出口化妝品中病原菌檢測(cè)方法 微滴式數(shù)字PCR法 第7部分：白色念珠菌

1進(jìn)出口化妝品中病原菌檢測(cè)方法微滴式數(shù)字PCR法第7部分：白色念珠菌本文件描述了進(jìn)出口化妝品中白色念珠菌的微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)方法。本文件適用于進(jìn)出口化妝品中白色念珠菌的快速檢測(cè)。本文件所能達(dá)到的檢出限(LODm)為0.98CFU/10g(mL)~3.03CFU/10g(mL)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最忻版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)SN/T2206.8化妝品微生物檢驗(yàn)方法第8部分：白色念珠菌SN/T5075化妝品微生物檢驗(yàn)副樣規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒有需要得定的術(shù)語(yǔ)和定義。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。DNA:脫氧核糖核酸(deoxyriboucleicacid)dAPCR:微滴式數(shù)字PCR(dmopletdigitalPayneraseChuinReactiom)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)5方法原理針對(duì)白色念珠菌RNA編碼基因(DNA)中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)保守序列設(shè)計(jì)引物、探針。將一定濃度的引物、探針與模板DNA及反應(yīng)預(yù)混液混合，配成PCR反應(yīng)體系。將該數(shù)字PCR體系分布到12000個(gè)-20000個(gè)微滴中，使大部分微滴中模板DNA分子的數(shù)量為1或0,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ITS2基因探針5'端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記BHQ1。利用數(shù)字PCR系統(tǒng)的檢測(cè)通道，可對(duì)每個(gè)微滴的熒光信號(hào)進(jìn)行采集分析。含有模板DNA的微滴出現(xiàn)熒光信號(hào)的增強(qiáng)，形成陽(yáng)性微滴26.1恒溫培養(yǎng)箱：30℃±1℃。6.2冰箱：2℃-8℃、-20℃。Primer-F:5°-ACCGCTGGGTITCC待測(cè)的樣品應(yīng)在室溫下保存，不要溫育、冷藏和冷凍樣品。樣品的制樣處理參照SN/T5075的規(guī)準(zhǔn)確取10g或10mL(不應(yīng)少于1g或1mL)充分混勻的待測(cè)樣品，加入到90mLSCDLP增菌液，置于30℃±1℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20h-72h。9.3DNA提取混勻增菌培養(yǎng)物，在其液面表層吸取1mL,于10000g-12000g離心3min,棄去上清液。必要時(shí)，用生理鹽水清洗沉淀1次~2次。用1mL生理鹽水混懸沉淀，于10000g-12000g離心3min,棄去上清液。在沉淀中加入75μLDNA提取液和2μL蛋白酶K漩渦混勻10min,于100℃水浴10min,冰浴1min后，于10000g-12000g離心10min,取上清液作為DNA模板。若不能及時(shí)分析DNA模板可置于-20℃以下冷凍保存?zhèn)溆?。樣品DNA使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm和280nm處的吸收值A(chǔ)m和Amm圣4按照公式(1)計(jì)算DNA的濃度。式中：P—DNA濃度，單位為納克每微升(ng/HL);N——核酸稀釋倍數(shù)。A/As在18~2.0之間，DNA濃度為0.01ng/HL~10ng/μL時(shí)，適用ddPCR檢測(cè)。檢測(cè)過程中分別設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。以白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA或含目的片段的DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，以非白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA作為陰性對(duì)照，用等體積的一級(jí)水代替模板DNA作為空白對(duì)照。每個(gè)待檢樣品提取的DNA溶液進(jìn)行3個(gè)平行ddPCR檢測(cè)。按照表1配制ddPCR反應(yīng)體系"。一一水一一一將配制好的ddPCR反應(yīng)混合液，加人微滴生成裝置加樣孔中，按儀器操作說明生成微滴。將生成的微滴八連管加蓋后，緩慢轉(zhuǎn)移至PCR儀上，按以下參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃30s;94℃10s,5