進出口化妝品中病原菌檢測方法 微滴式數(shù)字PCR法 第1部分：大腸埃希氏菌

1進出口化妝品中病原菌檢測方法微滴式數(shù)字PCR法第1部分：大腸埃希氏菌本文件描述了進出口化妝品中大腸埃希氏菌的微滴式數(shù)字PCR檢測方法。本文件適用于進出口化妝品中大腸埃希氏菌的快速檢測。本文件所能達到的檢出限(LODm)為0.50CFU/g(mL)-0.81CFU/g(mL)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最忻版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學檢測SN/T5075化妝品微生物檢驗制樣規(guī)范SN/T5706化妝品微生物檢驗方法大腸埃希氏菌檢驗3術(shù)語和定義本文件沒有需要得定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。DNA:脫氧核糖核酸(DeoxyribonueicAcid)dAPCR:微滴式數(shù)字PCR(dropletdigitalPdyineraseChainReaction)PCR:聚合酶鏈式反應(PolymenseChainReaction)5方法原理針對大腸埃希氏菌rDNA編碼基因UMB200201_11染色體設計引物、探針，將一定濃度的引物、探針與模板DNA及反應預混液混合，配成PCR反應體系。將該數(shù)字PCR體系分布到12000個-20000個微滴中，使大部分微滴中模板DNA分子的數(shù)量為1或0,然后進行PCR擴增。rDNA基因探針5'端標記FAM熒光基團，3'端標記BHQI。利用數(shù)字PCR系統(tǒng)的檢測通道，可對每個微滴的熒光信號進行采集分析。含有模板DNA的微滴出現(xiàn)熒光信號的增強，形成陽性微滴簇。最終根據(jù)陽性微滴的有無判定樣品中是否含有大腸埃希氏菌。吸取10mL1:10樣品稀釋液接種到90mLSCDLP增菌液中，置于36℃時，用生理鹽水清洗沉淀1次~2次。用1mL生理鹽水混懸棄去上清液。在沉淀中加人50μLDNA提取液振蕩混勻，于95℃-100℃加熱10min,室溫冷卻4按照公式(1)計算DNA的濃度。一水一一一6主要培養(yǎng)基和試劑滅菌一級水100mL將Chelex-100顆粒加入滅菌一級水中混勻，2℃-8℃保存。A2大豆酪蛋白卵磷脂吐溫80(SCDLP)液體培養(yǎng)基A.2.1成分酪蛋白胨大豆蛋白胨氯化鈉磷酸氫二鉀葡萄糖卵磷脂蒸餾水先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后，再與其他成分混合，加熱溶解，調(diào)pH值為7.2-7.3,分裝，每瓶90mL,121℃高壓滅菌20min。注意振蕩，使沉淀于底層的吐溫80充