牛體外受精胚胎生產(chǎn)及非手術(shù)法移植技術(shù)操作規(guī)程

1牛體外受精胚胎生產(chǎn)及非手術(shù)法移植技術(shù)操作規(guī)程4.1.1二氧化碳培養(yǎng)箱4.1.2超凈臺使用前20min，打開風(fēng)機(jī)和紫外線燈對操作臺面和在超凈臺中使用的器材進(jìn)行表面滅菌，液體操恒溫加熱板、水浴鍋的使用溫度為37℃,水浴鍋中液體為蒸餾水。4.1.4液氮罐4.2溶液2抗菌生理鹽水（含青霉素和鏈霉素各0.075g/L）、采卵液、成熟液（M199）、精子洗滌液、受精液（BO液）、胚胎培養(yǎng)液（CR1aa）、胚胎冷凍液、4.2.3溶液的制備4.2.3.1基礎(chǔ)溶液配制4.2.3.2成品溶液配制根據(jù)要求或試驗(yàn)設(shè)計(jì)，稱量好所有藥品后用基礎(chǔ)溶液進(jìn)行一次性溶解，然后用0兩個月采卵一次。采卵前48h肌注FSH進(jìn)行卵泡帶有超聲波探頭和采卵針（18G或21G的一次性短針頭）的采卵器插入到陰道穹隆處，通過直腸把握法將卵巢貼在探頭上，在40mmHg（18G）或120mmHg（21G）負(fù)壓下，根據(jù)B超屏幕上所顯示的行穿刺。穿刺卵泡的表面直徑為2mm～8mm。每頭牛應(yīng)單獨(dú)采集，并標(biāo)注好信息。采集后用采卵液洗管3次，將收集的液體在37℃環(huán)境下，于4h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。所用采卵液配方見附錄A中A.牛屠宰后30min內(nèi)摘取卵巢，置于盛37℃抗菌生理鹽水的保3去除卵巢周圍多余的組織，用37℃的抗菌生理鹽水洗滌5次～6次。將洗滌好的卵巢與抗菌生理鹽水一起置于37℃的恒溫加熱板上備用。采卵時，用消毒的紗布包裹住卵巢，用配有18號針頭的10mL注射器從側(cè)面穿刺，吸取表面直徑2mm～8mm卵泡內(nèi)的液體?？梢淮涡詫⑺新殉驳模?，卵子洗滌盤（1mL～2mL受精液/次），于二氧化碳培養(yǎng)箱中液置于精子洗滌液中，以45°傾斜方式在二氧化碳培將體外培養(yǎng)20h～24h的卵母細(xì)胞在受精液中洗然后用受精液調(diào)試密度為1×106～6×106個/mL，置于二氧化碳培養(yǎng)），4氧化碳培養(yǎng)箱中預(yù)平衡。胚胎培養(yǎng)液配方見管吹打假設(shè)合子，去除周圍殘留的卵丘細(xì)胞和精子。將洗滌后的假設(shè)合子移入培養(yǎng)微滴中，10枚/滴，胚胎發(fā)育階段劃分應(yīng)符合GB/T258胚胎的等級評定應(yīng)按照GB/T25881中的規(guī)定。胚胎質(zhì)量分為A、B、C、D四個等級，其中Aa)保存液：含有0.4%牛血清白蛋b)1.5moL/L乙二醇冷凍液（含0.1moL）：將平衡后的胚胎裝入0.25mL細(xì)管，裝管順序：冷凍液→氣泡→冷凍液加胚胎→氣泡→冷凍液。胚5胚胎冷凍程序：冷凍儀（—5℃~?6℃)→放入胚胎細(xì)管→平衡5min～10min→植冰→平衡5min~10min→以0.3℃/min～0.5℃/min的速率下降→—30℃~?35℃→平衡5min～10min→投入液氮。胚胎細(xì)管→空氣?。?8℃~25℃)8s～10s→水浴（32℃~35℃)10s→擦干細(xì)管→剪去細(xì)胚胎細(xì)管→空氣?。?8℃~25℃)8s～10s→水浴(32℃~35℃)10s→擦干細(xì)管→剪去細(xì)管塞推出胚胎→解凍液平衡4min～5min→保存液洗滌5次～6次→鏡檢→裝管→裝槍移植。6受體牛同期發(fā)情的處理方法應(yīng)符合NY/T1572中的規(guī)定。以受體穩(wěn)定站立接受其他牛爬跨為發(fā)情。），12.4.1.1對發(fā)情牛或發(fā)情處理的牛進(jìn)行黃體直檢，要求其直徑在12.4.1.2對人工授精的牛進(jìn)行授精記錄核對，確保移植當(dāng)天處于人胚胎發(fā)育周期與受體移植時間的對應(yīng)關(guān)系見NY/T15受體牛胚胎移植的方法應(yīng)按照DB21/T受體妊娠診斷的方法應(yīng)符合DB21/T7溶液配方A.1采卵液配方M199NaHCO34.766LM199NaHCO38注：液體4℃保存；E2不需過濾；基礎(chǔ)液保NaCl2ONaH2PO42OMgCl22ONaHCO3NaCl2O9NaH2PO42OMgCl22ONaHC