Q熱檢疫技術(shù)規(guī)范

Q熱檢疫技術(shù)規(guī)范3從同批樣品的不同部位共抽樣5g~10g,裝人無(wú)菌采樣袋，密封。采集奶液于滅菌50mL.離心管中，盡量于清晨采取，采前用溫?zé)崦韺⑷榉坎潦酶蓛?，?%碘伏將乳頭消毒，將頭3把~4把乳汁棄去，采集后續(xù)奶液。采集的樣品應(yīng)在取樣后4℃冷藏24h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)附有標(biāo)簽或采樣單，表明采樣地點(diǎn)、動(dòng)取適量組織樣品，剪碎，按1:5的比例加入滅菌的含抗生素(鏈霉素100μg/mL~200ng/mL和慶大霉素50mg/mL.～100mg/mL)的0.4mol/l.PBS(pH7.4),用組織研磨儀充分研磨5min~10min,制備成組織勻漿液；移人離心管，充分振蕩，75℃溫浴0.5h~1h;15000g清，加1mL,PBS,振蕩混勻，使沉淀充分懸浮，15000g離心10min,棄上清，收集沉淀物，置于-20℃取1mL~2mL全血樣品，編號(hào)，15000g離心10min,棄上清。加等體積滅菌雙蒸水充分振于-20℃貯存?zhèn)溆谩⒉杉姆置谖锸米雍图S便拭子加入1mL滅菌的0.1mol/LPBS(pHZ.4),于振蕩器上充分振蕩取1g樣品放入滅菌三角瓶中，加入30mL4℃預(yù)冷的0.5%TritonX-100PBS溶液，將瓶口塞心10min去除樣品中大的顆粒。取上層懸液15000g離心10min,棄上清，加1mLPBS充分振蕩混勻：將沉淀懸浮液移人1.5mL離心管，15000g離心10min,棄上清，收集沉淀物，置于-20℃貯存279.6質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出大小為686bp的特異性擴(kuò)增條帶，陰性對(duì)照及空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶。否則，此次試驗(yàn)視為無(wú)效，應(yīng)重新試驗(yàn)。9.7結(jié)果判定在試驗(yàn)成立的條件下，若檢測(cè)樣品有686bp的特異性擴(kuò)增條帶，則初步判定為C.Burnerii核酸陽(yáng)性：被檢樣品無(wú)特異性擴(kuò)增條帶，則判定為C.Burnetii核酸陰性。檢測(cè)為核酸陽(yáng)性的樣品，其PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸序列測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)參考序列(C.1)進(jìn)行比對(duì)，同源性達(dá)96.0%以上，則判為C.Barnetii核酸陽(yáng)性。10實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(實(shí)時(shí)熒光PCR)10.1.2臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(最大離心力12000g以上)。10.1.3Ⅱ級(jí)生物安全柜。10.1.4冰箱(2℃~8℃,-20℃、-80℃不同溫度)。10.1.5微量可調(diào)移液器(10pL、100gL、200pL、1mL等不同規(guī)格)及其配套的無(wú)核酸酶處理的離心管和吸頭。10.2.1試驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中的一級(jí)水。10.2.2組織或糞便基因組DNA提取試劑盒。10.2.3熒光PCR預(yù)混液(2×)。10.2.4空白對(duì)照(dd-O)、陰性對(duì)照(取健康動(dòng)物同類(lèi)樣品)、陽(yáng)性對(duì)照(C.Brrneri核酸或陽(yáng)性質(zhì)粒)。10.3引物探針序列GGGCTGCGTG-3',下游引物Cox-R:S-cccCG5'-FAM-AGCGAACCATTGGTATCGGACGTTTATGCG-Eelipse-3',預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為295bp(具體序列見(jiàn)C.2)。方法同9.4。10.5.1熒光PCR反應(yīng)體系進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)體系配置，檢測(cè)C.Barnetii的熒光PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2。陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照的設(shè)置同9.5.1。加入模板后充分混勻，瞬時(shí)離心，使液體沉至PCR管底。熒光PCR預(yù)混液(2×)212.1.2.310倍濃度的稀釋液(吐溫/PBS液)。濕盒內(nèi)放37℃培養(yǎng)箱中感作60min,再放置4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。12.2.2洗板：棄去板中包被液，加洗滌液洗板，每孔300gL,洗滌3次，每次1min,在吸水紙上輕輕12.2.5將血清樣品(包括對(duì)照血清)稀釋至適當(dāng)濃度(通常為1/100),每孔滴加100pL,每個(gè)樣品加112.2.12加終止波100mL終止氧化物酶反應(yīng)。陽(yáng)性對(duì)照平均OD值和陰性對(duì)照平均OD值(OD_/OD)的比值大于3。計(jì)算待測(cè)血清以及陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清的平均吸光值[待檢血清平均OD值(OD)、陽(yáng)性血清平均當(dāng)S/P<30%,判為抗體陰性；當(dāng)S/P在30%~40%之間，判為可疑，對(duì)于可疑血清，需要重新檢驗(yàn)，如重新檢驗(yàn)結(jié)果仍為30%~40%之間，則判定為抗體陽(yáng)性；當(dāng)S/P>40%,判為抗體陽(yáng)性。比例 十 比例 ++ +++ 注：“+十“為50%溶血：“十”為75%溶血：“一”為1LABCDEF0000000一一一一一一十++一一+一一一++一+0注：“十+++"為0溶血：“十++"為25%溶血：“++”為50%溶血：“十“為75%溶血7購(gòu)1200000000000000000000000037℃感作30min后進(jìn)行初判，然后置室溫2h,水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)2000r/mim離心5min,或4℃冰箱標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清使用前用VBD做1:10稀釋?zhuān)?6℃水浴滅活30min;待檢血清使用前用VBD做1:10稀釋?zhuān)瑴缁?0min(牛56℃~57℃.綿羊、山羊63℃)。按表7建立正式試驗(yàn)。00000000000000090000000037℃感作30min后進(jìn)行初判，然后置室溫2h.水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)2000r/min離心5min,或4℃冰箱++++表示90%以上排制溶血：+++表示75%以上抑制溶血：++表示50%以上抑制溶血；+表示25%以上護(hù)制溶血；一表示100%溶血。13.5.2判定標(biāo)準(zhǔn)：待檢血清1:10稀釋時(shí)小于50%抑制溶血，判為Q熱抗體陰性，否則判為Q熱抗體(規(guī)范性)MEM培養(yǎng)基，加人10%無(wú)C.Burnerii抗體犢牛血清(56℃30min滅活),含青霉素200IU/μL、MEM培養(yǎng)基，加人2%無(wú)C,Burnerii抗體胎牛血清(56℃30min滅活),含青霉素200IU/μL、鏈霉素200IU/pL,抽濾除菌，置4℃保B.40.01mol/LpH7.4磷酸鹽媛沖液(PBS)Na,HPO?·12H?ONaCl加雙蒸水至1000-at.調(diào)pH為7,4,121前用PBS(pH6.8)做1110稀釋。稱(chēng)取二水乙二胺四乙酸鈉1.44g,使用80mL雙燕水充分溶解，使用氫氧化鈉溶液調(diào)pH雙燕水至100mL,室溫保存。B.6.2TAE電泳緩沖液(50×)0.5mol/LEDTA溶液(pH8,0)加雙蒸水至1000mL,室溫保存。B.6.3TAE電泳緩沖液(1×)使用前將50×TAE電泳緩沖液做50倍稀釋即可。B.6.41.5%瓊脂糖凝膠稱(chēng)取瓊脂糖1.5g,使用1×TAE電泳緩沖液100mL充分溶解，微波爐中完全融化，待冷卻至NaHCO?含1%牛白蛋白的PBS10