微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

中藥學(xué)教學(xué)部

重慶郵電學(xué)院生物信息學(xué)院

2004年09月

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微生物學(xué)與兔疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課是微生物與免疫學(xué)課程的重要組成部分。學(xué)習(xí)本實(shí)驗(yàn)課的目的是在學(xué)生系

統(tǒng)學(xué)習(xí)理論知識的基礎(chǔ)上，加深理解，并驗(yàn)證和鞏固其理論知識，學(xué)習(xí)和掌握本課程的基本操作技術(shù)；

同時(shí)培養(yǎng)學(xué)生觀察、思考和分析問題的能力，獨(dú)立學(xué)習(xí)和獨(dú)立工作能力的科學(xué)作風(fēng)，嚴(yán)肅的科學(xué)態(tài)度和

嚴(yán)密的工作方法。讓學(xué)生了解微生物學(xué)與免疫學(xué)的科學(xué)研究方法和基本技術(shù)，培養(yǎng)學(xué)生樹立相互幫助和

團(tuán)結(jié)協(xié)作的精神。

為適應(yīng)目前教學(xué)工作的需要，我們結(jié)合中藥學(xué)專業(yè)教學(xué)計(jì)劃和《微生物學(xué)與免疫學(xué)》理論教學(xué)和實(shí)

驗(yàn)教學(xué)大綱和實(shí)驗(yàn)教學(xué)計(jì)劃要求，編寫了這本《微生物學(xué)與免疫學(xué)》實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書。

本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書內(nèi)容包括微生物學(xué)、免疫學(xué)等共12項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)要求36小時(shí)以上。實(shí)際實(shí)驗(yàn)時(shí)

可根據(jù)教學(xué)計(jì)劃安排的實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)數(shù)選擇相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)按照教學(xué)大綱的要求，實(shí)驗(yàn)力求實(shí)用

性、科學(xué)性和先進(jìn)性，既精選傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，又增添了部分目前能開展的較先進(jìn)實(shí)用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。每

項(xiàng)實(shí)驗(yàn)包括實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（材料、方法、結(jié)果分析及注意事項(xiàng)）等項(xiàng)目，同時(shí)后附思

考題，以供學(xué)生獨(dú)立思考、加深理解。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)免疫學(xué)、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)微生物學(xué)同分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、微電子計(jì)算機(jī)科學(xué)、自動(dòng)化檢測

分析技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)技術(shù)具有高特異性、高靈敏性，使檢測微量化、標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化以至智能

化。但是，由于目前實(shí)驗(yàn)教學(xué)的要求和學(xué)時(shí)所限，有些尚不能在本科學(xué)生實(shí)驗(yàn)中開展，因此本實(shí)驗(yàn)講義

還未將這些新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)編入。

生物信息學(xué)院中藥學(xué)教學(xué)部

江懷仲編著

2004年09月

實(shí)驗(yàn)須知

微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課的目的是：訓(xùn)練學(xué)生掌握微生物學(xué)與免疫學(xué)最基本的操作技能；了解微生物

學(xué)與免疫學(xué)的基本知識；加深理解課堂講授的某些微生物學(xué)與免疫學(xué)理論。同時(shí)，通過實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生

觀察、思考、分析問題和解決問題的能力；實(shí)事求是、嚴(yán)肅認(rèn)真的科學(xué)態(tài)度以及勤儉節(jié)約、愛護(hù)公物的

良好作風(fēng)。

為了上好微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課，并保證安全，特提出如下注意事項(xiàng)：

1、每次實(shí)驗(yàn)前必須對實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行充分預(yù)習(xí)，以了解實(shí)驗(yàn)的目的、原理和方法，做到心中有數(shù)，

思路清楚。

2.認(rèn)真及時(shí)做好實(shí)驗(yàn)記錄，對于當(dāng)時(shí)不能得到結(jié)果而需要連續(xù)觀察的實(shí)驗(yàn)，則需記下每次觀察的

現(xiàn)象和結(jié)果，以便分析。

3.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)保持整潔、勿高聲談話和隨便走動(dòng)，保持室內(nèi)安靜。

4實(shí)驗(yàn)時(shí)小心仔細(xì)，全部操作應(yīng)嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行，萬一遇有盛菌試管或瓶不慎打破、皮膚破

傷或菌液吸入口中等意外情況發(fā)生時(shí)，應(yīng)立即報(bào)告指導(dǎo)教師，及時(shí)處理，切勿隱瞞。

，實(shí)驗(yàn)過程中，切勿使酒精、乙酸、丙酮等易燃藥品接近火焰。如遇火險(xiǎn)，應(yīng)先關(guān)掉火源，再用

濕布或沙土掩蓋滅火。必要時(shí)用滅火機(jī)。

6使用顯微鏡或其他貴重儀器時(shí)，要求細(xì)心操作，特別愛護(hù)。對消耗材料和藥品等要力求節(jié)約，

用畢后仍放回原處。

7、每次實(shí)驗(yàn)完畢后，必須把所用儀器抹凈放妥，將實(shí)驗(yàn)室收拾整齊。擦凈桌面，如有菌液污染桌

面或其他地方時(shí)，可用猱蘇爾液或5拓炭酸液覆蓋其上半小時(shí)后擦去。如系芽胞桿菌，應(yīng)適當(dāng)延長

消毒時(shí)間：凡帶菌之工具如吸管、玻璃刮捧等）在洗滌前須浸泡在赫蘇爾液中進(jìn)行消毒：

&每次實(shí)驗(yàn)需進(jìn)行培養(yǎng)的材科，應(yīng)標(biāo)明自己的組別及處理方法，放于教師指定的地點(diǎn)進(jìn)行培養(yǎng)：

實(shí)驗(yàn)室中的菌種和物品等，未經(jīng)教師許可，不得攜出室外：

9每次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，應(yīng)以實(shí)事求是的科學(xué)態(tài)度填入報(bào)告表格中，力求簡明準(zhǔn)確，并連同思考題及時(shí)

匯交教師批閱：

10.離實(shí)驗(yàn)室前應(yīng)將手洗凈，注意關(guān)閉門窗、燈、火、煤氣等。

目錄

實(shí)驗(yàn)一顯微鏡的使用..........................................4

實(shí)驗(yàn)二革蘭氏染色法..........................................6

實(shí)驗(yàn)三細(xì)菌的基本形態(tài)及特殊結(jié)構(gòu)觀察..........................7

實(shí)驗(yàn)四根霉、酵母菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察............................8

實(shí)驗(yàn)五培養(yǎng)基的配制、滅菌與消毒.............................10

實(shí)驗(yàn)六微生物的分離與純化...................................16

實(shí)驗(yàn)七微生物細(xì)胞大小測定和計(jì)數(shù).............................18

實(shí)驗(yàn)八環(huán)境中微生物的檢測...................................22

實(shí)驗(yàn)九細(xì)菌鑒定中常規(guī)的生理生化反應(yīng).........................24

實(shí)驗(yàn)十藥物的微生物學(xué)檢查...................................27

實(shí)驗(yàn)十一沉淀反應(yīng)...........................................30

實(shí)驗(yàn)十二瓊脂凝膠對流免疫電泳...............................31

實(shí)驗(yàn)顯微鏡的使用

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1、學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理和使用方法。

2>了解普通臺(tái)式顯微鏡的結(jié)構(gòu)、各部分的功能和使用方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

微生物學(xué)研究用的顯微鏡通常有低倍物鏡Q6n叫1伙)高倍物鏡叫4X5<)和油鏡(1.9叫

9A100<)三種。油鏡常標(biāo)有黑圈或紅圈，它是三者中放大倍數(shù)最大的。

油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與接物鏡之間，不是隔一層空氣，而是隔一層油質(zhì)，稱為油浸系。

這種油常選用香柏油，因香柏油的折射率n=1.52,與玻璃基本相同。當(dāng)光線通過載玻片后，可直接通

過香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射。如果玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空氣，則稱為干燥系；當(dāng)光線通過玻片

后，受到折射發(fā)生散射現(xiàn)象，進(jìn)入物鏡的光線顯然減少，這樣視野的照明度就減低了圖1-1)o

利用油鏡不但能增加照明度，更主要的是能增加數(shù)值口徑。因?yàn)轱@微鏡的放大效能由其數(shù)值孔徑?jīng)Q

定的。所謂數(shù)值孔徑，即光線投射到物鏡上的最大角

度稱鏡口角)的一半正弦，乘上玻片與物鏡間介質(zhì)折

射率所得的乘積，可用下列公式表示：

N-A=nsin—

2

式中N?A=數(shù)值孔徑"=介質(zhì)折射率

a=最大入射角，即鏡口角

圖1T接物鏡干燥系(A)與油浸系(B)的光線通路

數(shù)值孔徑的大小又是衡量一臺(tái)顯微鏡分辨力強(qiáng)弱

的依據(jù)；分辨力是指顯微鏡能辨別物體兩點(diǎn)間最小距離的能力。

能辨別兩點(diǎn)間最小距離=-^―

2N?A

式中入洸波波長

由上述可知若n值和a角越大則N-A越大或光波波長越短，則顯

微鏡的分辨力越大圖18。

一些物質(zhì)的折射率：水1.33玻璃1.52空氣1.0香柏

油1.515b

三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

S1-2物儲(chǔ)的光線入射角

1.黝皺前選僚0.目的物

(-)實(shí)驗(yàn)器材2.標(biāo)*破片a.入射身

1、儀器及其它用具顯微鏡、擦鏡紙。

2,菌種金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽胞桿菌(Baci1lussubtilis)、巨大

芽泡桿菌(paci1lusrregateriun)的標(biāo)本片、鏈霉菌($treptcmycessp)及青霉(Penici11iumsp)的

水封片。

溶液或試劑：香柏油，二甲苯。

(-)操作步驟

1、取鏡顯微鏡是光學(xué)精密儀器，使用時(shí)應(yīng)特別小心。從

鏡箱中取出時(shí)，一手握鏡臂，一手托鏡座，放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。在使1

2

用時(shí)要特別小心。使用前首先要熟悉顯微鏡的結(jié)構(gòu)和性能，檢查

各部零件是否完全合用，鏡身有無塵土，鏡頭是否清潔。做好必

要的清潔和調(diào)整工作。顯微鏡構(gòu)造見圖

2調(diào)節(jié)光源

1）將低倍物鏡旋到鏡筒下方，旋轉(zhuǎn)粗調(diào)螺旋，使鏡頭和載物臺(tái)距離約為0.5厘米左右。

分上升聚光器，使之與載物臺(tái)表面相距1毫米左右。

3）左眼看目鏡調(diào)節(jié)反光鏡鏡面角度在自然光線下觀察，一般用平面反光鏡；若以燈光為光源，則

一般多用凹面反光鏡）。開閉光圈，調(diào)節(jié)光線強(qiáng)弱，直至視野內(nèi)得到最均勻最適宜的照明為止。

一般染色標(biāo)本油鏡檢查時(shí)，光度宜強(qiáng)，可將光圈開大，聚光器上升到最高，反光鏡調(diào)至最強(qiáng)；未染

色標(biāo)本，在低倍鏡或高倍鏡觀察時(shí)，應(yīng)適當(dāng)?shù)乜s小光圈，下降聚光器，調(diào)節(jié)反光鏡，使光度減弱，否則

光線過強(qiáng)不易觀察。

圖IT光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造

1.物鏡轉(zhuǎn)換器2接物鏡3.游標(biāo)卡尺4.載物臺(tái)5.聚光器6.彩虹光闌

7.光源&鏡座9.電源開關(guān)10.光源滑動(dòng)變阻器11.粗調(diào)螺旋12微

調(diào)螺旋13.鏡臂14鏡筒15.目鏡16標(biāo)本移動(dòng)螺旋

3.低倍鏡觀察低倍物鏡（&或1女）視野面廣，焦點(diǎn)深度較深，為易于發(fā)現(xiàn)目標(biāo)確定檢查位置，

故應(yīng)先用低倍鏡觀察為宜。操作步驟：

1）先將標(biāo)本玻片置于載物臺(tái)上注意標(biāo)本朝上），并將標(biāo)本部位處于物鏡的正下方、轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)螺旋,

上升載物臺(tái)使物鏡至距標(biāo)本約0.5厘米處。

3左眼看目鏡，同時(shí)反時(shí)針方向慢慢旋轉(zhuǎn)粗調(diào)節(jié)螺旋使載物臺(tái)緩慢上升，至視野內(nèi)出現(xiàn)物象后，

改用細(xì)調(diào)節(jié)螺旋，上下微微轉(zhuǎn)動(dòng)，仔細(xì)調(diào)節(jié)焦距和照明，直至視野內(nèi)獲得清晰的物象，及時(shí)確定需進(jìn)一

步觀察的部位。

3）移動(dòng)推動(dòng)器。將所要觀察的部位置于視野中心，準(zhǔn)備換高倍鏡觀察。

4高倍鏡觀察將高倍物鏡&伙）轉(zhuǎn)至鏡筒下方在轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)，要從側(cè)面注視。以防低倍鏡未對

好焦距而造成鏡頭與玻片相撞），調(diào)節(jié)光圈和聚光鏡，使光線亮度適中，再仔細(xì)反復(fù)轉(zhuǎn)動(dòng)微調(diào)螺旋，調(diào)

節(jié)焦距，獲得清晰物象，再移動(dòng)推動(dòng)器選擇最滿意的鏡檢部位將染色標(biāo)本移至視野中央，待油鏡觀察。

\油鏡觀察

1）用粗調(diào)螺旋提起鏡筒，轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器將油鏡轉(zhuǎn)至鏡筒正下方。在標(biāo)本鏡檢部位滴上一滴香柏油。

右手順時(shí)針方向慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)螺旋，上升載物臺(tái)，并及時(shí)從側(cè)面注視使油浸物鏡浸入油中，直到幾乎與

標(biāo)本接觸時(shí)為止注意切勿壓到標(biāo)本，以免壓碎玻片，甚至損壞油鏡頭）。

》左眼看目鏡，右手反時(shí)針方向微微轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)螺旋，下降載物臺(tái)注意：此時(shí)只準(zhǔn)下降載物臺(tái)，不

能向上調(diào)動(dòng)），當(dāng)視野中有模糊的標(biāo)本物象時(shí)，改用細(xì)調(diào)螺旋，并移動(dòng)標(biāo)本直至標(biāo)本物象清晰為止。

3）如果向上轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)螺旋已使鏡頭離開油滴乂尚未發(fā)現(xiàn)標(biāo)本時(shí)，可重新按上述步驟操作直到看清

物象為止。

④觀察完畢，下降載物臺(tái)，取下標(biāo)本片。先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾少量二

甲苯擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。切忌用手或其他紙擦鏡頭，以免損壞鏡

頭，可用綢布擦凈顯微鏡的金屬部件。

5）將各部分還原，反光鏡垂直于鏡座，將接物鏡轉(zhuǎn)成八字形，再向下旋。罩上鏡套，然后放回鏡

箱中。

（三）注意事項(xiàng)

1、顯微鏡鏡頭的保護(hù)和保養(yǎng)，在轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)螺旋時(shí)不要用力過猛，以免損壞鏡頭。

2使用顯微鏡時(shí)應(yīng)據(jù)不同的物鏡而調(diào)節(jié)光線

四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、分別繪出在低倍鏡、高倍鏡和油鏡下觀察到的幾種供試菌的形態(tài)，并注明物鏡放大倍數(shù)和總放

大率。

2思考題：

（1）用油鏡觀察時(shí)應(yīng)注意哪些問題？在載玻片和鏡頭之間加滴什么汕？起什么作用？

（2）影響分辨率的因素有哪些？

實(shí)驗(yàn)二革蘭氏染色法

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.了解革蘭氏染色的原理；

2.初步掌握革蘭氏染色的基本操作方法；

3.運(yùn)用革蘭氏染色對細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定。

二、實(shí)驗(yàn)原理

革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家ChristainGram所創(chuàng)立，后經(jīng)不斷改進(jìn)而成?，F(xiàn)普遍采

用的是Hucker氏改良的革蘭氏染色法。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌G）和革蘭

氏陰性菌G）兩大類，是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別性染色法。

革蘭氏染色法的主要步驟是先用結(jié)晶紫進(jìn)行初染；再加媒染劑一碘液，以增加染料與細(xì)胞間的親和

力，使結(jié)晶紫和碘在細(xì)胞膜上形成分子量較大的復(fù)合物；然后用脫色劑匕醇或丙酮）脫色；最后用蕃紅

復(fù)染。凡細(xì)菌不被脫色而保留初染劑的顏色紫色）者為革蘭氏陽性菌，如被脫色后又染上復(fù)染劑的顏色

紅色）者為革蘭氏陰性菌。

該染色法所以能將細(xì)菌分為G菌和喝，是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。璃

的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時(shí)溶

解了類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)蕃紅

復(fù)染后就成紅色。G菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖

層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色。

三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

（一）實(shí)驗(yàn)器材

1、菌種：牛肉膏瓊脂斜面2駝培養(yǎng)24h的大腸桿菌（Escherichiacoli）斜面菌種；牛肉膏瓊脂斜

面28c培養(yǎng)24的金黃色葡萄球菌和芽泡桿菌（Bcereus）營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2,染色劑：革蘭氏染色液草酸筱結(jié)晶紫染色液，盧（路）哥氏（UgoD碘液，95%L醇，0.5燔紅

染色液）。

入儀器、材料：顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，香柏油，二甲苯，雙層瓶，擦鏡紙，生理鹽

水，吸水紙，染色缸等等

（-）操作步驟

制片一初染一媒染一脫色一復(fù)染一鏡檢

1、制片：涂片（在一張載玻片上加兩滴蒸福水后，分別涂布枯草芽胞桿菌和大腸桿菌）一干燥一

固定熱固定，固定時(shí)通過火焰1一2次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。）無菌操作。

2染色（1）初染：將玻片置于玻片擱架上，加草酸鍍結(jié)晶紫染色液加量以蓋滿菌膜為度），染

色1—2min,傾去染色液，用自來水小心地沖洗。（2媒染：用L液沖去殘水，再用L液覆蓋1分鐘后,

水洗。（3）脫色：①用濾紙吸去殘水；②玻片傾斜-95%EtoH脫色（2N0秒）一水洗（洗去紫色）。（3

復(fù)染：番紅液復(fù)染2分鐘后，水洗；最后用吸水紙輕輕吸干。

入鏡檢：干燥后（用吸水紙吸干），用油鏡觀察。被染成紫色者即為革蘭氏陽性菌G）；被染成紅

色者是革蘭氏陰性菌G）。

E）注意事項(xiàng)

1、革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時(shí)間。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為是革蘭

氏陰性菌；如脫色時(shí)間過短，革蘭氏陰性菌也會(huì)被認(rèn)為是革蘭氏陽性菌。脫色時(shí)間的長短還受涂片厚薄、

脫色時(shí)玻片晃動(dòng)的快慢及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴(yán)格規(guī)定。一般可用已知革蘭氏陽性菌和革

蘭氏陰性菌作練習(xí)，以掌握脫色時(shí)間。當(dāng)要確證一個(gè)未知菌的革蘭氏反應(yīng)時(shí)，應(yīng)同時(shí)做一張已知革蘭氏

陽性菌和陰性菌的混合涂片，以資對照。

2.涂片不宜過厚（以免脫氣不完全造成假陽性），火焰固定（熱固定）不宜過熱。

水洗時(shí)，水流不宜過急、過大，不能直接沖洗涂面，以免涂片薄膜脫落。

4染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染

色效果。

\選用培養(yǎng)114h菌齡的細(xì)菌為宜。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰

性反應(yīng)。

四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

列出供試菌染色觀察結(jié)果（描述供試菌的形狀、顏色和革蘭氏染色反應(yīng)結(jié)果。）

思考題

（1）你認(rèn)為哪些環(huán)節(jié)會(huì)影響革蘭氏染色反應(yīng)結(jié)果的正確性？其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么？

（》革蘭氏染色時(shí)，初染前能加碘液嗎？乙醇脫色后復(fù)染之前，革蘭氏陽性菌和陰性菌應(yīng)分別是

什么顏色？

實(shí)驗(yàn)三細(xì)菌的基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

學(xué)習(xí)并掌握細(xì)菌芽抱、莢膜和鞭毛等特殊結(jié)構(gòu)的染色方法。初步了解芽泡的形態(tài)特征、細(xì)菌鞭毛

的形態(tài)特征。

二、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)菌是一類具有細(xì)胞壁的、單細(xì)胞的原核細(xì)胞型微生物。各種菌細(xì)胞，在一定的環(huán)境條件下，有相

對恒定的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。通過了解細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)，對于細(xì)菌的鑒定，疾病的診斷治療均有重要意義。

細(xì)菌的基本形態(tài)有球形、桿狀和螺形三種。通過革蘭氏染色法，可以鑒別細(xì)菌的形態(tài)、大小、排列

和染色性。

細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)有芽泡、莢膜和鞭毛和菌毛等，其中菌毛只有在電子顯微鏡下才能觀察到，其余三

種的顯微鏡檢查必須用特殊染色方法，才能獲得良好的效果。

細(xì)菌的芽泡具有厚而致密的壁不易著色，若用一般染色法只能使菌體著色而芽抱不著色芽抱呈無

色透明狀）。芽泡染色法就是根據(jù)芽泡既難以染色而一旦染上后又難以脫色這一特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。所有的

芽泡染色法都基于同一個(gè)原則：除了用著色力強(qiáng)的染料外，還需要加熱，以促進(jìn)芽抱著色，再使菌體脫

色，而芽抱上的染料則難以滲出，故仍保留原有的顏色，然后用對比度強(qiáng)的染料對菌體復(fù)染，使菌體和

芽泡呈現(xiàn)出不同的顏色，因而能更明顯地襯托出芽胞，便于觀察.

由于莢膜與染料間的親和力弱，不易著色，通常采用負(fù)染色法染莢膜，即設(shè)法使菌體和背景著色莢

膜不著色。因而莢膜在菌體周圍呈一透明圈。由于莢膜的含水量在9(m上，故染色時(shí)一般不加熱固定，

以免莢膜皺縮變形。

細(xì)菌的鞭毛極細(xì)，直徑一般為1?20w只有用電子顯微鏡才能觀察到。但是，如采用特殊的染色法，

則在普通光學(xué)顯微鏡下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理雷同，即在染色前先用媒染劑處

理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進(jìn)行染色。常用的媒染劑由丹寧酸和氯化高鐵或鉀明

研等配制而成

三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

(―)實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)觀察用標(biāo)本片

1、球菌示教片：腦膜炎奈氏菌、淋病奈氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌。

2.桿菌示教片：大腸埃希菌。

3.螺形菌示教片：霍亂弧菌或水弧菌。

4鞭毛示教計(jì)：傷寒沙門菌或普通變形桿菌(Proteusvulgaris)或粘質(zhì)賽氏桿菌(Serratia

marcescens)o

5.芽胞示教片：破傷風(fēng)梭菌。巨大芽泡桿菌Baci1lusmegateriun)標(biāo)本片。

6莢膜示教片:肺炎鏈球菌。膠質(zhì)芽泡桿菌bacillusmucilaginosus,即“鉀細(xì)菌”)標(biāo)本片。

(-)操作步驟

1、在油鏡下觀察各種形態(tài)的細(xì)菌，比較它們的顏色、大小、形態(tài)、排列方式上有何不同。

2＞用油鏡觀察鞭毛、芽胞、莢膜示教片。注意鞭毛的數(shù)量和位置；芽胞的大小、形態(tài)、位置；莢

膜的厚度，菌體與莢膜的顏色。

四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

根據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果寫現(xiàn)詳細(xì)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

思考題

為什么說細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)必須經(jīng)特殊染色后才能在顯微鏡下觀察到？了解這些特殊結(jié)構(gòu)有何意義？

實(shí)驗(yàn)四霉菌、酵母菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1、掌握霉菌、醉母菌的制片方法；

2.觀察酵母菌的形態(tài)及出芽生殖方式，學(xué)習(xí)區(qū)分酵母菌死活細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法，掌握醉母菌的…般

特征及與細(xì)菌的區(qū)別。

入觀察霉菌的菌落特征、學(xué)習(xí)并掌握觀察霉菌的基本方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

1、霉菌：霉菌由許多交織在一起的菌絲體構(gòu)成。主要分為基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長到

一定階段分化產(chǎn)生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產(chǎn)生胞子。霉菌菌絲體(尤其是繁殖菌絲)及胞子的形態(tài)特征

是識別不同種類霉菌的重要依據(jù)。根霉菌絲呈管狀，無橫隔，直徑比一般細(xì)菌菌絲大幾倍到十幾倍。

菌落特征：形態(tài)較大，質(zhì)地較疏松，顏色各異。

霉菌菌絲較粗大，細(xì)胞易收縮變形，而且泡子很容易飛散，所以制標(biāo)本時(shí)常用乳酸石炭酸棉藍(lán)染色

液。此染色液制成的霉菌標(biāo)本片其特點(diǎn)是：團(tuán)細(xì)胞不變形；⑤具有殺菌防腐作用，且不易干燥，能保

持較長時(shí)間；?溶液本身呈藍(lán)色，有一定染色效果。

為了觀察霉菌清晰、完整、保持自然狀態(tài)的形態(tài)，可利用玻璃紙透析培養(yǎng)法進(jìn)行觀察。此法是利用

玻璃紙的半透膜特性及透光性，將霉菌生長在覆蓋于瓊脂培養(yǎng)基表面的玻璃紙上，然后將長菌的玻璃紙

剪取一小片，貼放在載玻片上用顯微鏡觀察。

霉菌的營養(yǎng)體是分枝的絲狀體，細(xì)胞的平均寬度是”10微米，比細(xì)菌要寬得多，所以，顯微鏡檢

查時(shí)，只要放大400-500倍，甚至放大100倍就可以看清楚。

2,酵母菌：酵母菌是不運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞真核微生物，每種酵母細(xì)胞有一定的形態(tài)大小，大多數(shù)酵母

以出芽方式進(jìn)行無性繁殖，有的分裂繁殖；酵母細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)有明顯的分化，個(gè)體直徑比細(xì)菌大幾倍

到十幾倍。

菌落特征：較大而厚，濕潤、較光滑，顏色較單調(diào)(多為乳白色，少有紅色，偶見黑色)。

美藍(lán)是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍(lán)色，還原型無色。用美藍(lán)對酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，

由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型。因

此，具有還原能力的酵母活細(xì)胞是無色的，而死細(xì)胞或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞則呈藍(lán)色或淡藍(lán)色。

三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

(-)實(shí)驗(yàn)器材

1、菌種：用玻璃紙透析培養(yǎng)法25c培養(yǎng)2-5天的根霉(Eliizpussp),用麥芽汁(或豆芽汁)斜面

培養(yǎng)約2d的釀酒酵母^accharcmycescerevisiaQ。

2.試劑：乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液，0.05味口0.1相氏堿性美藍(lán)染色液，7.6%L雀綠染液，0.5燔紅

染液；蘇丹黑染液；二甲苯；中性紅染液；碘液，5%醇。

3.儀器及其他用具顯微鏡，解剖針，載玻片，蓋玻片，鐐子，平皿；

(二)操作步驟

1、根霉的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

(1)在潔凈載玻片上，滴加乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液1滴。

(2)剪取一小塊用玻璃紙透析培養(yǎng)的帶有根霉菌絲和泡子的玻璃紙，先放在5仍￡醇

中浸一下，以趕走菌體上的氣泡，再放在載玻片上的乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液中。

(3)加蓋玻片，用顯微鏡進(jìn)行觀察，注意觀察根霉假根的形態(tài)。

2酵母的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

(1)在載玻片中央加一滴Q1相氏堿性美藍(lán)染色液，然后按無菌操作用接種環(huán)挑取少量酵母菌苔

放在染液中，混合均勻。

(4用鐐子取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下使其蓋在菌液上。

(3)約3分鐘后鏡檢，先用低倍鏡然后用高倍鏡觀察酵母的形態(tài)及出芽情況，并根據(jù)顏色來區(qū)分

死活細(xì)胞。

(4染色約Q5h后再次進(jìn)行觀察，注意死細(xì)胞數(shù)量是否增加。

(5)用Q05相氏堿性美藍(lán)染色液重復(fù)上述操作進(jìn)行觀察。

(三)注意事項(xiàng)

1、根霉培養(yǎng)注意控制時(shí)間和菌絲生長長度。

2用5帆乙醇浸泡時(shí)應(yīng)浸透，洗去部分抱子

入加蓋玻片時(shí)注意不要產(chǎn)生氣泡，并不要再移動(dòng)蓋玻片，以免弄亂菌絲。

4觀察酵母時(shí)染液不能過多或過少，否則蓋蓋玻片時(shí)出現(xiàn)大量氣泡而影響觀察。

四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

繪圖說明所觀察到的根霉及酵母菌的形態(tài)特征。

思考題：

(1)根據(jù)載玻片培養(yǎng)觀察方法的基本原理，你認(rèn)為在霉菌觀察操作中的哪些步驟可能根據(jù)具體情況

作一些改進(jìn)或可用其他的替代方法？

(2)呂氏堿性美藍(lán)染色液濃度和作用時(shí)間對酵母菌死細(xì)胞數(shù)量有何影響？分析其原因。

(3)顯微鏡下酵母菌與一般細(xì)菌相比有哪些突出的特征？

(④顯微鏡下細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌的主要區(qū)別是什么？

實(shí)驗(yàn)五培養(yǎng)基的配制、滅菌與消毒

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1、明確培養(yǎng)基的配制和消毒原理。

么通過對基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制、滅菌消毒掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。

3.了解細(xì)菌生長的基本營養(yǎng)條件。

二、實(shí)驗(yàn)原理

(-)培養(yǎng)基的配制：培養(yǎng)基是按照微生物生長發(fā)育的需要，用不同組分的營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)制而成的營

養(yǎng)基質(zhì)。人工制備培養(yǎng)基的目的，在于給微生物創(chuàng)造一個(gè)良好的營養(yǎng)條件。把一定的培養(yǎng)基放入一定的

器皿中，就提供了人工繁殖微生物的環(huán)境和場所。自然界中，微生物種類繁多，由于微生物具有不同的

營養(yǎng)類型，對營養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，加之實(shí)驗(yàn)和研究上的目的不同，所以培養(yǎng)基在組成原料上也

各有差異。但是，不同種類和不同組成的培養(yǎng)基中，均應(yīng)含有滿足微生物生長發(fā)育的水分、碳源、氮源、

無機(jī)鹽和生長素以及某些特需的微量元素等。此外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的酸堿度但值)和一定緩沖能

力及一定的氧化還原電位和合適的滲透壓。

根據(jù)制備培養(yǎng)基對所選用的營養(yǎng)物質(zhì)的來源，可將培養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基和合成培

養(yǎng)基三類。按照培養(yǎng)基的形態(tài)可將培養(yǎng)基分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)基使用目的，可將培

養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基及鑒別培養(yǎng)基等。

培養(yǎng)基的類型和種類是多種多樣的，必須根據(jù)不同的微生物和不同的目的進(jìn)行選擇配制，本實(shí)驗(yàn)分

別配制常用培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌和真菌的牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基、高氏一號合成培養(yǎng)基和馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基

等固體培養(yǎng)基。

固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中添加凝固劑制成的，常用的凝固劑有瓊脂、明膠和硅酸鈉，其中以瓊

脂最為常用，其主要成份為多糖類物質(zhì)，性質(zhì)較穩(wěn)定，一般微生物不能分解，故用凝固劑而不致引起化

學(xué)成份變化。瓊脂在95c的熱水中才開始融化，融化后的瓊脂冷卻到4SC才重新凝固。因此用瓊脂制

成的固體培養(yǎng)基在一般微生物的培養(yǎng)溫度范圍內(nèi)Q5C77C)不會(huì)融化而保持固體狀態(tài)。

(二)滅菌與消毒：滅菌是用物理或化學(xué)的方法來殺死或除去物品上或環(huán)境中的所有微生物。消毒

是用物理或化學(xué)的方法殺死物體上絕大部分微生物主要是病原微生物和有害微生物)。消毒實(shí)際上是部

分滅菌。

在微生物實(shí)驗(yàn)、生產(chǎn)和科研工作中，需要進(jìn)行純培養(yǎng)不能有任何雜菌，因此，對所用器材、培養(yǎng)

基要進(jìn)行嚴(yán)格滅菌，對工作場所進(jìn)行消毒，以保證工作順利進(jìn)行。

消毒與滅菌的方法很多，一般可分為加熱、過濾、照射和使用化學(xué)藥品等方法。

1、加熱法：加熱法又分干熱滅菌和濕熱滅菌兩類。

(1)干熱滅菌用干燥熱空氣Q70C)殺死微生物的方法稱干熱滅菌。有火焰燒灼滅菌和熱空氣滅

菌兩種?；鹧鏌茰缇m用于接種環(huán)、接種針和金屬用具如鏡子等，無菌操作時(shí)的試管口和瓶口也在火

焰上作短暫燒灼滅菌。通常所說的干熱滅菌是在電烘箱內(nèi)滅菌，此法適用于玻璃器皿如吸管和培養(yǎng)皿等

的滅菌，在熱空氣160CT70c下保溫2小時(shí)進(jìn)行滅菌。

(2)濕熱滅菌

A高壓蒸汽滅菌法高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，

使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣

閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于1O0C

的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。此法通常是將物品放在1.05kg/加(15磅疾寸

加121.3C的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)保持1R0分鐘進(jìn)行滅菌。時(shí)間的長短可根據(jù)滅菌物品種類和數(shù)量的不

同而有所變化、以達(dá)到徹底滅菌為準(zhǔn)。這種滅菌適用于培養(yǎng)基、工作服、橡皮物品等的滅菌。

在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較

易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低aAl),二是濕熱的穿透力比干熱大表》2;三

是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100C時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出226kJ①焦)的熱量。這種

潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。

表5-1蛋白質(zhì)含水量與凝固所需溫度的關(guān)系

卵中蛋白含水量630分鐘內(nèi)凝固所需溫度(C)

5056

2574-80

188-0

6145

016(^170

表5-2干熱與濕熱穿透力及滅菌效果比較

透過布層的溫度(C)

溫度(C)時(shí)間小時(shí))滅菌

20層40層100層

干熱130-1404867270.5不完全

濕熱105.33101101101完全

在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因?yàn)榭諝馀蛎泬捍笥谒?/p>

蒸汽的膨脹壓，所以，當(dāng)水蒸汽中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。

滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時(shí)，壓力與溫度的關(guān)系見表＞3一般培養(yǎng)基用1.05kg兒武121.3c1A30

分鐘可達(dá)到徹底滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時(shí)間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體情況而有所改

變。例如含糖培養(yǎng)基用0.56kg&?磅撰寸2),1126c滅菌15分鐘，但為了保證效果，可將其他成

分先行121.3C,20分鐘滅菌，然后以無菌操作手續(xù)加入滅菌的糖溶液。又如盛于試管內(nèi)的培養(yǎng)基以

1.05kg^nl,121.3c滅菌20分鐘即可，而盛于大瓶內(nèi)的培養(yǎng)基最好以L05kg/5i滅菌30分鐘。

表X滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時(shí)，壓力與溫度的關(guān)系

壓力數(shù)?空氣排空氣全不

全部空氣排口空氣排S空氣排

千克出時(shí)的溫度排出時(shí)的

磅疾寸2出時(shí)的溫度出時(shí)的溫度出時(shí)的溫度

公斤/厘米2)溫度

db/irf)C)t)t)

dcg/fc向t)t)

0.355108.8100949072

0.7010115.610910510090

1.0515121.3115112109100

1.4020126.2121118115109

1.7525130.0126124121115

21030134.6130128126121

蒸汽壓力所用單位為kg^ni仟克厘米\它與磅承寸)和溫度的換算關(guān)系見表X

表X蒸汽壓力與蒸汽溫度換算關(guān)系

蒸汽壓力壓力表讀數(shù)

蒸汽溫度

kg/cniltk^n2

大氣壓

1.000.000.00100.0

1.250.253.75107.0

1.500.507.50112.0

1.750.7511.25115.0

2001.0015.00121.0

1501.502250128.0

3.0020030.00134.5

實(shí)驗(yàn)室中常用的高壓蒸汽滅菌鍋有立式、臥式和手提式等幾種。

B間歇滅菌法有少數(shù)培養(yǎng)基例如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等用干熱滅菌和高壓蒸

汽滅菌均會(huì)受到破壞，則必須用間歇滅菌法。此法是用阿諾氏流動(dòng)蒸汽滅菌器進(jìn)行滅菌。該器底層盛水,

頂部插有溫度計(jì)，加熱后水蒸汽溫度達(dá)到100C時(shí)，即循環(huán)流于器內(nèi)，水蒸汽碰到器內(nèi)物體時(shí)，又凝成

水，流至底層貯水處，故不至干涸。滅菌時(shí)，將培養(yǎng)基放在器內(nèi)，每天加熱1O0C3O分鐘、連續(xù)三天，

第一天加熱后，其中的營養(yǎng)體被殺死，將培養(yǎng)基取出放室溫下1A24小時(shí)，使其中的芽胞發(fā)育成為營養(yǎng)

體，第二日再加熱100C30分鐘，發(fā)育的營養(yǎng)體又被殺死，但可能仍留有芽泡，故再重復(fù)一次，使徹底

滅菌。一般凡能用高壓蒸汽滅菌的物品均不采用此法滅菌。

G煮沸消毒法注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中煮沸消毒時(shí)間為

10-15分鐘，人用注射器和手術(shù)器械在有條件的地方，一般均采用高壓蒸汽滅菌法或干熱滅菌法滅菌。

2.過濾滅菌

許多材料例如血清與糖溶液應(yīng)用一般加熱消毒滅菌方法，均會(huì)被熱破壞，因此，采用過濾除菌的方

法。應(yīng)用最廣泛的過濾器有蔡氏（Seit0過濾器和膜過濾器。蔡氏過濾器是用銀或鋁等金屬做成的，分

為上、下兩節(jié)、過濾時(shí)，用螺旋把石棉板緊緊地夾在上、下兩節(jié)濾器之間，然后將溶液置于濾器中抽濾。

每次過濾必須用一張新濾板，濾膜過濾器的結(jié)構(gòu)與蔡氏過濾器相似，只是濾膜是一種多孔纖維素匕酸

纖維素或硝酸纖維素），孔徑一般為0.4%6過濾時(shí)，液體和小分子物質(zhì)通過，細(xì)菌被截留在濾膜上，

但若要將病毒除掉，則需更小孔徑的濾膜。

入紫外線滅菌

紫外線波長在20N00網(wǎng)具有殺菌作用，其中以265-266nm殺菌力最強(qiáng)。無菌室或無菌接種箱空

氣可用紫外線燈照射滅菌。

4化學(xué)藥品滅菌

化學(xué)藥品消毒滅菌法是應(yīng)用能殺死微生物的化學(xué)制劑進(jìn)行消毒滅菌的方法。實(shí)驗(yàn)室桌面、用具以及

洗手用的溶液均常用化學(xué)藥品進(jìn)行消毒滅菌。常用的有嬲酚皂溶液來蘇爾）、0.25漸潔爾滅、1冊

汞、3-5部J甲醛溶液、75海精溶液等，見表T

表65常用化學(xué)殺菌劑應(yīng)用范圍和常用濃度表

類另實(shí)例常用濃度應(yīng)用范圍

醉類乙解50-7叱皮膚及器械消毒

酸類乳酸0.33—lmol/L空氣消毒噴霧或熏蒸）

食醋3—5m]/fn3熏蒸消毒空氣，可預(yù)防流感病毒

堿類石灰水IT%地面消毒

石炭酸5%空氣消毒蛾霧）

酚類

來蘇爾2-5%空氣消毒、皮膚消毒

4仍籀液2-&il/fn

醛類福爾馬林接種室、接種箱或廠房熏蒸消毒

升汞o.1%植物組織如根瘤）表面消毒

重金屬離子0.1-1%

硝酸銀皮膚消毒

0.14%

高鎰酸鉀皮膚、水果、茶杯消毒

過氧化氫3%清洗傷口

氧化劑0.2—lppn

氯氣飲用水清潔消毒

1-5%

漂白粉洗刷培養(yǎng)基、飲水及糞便消毒

水稀釋20倍

去污劑新潔爾滅皮膚，不能遇熱的器皿消毒

27%

染料結(jié)晶紫外用紫藥水，淺創(chuàng)傷口消毒

殖奎咻硫酸鹽0.1-0.2%

金屬螯合劑外用、清洗消毒

三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

(-)實(shí)驗(yàn)器材

1、藥品瓊脂，INNaCH溶液，1NH31溶液，牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基、高氏一號合成培養(yǎng)基和馬鈴

薯蔗糖培養(yǎng)基的配方藥品；

2.材料具刻度1000毫升塘瓷盅或小鋁鍋，天平，10X200nm試管，量筒，小燒杯，玻璃棒，骨

匙，出試紙，分裝漏斗，試管盒，紗布，棉花，報(bào)紙，麻繩，標(biāo)簽。

(-)操作步驟

1、計(jì)算稱量根據(jù)配方，計(jì)算出實(shí)驗(yàn)中各種藥品所需要的量，然后分別稱靖)取。

2.溶解一船情況下，幾種藥品可一起倒入燒杯內(nèi)、先加入少于所需要的總體積水進(jìn)行加熱溶解但

在配制化學(xué)成分較多的培養(yǎng)基時(shí)，有些藥品，如磷酸鹽和鈣鹽、鎂鹽等混在一起容易產(chǎn)生結(jié)塊、沉淀，

故宜按配方依次溶解。個(gè)別成分如能分別溶解，經(jīng)分開滅菌后混合，則效果更為理想)。加熱溶解時(shí)，

要不斷攪拌。如有瓊脂在內(nèi)，更應(yīng)注意。待完全溶解后，補(bǔ)足水分到需要的總體積。

A調(diào)節(jié)pH用滴管逐滴加入INNaCH或1NH21邊攪動(dòng)；邊用精密的pH試紙測其出值，直到符合

要求時(shí)為止。pH值也可用pH計(jì)來測定。

4過濾要趁熱用四層紗布過濾。

'分裝按照實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行分裝。裝入試管中的量不宜超過試管高度的力，裝入三角燒瓶中的量

以燒瓶總體積的一半為限。在分裝過程中，應(yīng)注意勿使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口、以免弄濕棉塞，造成污

染。

6,加塞培養(yǎng)基分裝好以后，在試管口或燒瓶口上應(yīng)加上一只棉塞。棉塞的作用有二：一方面阻

止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)，防止由此而引起的污染；另一方面保證有良好的通氣性能，使微生物能不

斷地獲得無菌空氣。因此棉塞質(zhì)量的好壞對實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有很大影響。目前可用專用封口紙進(jìn)行封口。

圖3-1培養(yǎng)基的分裝裝置與棉塞

A培養(yǎng)基的分裝

R棉塞的做法：①正確；②管內(nèi)太短，外部太松；6)整個(gè)棉塞太松；④管內(nèi)太緊，外部太短松。

7.滅菌在塞上棉塞的容器外面再包一層牛皮紙，便可進(jìn)行滅菌。培養(yǎng)基的滅菌時(shí)間和溫度，需

按照各種培養(yǎng)基的規(guī)定進(jìn)行，以保證滅菌效果和不損壞培養(yǎng)基的必要成分。培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制

品等用高壓滅菌。

手提式高壓蒸汽滅菌鍋的使用操作步驟：

(1)首先將內(nèi)層滅菌桶取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。

(④放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。

三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。

(3)加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對稱的方式同時(shí)旋緊相對

的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。

(④用電爐或煤氣加熱，并同時(shí)打開排氣閥，使水沸騰以排除渦內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡

后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制熱源，

維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用1.05k^ni,121.JC,20分鐘滅菌。

(5)滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源或關(guān)閉煤氣，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至0

時(shí)，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時(shí)，打開排氣閥，就會(huì)因鍋

內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基

而發(fā)生污染。

(6如果分裝的斜面，要趁熱擺放并使斜面長度適當(dāng)?shù)脑嚬荛L度1/3T/2不能超過培養(yǎng)

基經(jīng)滅菌后，應(yīng)保溫培養(yǎng)27天，放入37c溫箱培養(yǎng)24小時(shí)，檢查滅菌效果，無菌生長者方可使用。

玻璃器皿如吸管、平板等)、金屬用具等凡不適于用其他方法滅菌而又能耐高溫的物品都可用干熱

滅菌。

干熱滅菌操作步驟：

(1)裝箱將準(zhǔn)備滅菌的玻璃器具洗滌干凈、晾干，用紙包裹好，放入滅菌的長鐵盒或鋁盒)內(nèi)，

放入干熱滅菌箱內(nèi)，關(guān)好箱門。

(2)滅菌接通電源，打開干熱滅菌箱排氣孔，等溫度升至80-100C時(shí)關(guān)閉排氣孔，繼續(xù)升溫至

160-170C計(jì)時(shí)，恒溫l-2h

(3)滅菌結(jié)束后，斷開電源，自然降溫至6CC,打開電烘箱門，取出物品放置備用。

(三)注意事項(xiàng)

1、配制固體培養(yǎng)基用的瓊脂應(yīng)先行用冷水浸泡，紗布過濾，在調(diào)好出值后加入。

2＞配制高氏一號合成培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)小心溶解淀粉，不要成團(tuán)。

入干熱滅菌物品不能堆得太滿、太緊，以免影響溫度均勻上升。滅菌物品不能直接放在電烘箱底

板上，以防止包紙烘焦。

4干熱滅菌溫度恒定在160-170C為宜，溫度過高，紙和棉花會(huì)被烤焦。降溫時(shí)待溫度自然降至

60C以下再打開箱門取出物品，以免因溫度過高而驟然降溫導(dǎo)致玻璃器皿炸裂。

四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

簡述培養(yǎng)基制作和消毒的主要過程，并就試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析O

思考題

1、培養(yǎng)基配制好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無菌的？

2在配制培養(yǎng)基過程中應(yīng)注意些什么問題？為什么？

次干熱滅菌過程中應(yīng)注意哪些問題？為什么？

4為什么干熱滅菌比濕熱滅菌所需要的溫度高，時(shí)間長？請?jiān)O(shè)計(jì)干熱滅菌和濕熱滅菌效果比較的

實(shí)驗(yàn)方案。

實(shí)驗(yàn)六微生物的分離與純化

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術(shù)（稀釋涂布平板法和平板劃線分離

法及簡易單抱子分離法）

二、實(shí)驗(yàn)原理

從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。常用的

方法有

1、簡易單細(xì)胞挑取法

采用很細(xì)的毛細(xì)管吸取較稀的萌發(fā)的泡了懸浮液滴在培養(yǎng)皿蓋的內(nèi)壁上，在低倍鏡下逐個(gè)檢查微

滴，將只有一個(gè)萌發(fā)抱子的微滴放一小塊營養(yǎng)瓊脂片，使其發(fā)育成微菌落。

區(qū)平板劃線分離法

在土壤、水、空氣或人及動(dòng)、植物體中，不同種類的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起，當(dāng)我們

希望獲得某一種微生物時(shí)，就必須從混雜的微生物類群中分離它，以得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng),

這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。

為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)。一般是根據(jù)該微生物對營養(yǎng)、酸堿度、氧等條件要求不同，而供給

它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長，而抑制其他菌生長的環(huán)境，從而淘汰其他

一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或平板劃線分離法等分離、純化該微生物,

直至得到純菌株。

土壤是微生物生活的大本營，在這里生活的微生物無論總數(shù)量和種類都是極其多樣的，因此，土壤

是我們開發(fā)利用微生物資源的重要基地，可以從其中分離、純化到許多有用的菌株。本實(shí)驗(yàn)用平板劃線

法從土壤中分離純化微生物。

三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

（-）實(shí)驗(yàn)器材

1、牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基、高氏一號合成培養(yǎng)基和馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等；

2.盛刖1無菌水的試管，盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，1ml和5ml無菌吸管，無菌培

3.接種環(huán)，天平、稱樣瓶、記號筆；待測樣品如土樣。，

（-）操作步驟

1、平板劃線分離法—

（1）倒平板將加熱融化的牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基、高氏一f

號合成培養(yǎng)基和馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基分別倒平板，并標(biāo)明名稱。M

（》劃線在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑

取經(jīng)稀釋10倍的土壤懸液近在平板上劃線圖“D。

圖平板劃線操作示意圖

劃線的方法很多，但無論哪種方法劃線，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，使形成單

個(gè)菌落。常用的劃線方法有下列二種：

①用接種環(huán)以無菌操作挑取土壤懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線M條，再轉(zhuǎn)

動(dòng)培養(yǎng)皿約70角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用

同法通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線圖

小。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。

②挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線圖a26。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置溫室培

養(yǎng)。

(3)挑菌將培養(yǎng)后長出的單個(gè)菌落分別挑取

接種到上述三種培養(yǎng)基的斜面上，分別置25c和

2SC溫室中培養(yǎng),待菌苔長出后,檢查菌苔是否單純，

也可用顯微鏡涂片染色檢查是否是單一的微生物，若

有其他雜菌混雜，就要再一次進(jìn)行分離、純化，直到

獲得純培養(yǎng)。

1稀釋涂布平板法

(1)樣品稀釋液的制備圖片2劃線分離示意圖

準(zhǔn)確稱取待測樣品10g放入裝有9&nl無菌水并放有小玻珠的253L三角瓶中，用手或置搖床上振

蕩2的由使微生物細(xì)胞分散，靜置約2―0s,即成104稀釋液；再用1ml無菌吸管，吸取1。'稀釋液

1ml移入裝有無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，即成1爐稀釋液；再換一支無菌吸管

吸取KT，菌液InL移入裝有加11無菌水試管中，即成稀釋液；以此類推，一定要每次更換吸管，連

續(xù)稀釋，制成18、1(T\1(T；1(T;l(f等一系列稀釋度的菌液，供平板接種使用如圖

_1_2_3-4-5-6-7_g

101010101010101010

圖㈠稀釋平板法中樣品的稀釋和稀釋液的取樣

用稀釋平板法時(shí)，待測菌稀釋度的選擇應(yīng)根據(jù)樣品確定。樣品中所含待測菌的數(shù)量多時(shí)，稀釋度應(yīng)

高，反之則低。通常測定細(xì)菌菌劑含菌數(shù)時(shí)，多采用1f、1屋稀釋度的菌液；測定土壤細(xì)菌數(shù)量

時(shí)，多采用10"、10'、稀釋度的菌液；測定放線菌和真菌數(shù)量時(shí)，多采用10