藥品微生物檢驗(yàn)技術(shù)課件 模塊三 藥品有效性檢查

《藥品微生物檢驗(yàn)技術(shù)》模塊三藥品有效性檢查項(xiàng)目一抑菌效力檢查

任務(wù)一試驗(yàn)菌的準(zhǔn)備

任務(wù)二金蓮花口服液的抑菌效力檢查

目錄項(xiàng)目一抑菌效力檢查任務(wù)一試驗(yàn)菌的準(zhǔn)備

任務(wù)引入請(qǐng)思考口服液中常含有苯甲酸鈉、山梨酸鉀等成分，它們的作用是什么？多劑量包裝的制劑在正常貯藏或使用過(guò)程中，是否有可能發(fā)生的微生物污染和繁殖，使藥物變質(zhì)而對(duì)使用者造成危害？

任務(wù)分析

如果藥物本身不具有充分的抗菌效力，那么應(yīng)根據(jù)制劑特性（如水溶性制劑）添加適宜的抑菌劑，以防止制劑在正常貯藏或使用過(guò)程中可能發(fā)生的微生物污染和繁殖，使藥物變質(zhì)而對(duì)使用者造成危害，尤其是多劑量包裝的制劑。但是，抑菌劑的抑菌效力在貯存過(guò)程中有可能因藥物的成分或包裝容器等因素影響而變化，因此，應(yīng)驗(yàn)證成品制劑的抑菌效力在有效期內(nèi)不因貯藏條件而降低。

抑菌效力檢查法系用于測(cè)定無(wú)菌及非無(wú)菌制劑中抑菌劑的抑菌活性，該檢查應(yīng)按照《中國(guó)藥典》（2020年版）抑菌效力檢查法（通則1121）的有關(guān)要求進(jìn)行。任務(wù)分析工作內(nèi)容工作要求關(guān)鍵點(diǎn)培養(yǎng)基制備選擇正確培養(yǎng)基、完成制備計(jì)算、稱量、調(diào)劑pH、分裝、滅菌試驗(yàn)菌菌液制備方法正確、完成制備微量移液器使用、無(wú)菌操作、無(wú)菌環(huán)境維持1.口服液中可能存在的微生物有細(xì)菌和真菌，所以，試驗(yàn)菌應(yīng)選擇細(xì)菌和真菌。選擇《中國(guó)藥典》抑菌效力檢查法（通則1121）規(guī)定的菌株，并按規(guī)定的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等條件對(duì)菌種進(jìn)行培養(yǎng)，制備試驗(yàn)菌菌液。2.細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)時(shí)所需的營(yíng)養(yǎng)成分及生長(zhǎng)環(huán)境都有差別，因此，要分別選擇適宜細(xì)菌、真菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。并按照《中國(guó)藥典》中無(wú)菌檢查法（通則1101）制備。工作內(nèi)容及要求相關(guān)知識(shí)-抑菌劑

抑菌劑是指具有抑菌作用，能夠抑制微生物生長(zhǎng)、繁殖的化學(xué)物質(zhì)，有時(shí)也稱為防腐劑。抑菌劑能使病原微生物蛋白質(zhì)變性；能與病原微生物酶系統(tǒng)結(jié)合；也能增加菌體細(xì)胞的通透性，使細(xì)胞膜破裂、溶解等。因此，抑菌劑對(duì)微生物繁殖體有殺滅作用，對(duì)芽孢有抑制作用，使其不能發(fā)育為繁殖體而逐漸死亡。抑菌劑常用濃度使用范圍苯甲酸與苯甲酸鈉0.25%～0.40%內(nèi)服和外用制劑對(duì)羥基苯甲酸酯類(lèi)（尼泊金類(lèi)）0.01%～0.25%內(nèi)服液體制劑山梨酸與山梨酸鉀0.15%～0.25%內(nèi)服和外用制劑苯扎溴銨0.02%～0.2%外用制劑三氯叔丁醇0.25%～0.5%外用制劑和一些注射劑藥物制劑中一些常見(jiàn)的抑菌劑相關(guān)知識(shí)-培養(yǎng)基

抑菌效力檢查中需要使用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。其中胰酪大豆胨液體（瓊脂）培養(yǎng)基用于細(xì)菌的培養(yǎng)。沙氏葡萄糖液體（瓊脂）培養(yǎng)基用于真菌的培養(yǎng)。相關(guān)知識(shí)-試驗(yàn)菌株

培養(yǎng)基適用性檢查、方法適用性試驗(yàn)用菌株包括金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉菌。抑菌效力測(cè)定用菌株除上述菌株外，若需要，制劑中常見(jiàn)的污染微生物也可作為試驗(yàn)菌株，例如含高濃度糖的口服制劑還應(yīng)選用魯氏酵母為試驗(yàn)菌株。這些試驗(yàn)菌的新鮮培養(yǎng)物經(jīng)稀釋后制成濃度適宜的菌懸液或孢子懸液用于抑菌效力檢查。相關(guān)知識(shí)-試驗(yàn)菌株

試驗(yàn)菌株試驗(yàn)培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時(shí)間金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC（B）26003]胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基30～35℃18～24小時(shí)銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC（B）10104]胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基30～35℃18～24小時(shí)大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC（B）44102]胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基30～35℃18～24小時(shí)白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC（F）98001]沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基20～25℃48小時(shí)黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC（F）98003]沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基20～25℃6～10天或直到獲得豐富孢子培養(yǎng)基適用性檢查、方法適用性試驗(yàn)、抑菌效力測(cè)定用試驗(yàn)菌及新鮮培養(yǎng)物制備任務(wù)實(shí)施一、制訂工作計(jì)劃根據(jù)任務(wù)要求，制定合理工作進(jìn)度計(jì)劃，并根據(jù)小組成員的特點(diǎn)進(jìn)行分工。序號(hào)工作內(nèi)容完成時(shí)間成員負(fù)責(zé)人1胰酪大豆胨液體（瓊脂）培養(yǎng)基制備

2沙氏葡萄糖液體（瓊脂）培養(yǎng)基制備

3金黃色葡萄球菌菌液制備

4銅綠假單胞菌菌液制備

5大腸埃希菌菌液制備

6白色念珠菌菌液制備

7黑曲霉菌菌液制備

任務(wù)實(shí)施二、試驗(yàn)前準(zhǔn)備設(shè)備、器材、試劑規(guī)格數(shù)量用途無(wú)菌室

操作場(chǎng)所超凈工作臺(tái)

操作區(qū)域酒精燈

局部無(wú)菌環(huán)境75%酒精

擦拭消毒培養(yǎng)基各試劑

配制培養(yǎng)基移液器

移取定量液體試管、試管架

容器、支架三角瓶

盛放培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)箱、真菌培養(yǎng)箱

培養(yǎng)滅菌鍋

培養(yǎng)基滅菌供試菌株

制備供試菌菌液補(bǔ)充1：

補(bǔ)充2：

任務(wù)實(shí)施三、試驗(yàn)操作序號(hào)步驟操作內(nèi)容1選器具高壓蒸汽滅菌器、電子天平、電爐、1000mL燒杯、玻璃棒、藥匙、試管或錐形瓶、pH試紙等2取試劑取胰酪胨、大豆木瓜蛋白酶水解物、葡萄糖（或無(wú)水葡萄糖）、氯化鈉、磷酸二氫鉀、蒸餾水3稱量電子天平稱量胰酪胨___g、大豆木瓜蛋白酶水解物___g、葡萄糖（或無(wú)水葡萄糖）___g、氯化鈉___g、磷酸二氫鉀___g于燒杯中4溶解加水微溫溶解，濾過(guò)，加水至培養(yǎng)基總體積為_(kāi)___mL5調(diào)節(jié)pH調(diào)節(jié)pH為_(kāi)___6加入葡萄糖稱量葡萄糖（或無(wú)水葡萄糖）___g，加入培養(yǎng)基中7分裝、包扎、滅菌將分裝包扎好的培養(yǎng)基放入高壓蒸汽滅菌器中，___℃,滅菌___min8保藏取出滅菌好的培養(yǎng)基，放至于_____保藏待用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的制備任務(wù)實(shí)施序號(hào)步驟操作內(nèi)容1選器具高壓蒸汽滅菌器、電子天平、電爐、1000mL燒杯、1000mL量筒、玻璃棒、藥匙、試管或錐形瓶、pH試紙等2取試劑取胰酪胨、大豆木瓜蛋白酶水解物、氯化鈉、瓊脂、蒸餾水3稱量電子天平稱量胰酪胨___g、大豆木瓜蛋白酶水解物___g、氯化鈉___g于燒杯中4溶解加水微溫溶解，加水至培養(yǎng)基總體積為_(kāi)___mL5調(diào)節(jié)pH調(diào)節(jié)pH為_(kāi)___6加入瓊脂稱量瓊脂___g，加入培養(yǎng)基中，加熱溶化，搖勻7分裝、包扎、滅菌將分裝包扎好的培養(yǎng)基放入高壓蒸汽滅菌器中，___℃,滅菌___min8保藏取出滅菌好的培養(yǎng)基，放至于_____保藏待用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基的制備任務(wù)實(shí)施序號(hào)步驟操作內(nèi)容1選器具高壓蒸汽滅菌器、電子天平、電爐、1000mL燒杯、1000mL量筒、玻璃棒、藥匙、試管或錐形瓶、pH試紙等2取試劑取動(dòng)物組織胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物、葡萄糖、蒸餾水3稱量電子天平稱量動(dòng)物組織胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物___g于燒杯中4溶解加水微溫溶解，加水至培養(yǎng)基總體積為_(kāi)___mL5調(diào)節(jié)pH調(diào)節(jié)pH為_(kāi)___6加入葡萄糖稱量葡萄糖___g，加入培養(yǎng)基中，搖勻7分裝、包扎、滅菌將分裝包扎好的培養(yǎng)基放入高壓蒸汽滅菌器中，___℃,滅菌___min8保藏取出滅菌好的培養(yǎng)基，放至于_____保藏待用沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基的制備任務(wù)實(shí)施序號(hào)步驟操作內(nèi)容1選器具高壓蒸汽滅菌器、電子天平、電爐、1000mL燒杯、1000mL量筒、玻璃棒、藥匙、試管或錐形瓶、pH試紙等2取試劑取動(dòng)物組織胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物、葡萄糖、瓊脂、蒸餾水3稱量電子天平稱量動(dòng)物組織胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物___g于燒杯中4溶解加水微溫溶解，加水至培養(yǎng)基總體積為_(kāi)___mL5調(diào)節(jié)pH調(diào)節(jié)pH為_(kāi)___6加入瓊脂稱量瓊脂___g，加入培養(yǎng)基中，加熱溶化7加入葡萄糖稱量葡萄糖___g，加入培養(yǎng)基中，搖勻8分裝、包扎、滅菌將分裝包扎好的培養(yǎng)基放入高壓蒸汽滅菌器中，___℃,滅菌___min9保藏取出滅菌好的培養(yǎng)基，放至于_____保藏待用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的制備任務(wù)實(shí)施培養(yǎng)基適用性檢查用菌液制備序號(hào)步驟操作內(nèi)容1選器具無(wú)菌試管、無(wú)菌移液管等2選藥品pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液3選菌種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌，傳代次數(shù)為_(kāi)__代4金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌

菌懸液制備取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。5黑曲霉菌菌懸液制備取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入適量含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的孢子懸液。6保存菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在2～8℃，可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉的孢子懸液可保存在2～8℃，在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使用。任務(wù)實(shí)施抑菌效力測(cè)定用菌液制備序號(hào)步驟操作內(nèi)容1選器具無(wú)菌試管、無(wú)菌移液管等2選藥品0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液3選菌種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌4金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌

菌懸液制備金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌若為瓊脂培養(yǎng)物，加入適量的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液將瓊脂表面的培養(yǎng)物洗脫，并將菌懸液移至無(wú)菌試管內(nèi)，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋并制成每1mL含菌數(shù)約為_(kāi)__cfu的菌懸液；若為液體培養(yǎng)物，離心收集菌體，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋并制成每1mL含菌數(shù)約為_(kāi)__cfu的菌懸液。5黑曲霉菌菌懸液制備取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入適量含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后，用適宜方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，加入適量的含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1mL含孢子數(shù)___cfu的孢子懸液。測(cè)定1mL菌懸液中所含的菌數(shù)。6保存菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在2～8℃，可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉的孢子懸液可保存在2～8℃，在7天內(nèi)使用。任務(wù)測(cè)評(píng)序號(hào)考核內(nèi)容考核標(biāo)準(zhǔn)配分得分1培養(yǎng)基制備正確計(jì)算培養(yǎng)基各組分用量5

正確配制培養(yǎng)基10

能完成培養(yǎng)基滅菌操作5

培養(yǎng)基保存適宜5

2培養(yǎng)基適用性檢查用菌液制備緩沖液或稀釋液選擇正確5

無(wú)菌操作規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)10

移液器使用正確5

菌液保存適宜5

3抑菌效力測(cè)定用菌液制備緩沖液或稀釋液選擇正確5

無(wú)菌操作規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)10

移液器使用正確5

1mL菌懸液中所含的菌數(shù)符合要求15

菌液保存適宜5

4培養(yǎng)物處理、無(wú)菌室清潔能正確完成培養(yǎng)物處理5

能正確完成無(wú)菌室清潔5

合計(jì)100項(xiàng)目一抑菌效力測(cè)定任務(wù)二金蓮花口服液抑菌效力檢查

任務(wù)引入請(qǐng)思考某制藥企業(yè)生產(chǎn)了一批金蓮花口服液，需要進(jìn)行抑菌效力檢查。如何判斷抑菌劑的效力是否合格呢？

任務(wù)分析

抑菌效力檢查主要環(huán)節(jié)包括培養(yǎng)基和試驗(yàn)菌菌液制備、方法適用性檢查、供

試品接種、存活菌數(shù)測(cè)定、結(jié)果判斷。1.抑菌效力檢查法所用培養(yǎng)基和試驗(yàn)菌菌液制備已在本項(xiàng)目任務(wù)一中做了介紹，不再贅述。

2.方法適用性檢查主要包括培養(yǎng)基適用性檢查和存活菌計(jì)數(shù)方法的適用性檢查。通過(guò)方法適用性檢查確認(rèn)抑菌效力檢查法中所采用的培養(yǎng)基、計(jì)數(shù)方法適合于試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)和計(jì)數(shù)。

3.供試品接種和存活菌數(shù)測(cè)定是將一定量的試驗(yàn)菌接種到一定量的供試品中并貯存一段時(shí)間，在不同的貯存時(shí)間段中對(duì)供試品中的存活菌進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。任務(wù)分析工作內(nèi)容工作要求關(guān)鍵點(diǎn)培養(yǎng)基適用性檢查與方法適用性試驗(yàn)供試組、對(duì)照組設(shè)置正確正確判斷適用性供試品接種供試品抽樣、接種操作正確正確抽樣、無(wú)菌操作、無(wú)菌環(huán)境維持存活菌數(shù)測(cè)定取樣時(shí)間、取樣量正確無(wú)菌操作、無(wú)菌環(huán)境維持結(jié)果判斷結(jié)果判斷正確有效結(jié)果、供試品合格結(jié)果4.結(jié)果判斷是將試驗(yàn)檢查得到的存活菌數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)菌數(shù)進(jìn)行比較，判斷供試品的抑菌效力是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。工作內(nèi)容及要求相關(guān)知識(shí)-培養(yǎng)基適用性檢查

培養(yǎng)基是影響微生物生長(zhǎng)繁殖的重要因素，培養(yǎng)基可能由于其促生長(zhǎng)能力、指示能力、抑制能力的差異，導(dǎo)致微生物菌落顏色形態(tài)、菌落數(shù)量等指標(biāo)存在較大差異，從而影響結(jié)果判斷的正確性。因此，培養(yǎng)基需要進(jìn)行適用性檢查，培養(yǎng)基適用性檢查是通過(guò)比較試驗(yàn)菌在檢驗(yàn)用培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的形態(tài)特征、數(shù)量等方面來(lái)評(píng)價(jià)檢驗(yàn)培養(yǎng)基是否滿足檢驗(yàn)要求。抑菌效力測(cè)定用培養(yǎng)基包括成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查。相關(guān)知識(shí)-抑菌效力檢查原理

抑菌效力檢查是采用微生物法進(jìn)行，供試藥物制劑中含有的抑菌劑會(huì)對(duì)加入其中的微生物產(chǎn)生抑制作用，時(shí)間越長(zhǎng)抑制作用越強(qiáng)，存活的微生物數(shù)量越少。

制備試驗(yàn)菌株新鮮培養(yǎng)物，然后再經(jīng)過(guò)稀釋制成濃度適宜的菌懸液或孢子懸液，按照一定的接種量接種于適量的供試藥物制劑中，置于適宜溫度下貯存，按照規(guī)定的時(shí)間間隔，分別從供試藥物制劑中取樣適量，接種于適合微生物生長(zhǎng)的不同培養(yǎng)基中，以測(cè)定供試藥物制劑中所含存活菌數(shù)。通過(guò)比較供試藥物制劑在不同時(shí)間間隔中所含微生物數(shù)量的變化來(lái)判斷供試藥物制劑是否會(huì)對(duì)試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑制作用而進(jìn)行抑菌效力檢查。任務(wù)實(shí)施一、制訂工作計(jì)劃根據(jù)任務(wù)要求，制定合理工作進(jìn)度計(jì)劃，并根據(jù)小組成員的特點(diǎn)進(jìn)行分工。序號(hào)工作內(nèi)容完成時(shí)間成員負(fù)責(zé)人1培養(yǎng)基適用性檢查

2方法適用性試驗(yàn)

3供試品接種

4存活菌數(shù)測(cè)定

5結(jié)果判斷任務(wù)實(shí)施二、試驗(yàn)前準(zhǔn)備設(shè)備、器材、試劑規(guī)格數(shù)量用途無(wú)菌室

操作場(chǎng)所超凈工作臺(tái)

操作區(qū)域酒精燈

局部無(wú)菌環(huán)境75%酒精

擦拭消毒培養(yǎng)基各試劑

配制培養(yǎng)基移液器

移取定量液體試管、試管架

容器、支架三角瓶

盛放培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)箱、真菌培養(yǎng)箱

培養(yǎng)滅菌鍋

培養(yǎng)基滅菌供試菌株

制備供試菌菌液補(bǔ)充1：

補(bǔ)充2：

任務(wù)實(shí)施三、試驗(yàn)操作序號(hào)步驟操作內(nèi)容1選器具超凈工作臺(tái)、恒溫恒濕培養(yǎng)箱、無(wú)菌移液管、無(wú)菌培養(yǎng)皿等2取試劑胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、對(duì)照培養(yǎng)基3接種分別接種不大于____cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌的菌液至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備____個(gè)平板，混勻，凝固；分別接種不大于____cfu的白色念珠菌、黑曲霉的菌液至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備____個(gè)平板，混勻，凝固；用對(duì)應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述操作4培養(yǎng)和計(jì)數(shù)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌置____℃培養(yǎng)不超過(guò)____天，計(jì)數(shù)；白色念珠菌、黑曲霉置____℃培養(yǎng)不超過(guò)____天，計(jì)數(shù)5結(jié)果判斷若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對(duì)照培養(yǎng)基上菌落平均數(shù)的____%，且菌落形態(tài)大小與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致，判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定培養(yǎng)基適用性檢查用菌液制備：詳見(jiàn)本項(xiàng)目任務(wù)一中“培養(yǎng)基適用性檢查用菌液

制備”培養(yǎng)基適用性檢查任務(wù)實(shí)施三、試驗(yàn)操作序號(hào)步驟操作內(nèi)容1選器具超凈工作臺(tái)、恒溫恒濕培養(yǎng)箱、無(wú)菌移液管等2取試劑胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、對(duì)照培養(yǎng)基3供試品接種取包裝完整的供試品至少____份，直接接種試驗(yàn)菌，或取適量供試品分別轉(zhuǎn)移至____個(gè)適宜的無(wú)菌容器中，若試驗(yàn)菌株數(shù)超過(guò)____株，應(yīng)增加相應(yīng)的供試品份數(shù)，每一容器接種一種試驗(yàn)菌，1g或1mL供試品中接菌量為_(kāi)___cfu，接種菌液的體積不得超過(guò)供試品體積的____%，充分混合，使供試品中的試驗(yàn)菌均勻分布，然后置____℃避光貯存。4存活菌數(shù)測(cè)定根據(jù)產(chǎn)品類(lèi)型，分別從上述每個(gè)容器中取供試品____，測(cè)定每份供試品中所含的菌數(shù)。存活菌數(shù)測(cè)定方法及方法適用性試驗(yàn)照“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法（通則1105）”進(jìn)行。根據(jù)存活菌數(shù)測(cè)定結(jié)果，計(jì)算____供試品各試驗(yàn)菌所加的菌數(shù)及各間隔時(shí)間的菌數(shù)，并換算成lg值。5結(jié)果判斷見(jiàn)供試品抑菌效力評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)抑菌效力測(cè)定用菌液制備：詳見(jiàn)本項(xiàng)目任務(wù)一中“抑菌效力測(cè)定用菌液制備”抑菌效力測(cè)定任務(wù)實(shí)施

減少的lg值

6h24h7d14d28d細(xì)菌A23——NRB—13—NI真菌A——2—NIB———1NI注射劑、眼用制劑、用于子宮和乳腺的制劑抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)注：NR表示試驗(yàn)菌未恢復(fù)生長(zhǎng)。NI表示未增加，是指對(duì)前一個(gè)測(cè)定時(shí)間，試驗(yàn)菌增加的數(shù)量不超過(guò)0.5lg。表中“A”是指應(yīng)達(dá)到的抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)，特殊情況下，如抑菌劑可能增加不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，則至少應(yīng)達(dá)到“B”的抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)。表中的“減少的lg值”是指各間隔時(shí)間測(cè)定的菌數(shù)lg值與lmL（g）供試品中接種的菌數(shù)lg值的相差值。任務(wù)實(shí)施

減少的lg值

2d7d14d28d細(xì)菌A23—NIB——3NI真菌A——2NIB——1NI耳用制劑、鼻用制劑、皮膚給藥制劑、吸入制劑抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)注：NI表示未增加，是指對(duì)前一個(gè)測(cè)定時(shí)間，試驗(yàn)菌增加的數(shù)量不超過(guò)0.5lg。表中“A”是指應(yīng)達(dá)到的抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)，特殊情況下，如抑菌劑可能增加不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，則至少應(yīng)達(dá)到“B”的抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)。表中的“減少的lg值”是指各間隔時(shí)間測(cè)定的菌數(shù)lg值與lmL（g）供試品中接種的菌數(shù)lg值的相差值。任務(wù)實(shí)施口服制劑、口腔黏膜制劑、直腸給藥制劑的抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)注：NI表示未增加，是指對(duì)前一個(gè)測(cè)定時(shí)間，試驗(yàn)菌增加的數(shù)量不超過(guò)0.5lg。表中的“減少的lg值”是指各間隔時(shí)間測(cè)定的菌數(shù)lg值與lmL（g）供試品中接種的菌數(shù)lg值的相差值。

減少的lg值

14d28d細(xì)菌3NI真菌1NI任務(wù)測(cè)評(píng)序號(hào)考核內(nèi)容考核標(biāo)準(zhǔn)配分得分1培養(yǎng)基適用性檢查接種操作規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)5

培養(yǎng)溫度、天數(shù)正確5

計(jì)數(shù)方法、結(jié)果正確5

正確判斷培養(yǎng)基適用性檢查是否合格10

2供試品接種供試品選擇正確10

接種操作規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)5

移液器使用正確5

供試品接種后貯存條件正確5

3存活菌數(shù)測(cè)定時(shí)間間隔正確5

無(wú)菌操作規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)5

移液器使用正確5

存活菌數(shù)測(cè)定正確10

計(jì)算正確5

4結(jié)果判斷能正確判斷供試品是否合格10

5培養(yǎng)物處理、無(wú)菌室清潔能正確完成培養(yǎng)物處理5

能正確完成無(wú)菌室清潔5

合計(jì)100《藥品微生物檢驗(yàn)技術(shù)》謝謝《藥品微生物檢驗(yàn)技術(shù)》模塊三藥品有效性檢查項(xiàng)目二抗生素效價(jià)測(cè)定

任務(wù)一慶大霉素溶液的制備

任務(wù)二雙碟的制備與加藥培養(yǎng)

任務(wù)三數(shù)據(jù)處理與結(jié)果判斷

目錄項(xiàng)目二抗生素效價(jià)測(cè)定任務(wù)一慶大霉素溶液的制備

任務(wù)引入請(qǐng)思考抗生素標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)單位是明確標(biāo)明的。配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液時(shí)稱量的標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量無(wú)法預(yù)先確定，如何根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的稱量數(shù)量計(jì)算出緩沖液的用量，配制出準(zhǔn)確濃度的抗生素標(biāo)準(zhǔn)品溶液？某制藥企業(yè)生產(chǎn)了一批硫酸慶大霉素片，為了知道這批硫酸慶大霉素片的抗菌效力，需要進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。用什么方法測(cè)定硫酸慶大霉素片的效價(jià)？效價(jià)測(cè)定對(duì)環(huán)境、操作員有什么要求？

任務(wù)分析本任務(wù)以慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品與供試品母液的配制為例，介紹抗生素效價(jià)測(cè)定緩沖液、供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制，工作內(nèi)容及要求見(jiàn)下表。工作內(nèi)容工作要求關(guān)鍵點(diǎn)緩沖液的配制選擇正確緩沖液、配制正確計(jì)算、稱量、調(diào)劑pH、分裝、滅菌供試品溶液的配制稱量準(zhǔn)確、稀釋操作準(zhǔn)確稱量、溶解、定容、稀釋標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備方法正確、完成制備稱量、溶解、定容、稀釋相關(guān)知識(shí)-緩沖液的配制慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品所需緩沖液為pH值為7.8的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液，其成分與配制方法如下：

取磷酸氫二鉀5.59ｇ與磷酸二氫鉀0.41ｇ，加水使成1000ｍＬ，濾過(guò)，在115℃滅菌30min。緩沖液的配制流程計(jì)算用量稱量溶解分裝滅菌磷酸氫二鉀磷酸二氫鉀任務(wù)實(shí)施一、制訂工作計(jì)劃序號(hào)工作內(nèi)容完成時(shí)間成員負(fù)責(zé)人1緩沖液的配制

2供試品溶液的配制

3標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

根據(jù)任務(wù)要求，制定合理工作進(jìn)度計(jì)劃，并根據(jù)小組成員的特點(diǎn)進(jìn)行分工。任務(wù)實(shí)施二、試驗(yàn)前準(zhǔn)備設(shè)備、器材、試劑規(guī)格數(shù)量用途高壓蒸汽滅菌器

滅菌溶液電子天平、無(wú)菌藥匙

稱量試劑無(wú)菌燒杯、無(wú)菌玻璃棒、無(wú)菌研缽、無(wú)菌容量瓶、無(wú)菌移液管

溶解、稀釋溶液無(wú)菌具塞容量瓶

分裝溶液磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、蒸餾水

配制緩沖液慶大霉素片、慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品、無(wú)菌水

配制供試品、標(biāo)準(zhǔn)品無(wú)菌室、超凈工作臺(tái)、酒精燈、75%酒精

操作場(chǎng)所冰箱

保藏溶液補(bǔ)充1：

補(bǔ)充2：

任務(wù)實(shí)施三、試驗(yàn)操作序號(hào)步驟操作內(nèi)容1選器具高壓蒸汽滅菌器、電子天平、1000mL燒杯、100mL無(wú)菌燒杯、無(wú)菌玻璃棒、無(wú)菌藥匙、容量瓶2取試劑取磷酸氫二鉀一瓶、磷酸二氫鉀一瓶、蒸餾水3稱量電子天平稱量磷酸氫二鉀___g與磷酸二氫鉀____g于小燒杯中4溶解加水溶解，轉(zhuǎn)移至大燒杯中，潤(rùn)洗___遍，加水使至____mL5分裝將上述配制好的緩沖液分裝至____只___mL容量瓶中，加塞，包扎6滅菌將包扎好的緩沖液放入高壓蒸汽滅菌器中，___℃,滅菌___min7保藏取出滅菌好的緩沖液，放至于_____保藏待用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液的制備任務(wù)實(shí)施三、試驗(yàn)操作記錄供試品與標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制過(guò)程序號(hào)步驟操作內(nèi)容1選器具電子天平、100mL無(wú)菌燒杯、無(wú)菌玻棒、無(wú)菌研缽、100mL無(wú)菌容量瓶、無(wú)菌移液管、無(wú)菌藥匙2選藥品慶大霉素片、慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品、無(wú)菌水3稱量慶大霉素取___片慶大霉素片，稱量每片的重量，計(jì)算平均片重為_(kāi)_____將_____片藥片放入無(wú)菌研缽中進(jìn)行研磨，研細(xì)稱取_____g藥粉于____mL無(wú)菌燒杯中4緩沖液用量的計(jì)算慶大霉素片每mg的單位為_(kāi)_______U，根據(jù)稱取的慶大霉素粉末的量，緩沖液應(yīng)為_(kāi)_____mL5初溶導(dǎo)入容量瓶加入移液管取____mL無(wú)菌水至燒杯中，用無(wú)菌玻璃棒攪拌使藥粉溶解，引流轉(zhuǎn)移至____mL容量瓶中6洗燒杯合并洗液用定量的無(wú)菌水潤(rùn)洗燒杯____次，將潤(rùn)洗液轉(zhuǎn)移至容量瓶中與初溶液合并7定容用上述計(jì)算的緩沖液的量，減去初溶與潤(rùn)洗燒杯的量，得出應(yīng)加入的緩沖液的余量，將余量加入容量瓶即得8保藏將配置好的母液放于______中備用任務(wù)測(cè)評(píng)序號(hào)考核內(nèi)容考核標(biāo)準(zhǔn)配分得分1無(wú)菌磷酸鹽緩沖液的制備正確計(jì)算并稱量試劑10

正確配制緩沖液10

能完成緩沖液的滅菌操作5

正確保藏?zé)o菌緩沖液5

2供試品溶液的配制正確計(jì)算并稱量藥品10

正確操作藥品的溶解與定容10

正確保藏供試品母液5

3標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備正確計(jì)算并稱量標(biāo)準(zhǔn)品10

正確操作標(biāo)準(zhǔn)品的溶解與定容10

正確保藏標(biāo)準(zhǔn)品母液5

4清場(chǎng)能正確完成實(shí)訓(xùn)室的清場(chǎng)10

能正確完成無(wú)菌室的清潔10

合計(jì)100項(xiàng)目二抗生素效價(jià)測(cè)定任務(wù)二雙碟的制備與加藥培養(yǎng)

任務(wù)引入請(qǐng)思考根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同，抗生素微生物檢定法中的管碟法分為二劑量法和三劑量法。其中，二劑量法測(cè)定抗生素效價(jià)的流程包括哪幾步呢？制備雙碟時(shí)，不同的抗生素使用的試驗(yàn)菌及其培養(yǎng)基又是如何確定的呢？管碟法二劑量法三劑量法測(cè)定抗生素效價(jià)的流程？任務(wù)分析

根據(jù)慶大霉素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下規(guī)定的檢測(cè)方法，本任務(wù)參照《中國(guó)藥典》2020年版四部通則中抗生素微生物檢定試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，選擇慶大霉素對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)菌與培養(yǎng)基配方，進(jìn)行雙碟與不銹鋼小管的檢測(cè)與清洗、培養(yǎng)基的制備與保藏、試驗(yàn)菌的培養(yǎng)及菌懸液的配制、雙碟的制備、不銹鋼小管的放置等試驗(yàn)。具體見(jiàn)下表：相關(guān)知識(shí)-雙碟、不銹鋼小管的檢測(cè)與清洗1.雙碟水平的檢測(cè)可將雙碟放置在水平臺(tái)上，下墊一層白紙，加入3mL水，再滴加藍(lán)墨水，根據(jù)藍(lán)色是否深淺一致來(lái)判斷雙碟底面是否平整。2.不銹鋼小管的檢測(cè)用游標(biāo)卡尺測(cè)量不銹鋼小管的高度、內(nèi)徑和外徑，要求其內(nèi)徑為6.0mm+0.1mm，高度10.0mm+0.1mm，外徑為7.8mm+0.1mm3.雙碟與不銹鋼小管的清洗在清洗時(shí)要注意多用流水沖洗，160℃干熱滅菌2h后備用。相關(guān)知識(shí)-無(wú)菌培養(yǎng)基的配制無(wú)菌培養(yǎng)基的配制流程計(jì)算用量稱量溶解調(diào)節(jié)pH值分裝滅菌慶大霉素微生物檢定所用培養(yǎng)基為pH值為7.8-8.0的Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基，其配制方法如下：混合胨(5g)、牛肉浸出粉(3g)、磷酸氫二鉀(3g)、水(1000mL)，調(diào)節(jié)pH值使比最終的pH值略高0.2-0.4，加入瓊脂(15-20g),加熱溶化后過(guò)濾，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.8-8.0，在115℃?滅菌30min。相關(guān)知識(shí)含菌培養(yǎng)基的制備可慶大霉素微生物檢定對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)菌為短小芽孢桿菌，其菌懸液制備方法如下：取短小芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于盛有營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在３５?３７?培養(yǎng)７天，用革蘭染色法涂片鏡檢，應(yīng)有芽孢８５?以上。用滅菌水將芽孢洗下，在６５?加熱３０ｍ?ｎ，搖勻，備用雙碟的制備加底層加菌層加不銹鋼小管相關(guān)知識(shí)抗生素溶液滴加及雙碟培養(yǎng)稀釋抗生素標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液滴加抗生素溶液培

養(yǎng)任務(wù)實(shí)施一、制訂工作計(jì)劃序號(hào)工作內(nèi)容完成時(shí)間成員負(fù)責(zé)人1雙碟、不銹鋼小管的檢測(cè)與清洗

2無(wú)菌培養(yǎng)基的制備與保藏

3含菌培養(yǎng)基的制備

4雙碟的制備5抗生素溶液滴加及雙碟培養(yǎng)根據(jù)任務(wù)要求，制定合理工作進(jìn)度計(jì)劃，并根據(jù)小組成員的特點(diǎn)進(jìn)行分工。任務(wù)實(shí)施二、試驗(yàn)前準(zhǔn)備任務(wù)實(shí)施三、試驗(yàn)操作按照表3-2-10記錄雙碟、不銹鋼小管的檢測(cè)與清洗過(guò)程。任務(wù)實(shí)施三、試驗(yàn)操作按照表3-2-11記錄無(wú)菌培養(yǎng)基的制備與保藏過(guò)程。任務(wù)實(shí)施三、試驗(yàn)操作按照表3-2-12記錄含菌培養(yǎng)基的制備過(guò)程。任務(wù)實(shí)施三、試驗(yàn)操作按照表3-2-13記錄雙碟的制備過(guò)程。任務(wù)實(shí)施三、試驗(yàn)操作按照表3-2-14記錄抗生素溶液滴加及雙碟培養(yǎng)過(guò)程。任務(wù)測(cè)評(píng)項(xiàng)目二抗生素效價(jià)測(cè)定任務(wù)三數(shù)據(jù)處理與結(jié)果判斷

任務(wù)引入抗生素微生物檢定法中，由于各種原因，可能出現(xiàn)某個(gè)數(shù)據(jù)缺失或個(gè)別數(shù)據(jù)特別大、特別小的現(xiàn)象，在一定數(shù)量范圍內(nèi)，可以根據(jù)其他數(shù)據(jù)，通過(guò)計(jì)算補(bǔ)齊或者用計(jì)算出的數(shù)據(jù)替代特別大或特別小的數(shù)據(jù)。如果由于操作不規(guī)范或其他原因，測(cè)出數(shù)據(jù)的可信限率超過(guò)規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明誤差過(guò)大，這種情況下測(cè)出的數(shù)據(jù)能使用嗎？是否需要重新試驗(yàn)?zāi)?？誤差過(guò)大？重新試驗(yàn)？請(qǐng)思考任務(wù)分析本任務(wù)的工作內(nèi)容及要求見(jiàn)下表：相關(guān)知識(shí)1.將培養(yǎng)好的雙碟取出，打開(kāi)陶瓦蓋，換上玻璃蓋，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。2.或者將換好玻璃蓋的雙碟４個(gè)放入掃描儀相應(yīng)的位置，推入抽屜掃描測(cè)得抑菌圈直徑，見(jiàn)右圖。將測(cè)出的數(shù)據(jù)記錄于下表中。一、抑菌圈直徑的測(cè)量與記錄使用掃描儀進(jìn)行抑菌圈的測(cè)量相關(guān)知識(shí)

將測(cè)量完抑菌圈的雙碟在高壓蒸汽滅菌器中滅菌后，除去培養(yǎng)物，將培養(yǎng)皿清洗、干燥后歸位。二、培養(yǎng)物的處理三、數(shù)據(jù)處理特大、特小值的剔除：在同一劑量組內(nèi)的各個(gè)反應(yīng)值中，如果出現(xiàn)個(gè)別特大或特小的反應(yīng)值，應(yīng)進(jìn)行異常值檢驗(yàn)，以確定其是否應(yīng)被剔除。檢驗(yàn)異常值的方法很多，本任務(wù)中建議使用狄克森（Dixon)檢驗(yàn)法。樣本量（ｍ）當(dāng)可疑反應(yīng)值是最小值（ｙ１）當(dāng)可疑反應(yīng)值是最大值（ｙｍ）3-78-1011-13狄克森檢驗(yàn)法異常值的J１、J2和J3計(jì)算公式相關(guān)知識(shí)三、數(shù)據(jù)處理特大、特小值的剔除：如果計(jì)算得到的J１、J2或J3值超出表3-2-21中給出的標(biāo)準(zhǔn)值，則判斷為異常值，可考慮剔除。當(dāng)同一組中的觀察反應(yīng)值數(shù)目大于13個(gè)時(shí)，本方法不適用。相關(guān)知識(shí)三、數(shù)據(jù)處理缺項(xiàng)補(bǔ)足：反應(yīng)值被剔除或因故反應(yīng)值缺失造成缺項(xiàng)，致各劑量組的反應(yīng)個(gè)數(shù)ｍ不相等時(shí)，應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)類(lèi)型補(bǔ)足缺項(xiàng)ｙ，使各劑量組ｍ相等