信號表示對應(yīng)的其中兩種病毒核酸檢測陽樣品處理和核酸提取以及廢棄物處理按照GB19489規(guī)定，在相應(yīng)等級的生物安全實驗室或者生物4ttgtttgcagggaaaaacaccgatcttgaagcactttcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtagacgctttgtccagaatgccctaaatgggaatggtgatccgaacaaagcggtcaaactgtacagaaaacttaaaagggaaataacattccacggggccaaagaagtagcgctcagttactttgccagttgcatgggcctcatatacaacagaatggggactgtcaccgctgttgctgattcccagcatcgatctcatagacaaatggtgacaacaaccaatccactaatcaggcatgagaacaacagctaaagccatggaacaaatggctaggcaatgagaacaattgggactcaccctagttccagtgctggtctaaaagatgatcttcttgaaaatctacaggcctatcagaaaatgcaacgattcaagtgatcctctcattgctgccgcaagcatcattgggattttgcacctgatattgtggattcttgatcgtctttttttcaaatgcatttaccatcactttaaatatggtcgaaaaagagggccttctacggaaggagtgccggagtccatgagggaagaatatcggcagaagagtgctgtggatgttgacgatggtcattttgtcaacatagtgctagagtaa-3'5‘-atgccaaataacaacggcaagcagcaaaagaaaaagaaggggaatggccagccagtcaatcagctgtgccaaatgctgggtaagatcatcgcccaacaaaaccagtccagaggcaagggaccggggaagaaaaataggaagaaaaacccggagaagccccatttccctctagcgactgaagatgacgtcaggcatcactttacccctagtgagcggcaattgtgtctgtcgtcgatccagactgccttcaatcagggcgctggaacttgtgccctgtcagattcagggaggataagttacactgtggagtttagtttgccgacgcaacatactgtgcgtctgatccgcgccacagcatcaccctcagcgtga-3'5‘-atggccggtaaaaaccagagccagaagaaaaagaaaagtacagctccgatggggaatggccagccagtcaatcaggtgcaatgataaagtcccagcgccagcaacctaggggaggacagggaagatgacatccggcaccacctcacccagactgaacgctccctctgcttgcaatcgatccagacggctttcaatcaaggcgcaggaactgcgtcgctttcatccagtgggaaggtcagttttcaggttgagttcatgctg5與呼吸綜合征N基因FAM-CGGTCCCTTGCCTCTGGAFAM-CCGGTCCCTTRCCTCTRGACT與呼吸綜合征N基因HEX-TGATRAARTCCCAGCGCCAGCHEX-ATGATAAGGTCCCAGCGCCAATCCTGTCACCTCTGACTAATCTTGTCACCTCTGACTAACy5-ACGCTCACCGTGCCS6根據(jù)樣品數(shù)量計算所需緩沖液GB和CarrierRNA溶液的體積（計算公式如下1和2將緩沖液GB與CarrierRNA溶液顛倒混勻，即得到CarrierRNA工作液；為避免溶液出現(xiàn)起泡現(xiàn)象，請勿使用渦旋公式（1）y=nxm公式（1）中：y為需要加入緩沖液GB的體積（mLn為同時提取的樣品個數(shù)；公式（2）Z=YXX公式（2）中：z為需要加入CarrierRNA溶液的體積(μLy為需要加入緩沖液GB的體積（mL），C.2.5加入250μL無水乙醇，渦旋振蕩15sec，徹底混勻，在室溫（15℃-25℃)放置5min。C.2.6簡短離心，收集附著在管壁及管蓋），），7C.2.12將吸附柱放回收集管中，13,400×C.2.13將吸附柱放入一個新的RNase-Free離心管（1.5mmin，使吸附膜完全變干。向吸附膜的中間部位懸空滴加20-150μL