畢赤酵母中甜菊醇異源合成技術(shù)的開發(fā)與優(yōu)化：從理論到實踐

一、引言1.1研究背景與意義在合成生物學與代謝工程領(lǐng)域，微生物底盤細胞的開發(fā)與應(yīng)用是實現(xiàn)各類生物活性物質(zhì)高效生產(chǎn)的關(guān)鍵。畢赤酵母（Pichiapastoris）作為一種極具潛力的微生物底盤，近年來在異源合成領(lǐng)域展現(xiàn)出重要地位。它屬于甲醇營養(yǎng)型酵母，能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源。畢赤酵母表達系統(tǒng)具有眾多優(yōu)勢，其擁有目前最強且調(diào)控機理最嚴格的啟動子之一——醇氧化酶基因AOX1啟動子，這使得外源基因的表達調(diào)控更加精準和高效，例如在生產(chǎn)重組蛋白時，可通過甲醇誘導實現(xiàn)對目標蛋白表達的精確控制。該系統(tǒng)表達水平高，既能實現(xiàn)胞內(nèi)表達，又可進行分泌型表達，能滿足不同研究和生產(chǎn)的需求；發(fā)酵工藝成熟且易于放大，已具備大規(guī)模工業(yè)化高密度生產(chǎn)的能力，培養(yǎng)成本低，產(chǎn)物易分離，所用發(fā)酵培養(yǎng)基廉價且不含蛋白，有利于下游產(chǎn)品的分離純化，降低了生產(chǎn)成本；外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定，整合到畢赤酵母染色體上后，能隨染色體復制而穩(wěn)定存在，不易丟失；作為真核表達系統(tǒng)，畢赤酵母還具有真核生物的亞細胞結(jié)構(gòu)，能夠?qū)Ρ磉_的蛋白進行糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工，使表達出的蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白，具有更高的生物活性。諸多研究成功利用畢赤酵母表達系統(tǒng)實現(xiàn)了多種復雜蛋白和生物活性物質(zhì)的異源合成，如南京工業(yè)大學的研究團隊通過代謝工程改造巴斯德畢赤酵母成功實現(xiàn)了左旋蝦青素的異源合成，在搖瓶發(fā)酵和5L生物反應(yīng)器中均取得了較高產(chǎn)量。甜菊醇（Steviol）是一種從甜葉菊中提取的天然甜味劑，具有極高的應(yīng)用價值。其甜度約為蔗糖的200-400倍，而卡路里含量卻很低，不會對血糖水平產(chǎn)生明顯影響。隨著人們健康意識的提高以及對低糖、低熱量食品需求的增加，甜菊醇作為一種天然、健康的甜味劑，在食品、飲料、保健品等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。在食品領(lǐng)域，它可替代傳統(tǒng)蔗糖用于各類烘焙食品、乳制品等，滿足消費者對健康食品的需求；在飲料行業(yè)，被大量應(yīng)用于果汁、茶飲料、碳酸飲料等，為消費者提供低熱量的甜味選擇。甜菊醇還具有一定的藥用價值，研究表明其具有抗高血壓、降低血糖、抑制癌細胞等作用。在全球范圍內(nèi)，甜菊醇市場規(guī)模呈現(xiàn)出穩(wěn)定增長的趨勢，據(jù)統(tǒng)計，2019年全球甜菊醇市場規(guī)模達到了一定水平，預計到2025年將進一步增長，這表明甜菊醇市場正逐漸成為廣泛應(yīng)用的食品添加劑。然而，目前甜菊醇的主要生產(chǎn)方式是從甜葉菊中提取，這種方法存在諸多局限性。一方面，甜葉菊的種植受地域、氣候等自然條件限制，產(chǎn)量不穩(wěn)定，難以滿足市場日益增長的需求；另一方面，傳統(tǒng)提取工藝復雜，成本較高，且提取過程中可能會引入雜質(zhì)，影響甜菊醇的質(zhì)量和純度。開發(fā)新的甜菊醇生產(chǎn)技術(shù)迫在眉睫。利用畢赤酵母進行甜菊醇的異源合成具有重要意義。畢赤酵母生長迅速、易于培養(yǎng)，能夠在簡單的培養(yǎng)基中快速繁殖，可實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，從而有效解決甜菊醇產(chǎn)量不足的問題；通過對畢赤酵母進行基因工程改造和代謝途徑優(yōu)化，可以精確調(diào)控甜菊醇的合成過程，提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品純度，降低生產(chǎn)成本；利用畢赤酵母異源合成甜菊醇還可以減少對甜葉菊種植的依賴，降低對環(huán)境的影響，符合可持續(xù)發(fā)展的理念。本研究致力于開發(fā)和優(yōu)化畢赤酵母中甜菊醇的異源合成技術(shù)，旨在為甜菊醇的高效、可持續(xù)生產(chǎn)提供新的方法和策略，具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。1.2畢赤酵母表達系統(tǒng)概述畢赤酵母表達系統(tǒng)是一種在生物技術(shù)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的真核表達系統(tǒng)，它具有諸多獨特的特點和顯著優(yōu)勢，在蛋白表達和小分子化學品合成等多個領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。從細胞特性來看，畢赤酵母屬于甲醇營養(yǎng)型酵母，能夠以甲醇作為唯一碳源和能源進行生長代謝。在甲醇的誘導下，畢赤酵母會啟動一系列與甲醇代謝相關(guān)的基因表達，其中最具代表性的是醇氧化酶基因（AOX1）。AOX1啟動子是目前已知最強且調(diào)控機理最嚴格的啟動子之一，這一特性使得畢赤酵母表達系統(tǒng)在調(diào)控外源基因表達方面具有高度的精準性和有效性。當以甲醇為唯一碳源時，AOX1啟動子可被強烈誘導，驅(qū)動外源基因高效表達；而在其他碳源（如甘油、葡萄糖）存在時，AOX1啟動子則受到抑制，外源基因的表達被嚴格控制，這種精確的調(diào)控機制為外源蛋白的生產(chǎn)提供了有力保障。畢赤酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)勢十分突出。在表達水平方面，它表現(xiàn)卓越，既能實現(xiàn)胞內(nèi)表達，也可進行分泌型表達。胞內(nèi)表達適合對蛋白結(jié)構(gòu)完整性要求較高、不需要分泌到胞外環(huán)境的蛋白生產(chǎn)；而分泌型表達則便于蛋白的分離和純化，因為分泌到培養(yǎng)基中的蛋白更容易與細胞內(nèi)其他成分分離。該系統(tǒng)表達水平高，許多研究都成功實現(xiàn)了高水平的外源蛋白表達，如在某些研究中，利用畢赤酵母表達特定的酶，其表達量可達每升數(shù)克甚至更高。發(fā)酵工藝成熟且易于放大是其另一大優(yōu)勢，畢赤酵母已具備大規(guī)模工業(yè)化高密度生產(chǎn)的能力。在實驗室規(guī)模的研究基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化發(fā)酵條件，如溫度、pH值、溶氧、碳氮源比例等，可以順利將發(fā)酵過程從搖瓶培養(yǎng)放大到生物反應(yīng)器中進行大規(guī)模生產(chǎn)。這一特性使得畢赤酵母在工業(yè)生產(chǎn)中具有極大的應(yīng)用潛力，能夠滿足市場對大量目標蛋白或小分子化學品的需求。在成本方面，畢赤酵母具有明顯的優(yōu)勢。其培養(yǎng)成本低，所用發(fā)酵培養(yǎng)基成分簡單且廉價，主要包含一些無機鹽、碳源和氮源，并且培養(yǎng)基中不含蛋白，這有利于下游產(chǎn)品的分離純化，降低了生產(chǎn)成本。例如，在生產(chǎn)過程中，無需復雜的分離步驟去除培養(yǎng)基中的蛋白雜質(zhì)，減少了生產(chǎn)環(huán)節(jié)和成本支出。此外，畢赤酵母的外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定，整合到畢赤酵母染色體上的外源基因，會隨著染色體的復制而穩(wěn)定存在，不易丟失，這保證了在多次傳代培養(yǎng)過程中，外源基因的表達穩(wěn)定性，有利于長期穩(wěn)定的生產(chǎn)。作為真核表達系統(tǒng)，畢赤酵母具有真核生物的亞細胞結(jié)構(gòu)，這使得它能夠?qū)Ρ磉_的蛋白進行多種翻譯后修飾加工，如糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等。這些修飾對于許多蛋白的正確折疊、穩(wěn)定性和生物活性至關(guān)重要。例如，糖基化修飾可以影響蛋白的溶解度、免疫原性和半衰期，使表達出的蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白，具有更高的生物活性。在一些藥用蛋白的生產(chǎn)中，畢赤酵母的這種翻譯后修飾能力能夠確保蛋白的質(zhì)量和療效，使其更適合臨床應(yīng)用。畢赤酵母表達系統(tǒng)的應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛。在蛋白表達領(lǐng)域，它被用于生產(chǎn)各種重組蛋白，包括藥用蛋白、工業(yè)酶、抗體等。在醫(yī)藥領(lǐng)域，許多重要的藥用蛋白如胰島素、生長激素、干擾素等都可以利用畢赤酵母進行高效表達，為藥物研發(fā)和生產(chǎn)提供了新的途徑。在工業(yè)酶生產(chǎn)中，畢赤酵母可用于表達多種酶類，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等，這些酶在食品加工、紡織、洗滌劑等行業(yè)具有廣泛應(yīng)用。在小分子化學品合成方面，畢赤酵母也展現(xiàn)出巨大的潛力。通過對畢赤酵母的代謝途徑進行改造和優(yōu)化，可以實現(xiàn)多種小分子化學品的異源合成，如前文提到的南京工業(yè)大學團隊利用畢赤酵母成功合成左旋蝦青素，以及一些研究通過畢赤酵母合成萜類化合物、有機酸等。這些小分子化學品在食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域都具有重要的應(yīng)用價值。1.3甜菊醇的研究現(xiàn)狀甜菊醇，化學名為(14-alpha)-13-Hydroxykaur-16-en-18-oicacid，其分子式為C_{20}H_{30}O_{3}，分子量為318.4504。從結(jié)構(gòu)上看，甜菊醇屬于貝殼杉烯型四環(huán)二萜類化合物，具有獨特的四環(huán)骨架結(jié)構(gòu)，包含四個環(huán)（A、B、C、D環(huán)），在13位上連接有一個羥基，18位為羧基，這種特殊的化學結(jié)構(gòu)賦予了甜菊醇一系列獨特的物理和化學性質(zhì)。其性狀為純白色結(jié)晶粉末，相對密度約為1.17g/cm3，熔點達到215°C，可溶于甲醇、乙醇、DMSO等有機溶劑，在水中的溶解性相對較差。在生物活性方面，甜菊醇展現(xiàn)出多種有益的功效。研究表明，甜菊醇具有抗高血壓的作用，它能夠通過調(diào)節(jié)血管緊張素系統(tǒng)，抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）的活性，從而降低血管緊張素Ⅱ的生成，使血管舒張，血壓下降。許多動物實驗和臨床研究都證實了這一作用，如在對高血壓大鼠模型的實驗中，給予甜菊醇干預后，大鼠的血壓得到了顯著降低。甜菊醇還具有降低血糖的功效，它可以通過提高胰島素的敏感性，促進葡萄糖的攝取和利用，降低血糖水平。在一些糖尿病小鼠模型實驗中，甜菊醇能夠改善小鼠的糖耐量，降低血糖峰值。甜菊醇還被發(fā)現(xiàn)具有抑制癌細胞的作用，它可以誘導癌細胞凋亡，抑制癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究表明，甜菊醇能夠影響癌細胞的信號傳導通路，如抑制PI3K/Akt信號通路，從而發(fā)揮抗癌作用。由于其獨特的生物活性和低熱量、高甜度的特點，甜菊醇在多個領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。在食品領(lǐng)域，甜菊醇作為一種天然甜味劑，被大量應(yīng)用于各類食品的生產(chǎn)中。在飲料行業(yè)，它可用于果汁、茶飲料、碳酸飲料等，為消費者提供低熱量的甜味選擇，滿足了人們對健康飲品的需求；在烘焙食品中，甜菊醇可替代傳統(tǒng)蔗糖，用于制作面包、蛋糕、餅干等，既能保持食品的甜味，又能降低熱量攝入，符合健康飲食的趨勢；在乳制品中，如酸奶、牛奶等，添加甜菊醇可以增加甜味，同時減少糖分的使用，更適合糖尿病患者和關(guān)注健康的消費者。在醫(yī)藥領(lǐng)域，甜菊醇的藥用價值也逐漸受到重視。除了上述提到的抗高血壓、降低血糖和抑制癌細胞的作用外，甜菊醇還具有抗炎、抗氧化等功效，可用于開發(fā)治療相關(guān)疾病的藥物。在保健品領(lǐng)域，甜菊醇常被用于制作減肥、降血糖、降血壓等功能性保健品，幫助人們維持健康的身體狀態(tài)。目前，甜菊醇的主要生產(chǎn)方式是從甜葉菊中提取。這種傳統(tǒng)的提取方法存在諸多不足之處。從種植環(huán)節(jié)來看，甜葉菊的種植對地域和氣候條件要求較為苛刻。它適宜在溫暖、濕潤且陽光充足的環(huán)境中生長，對土壤的酸堿度、肥力等也有一定要求，這使得甜葉菊的種植范圍受到限制，主要集中在一些特定的地區(qū)，如中國的江蘇、安徽等地，以及巴西、巴拉圭等國家。氣候條件的變化，如干旱、洪澇、極端溫度等，會對甜葉菊的生長和產(chǎn)量產(chǎn)生顯著影響，導致甜葉菊的產(chǎn)量不穩(wěn)定，難以滿足市場日益增長的需求。從提取工藝角度分析，傳統(tǒng)的提取工藝較為復雜，通常需要經(jīng)過采摘、晾曬、粉碎、浸提、分離、純化等多個步驟。在浸提過程中，需要使用大量的溶劑，如乙醇、水等，且提取效率較低，導致生產(chǎn)成本較高。提取過程中可能會引入雜質(zhì)，如植物纖維、色素、其他次生代謝產(chǎn)物等，這些雜質(zhì)會影響甜菊醇的質(zhì)量和純度，增加了后續(xù)分離純化的難度和成本。為了獲得高純度的甜菊醇，往往需要采用多種分離技術(shù)，如柱層析、結(jié)晶等，進一步增加了生產(chǎn)的復雜性和成本。因此，開發(fā)新的甜菊醇生產(chǎn)技術(shù)，如利用畢赤酵母進行異源合成，具有重要的現(xiàn)實意義和應(yīng)用價值。二、畢赤酵母中甜菊醇異源合成技術(shù)的開發(fā)2.1相關(guān)基因與代謝途徑解析2.1.1甜菊醇生物合成途徑關(guān)鍵基因甜菊醇的生物合成是一個復雜且精細的過程，涉及一系列酶催化的反應(yīng)，這些反應(yīng)在植物細胞內(nèi)有條不紊地進行，共同構(gòu)建出甜菊醇獨特的化學結(jié)構(gòu)。其生物合成途徑起始于細胞質(zhì)中的甲羥戊酸（MVA）途徑和質(zhì)體中的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）途徑，這兩條途徑是萜類化合物合成的基礎(chǔ)，它們負責生成重要的前體物質(zhì)——異戊烯基焦磷酸（IPP）及其異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。在酶的作用下，IPP和DMAPP逐步縮合，最終形成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP），GGPP作為關(guān)鍵的前體，是后續(xù)甜菊醇合成的重要起始物質(zhì)。從GGPP開始，甜菊醇的合成進入了關(guān)鍵的四環(huán)二萜合成階段。在這個階段，古巴焦磷酸合酶（CPPS）首先發(fā)揮作用，它催化GGPP環(huán)化形成古巴焦磷酸（CPP），CPP是合成四環(huán)二萜骨架的重要中間體。緊接著，貝殼杉烯合成酶（KS）以CPP為底物，通過一系列復雜的催化反應(yīng)，將CPP轉(zhuǎn)化為貝殼杉烯，貝殼杉烯的形成標志著甜菊醇四環(huán)二萜骨架的初步構(gòu)建。貝殼杉烯合成酶（KS）在甜菊醇生物合成中起著不可或缺的作用，它是四環(huán)二萜骨架合成的關(guān)鍵酶，其基因表達水平和酶活性直接影響著甜菊醇的合成效率。研究表明，通過基因工程手段提高KS基因的表達量，能夠顯著增加貝殼杉烯的產(chǎn)量，進而促進甜菊醇的合成。例如，在某些植物基因工程研究中，將KS基因?qū)肽繕酥参锊⑹蛊溥^表達，結(jié)果顯示甜菊醇的前體物質(zhì)貝殼杉烯的含量大幅提高，為后續(xù)甜菊醇的合成提供了更充足的原料。貝殼杉烯形成后，需要經(jīng)過一系列氧化反應(yīng)才能逐步轉(zhuǎn)化為甜菊醇。貝殼杉烯氧化酶（KO）是這一過程中的關(guān)鍵酶，它屬于細胞色素P450單加氧酶家族，能夠催化貝殼杉烯發(fā)生三步連續(xù)的氧化反應(yīng)，依次將貝殼杉烯轉(zhuǎn)化為貝殼杉烯醇、貝殼杉烯醛和貝殼杉烯酸。這三步氧化反應(yīng)逐步改變了貝殼杉烯的化學結(jié)構(gòu)，使其向甜菊醇的結(jié)構(gòu)逐漸靠攏。貝殼杉烯酸在后續(xù)的反應(yīng)中，還會在其他酶的作用下進一步氧化和修飾，最終形成甜菊醇。貝殼杉烯氧化酶（KO）的催化活性和選擇性對甜菊醇的合成至關(guān)重要，它決定了氧化反應(yīng)的速率和產(chǎn)物的特異性。如果KO的活性受到抑制或其基因表達量降低，甜菊醇的合成將受到嚴重阻礙。例如，在一些基因沉默實驗中，通過抑制KO基因的表達，甜菊醇的產(chǎn)量顯著下降，這充分說明了KO在甜菊醇生物合成途徑中的關(guān)鍵地位。除了上述關(guān)鍵酶基因外，甜菊醇生物合成途徑中還涉及其他一些酶基因，它們共同協(xié)作，確保甜菊醇的合成能夠順利進行。這些酶基因的表達和調(diào)控相互關(guān)聯(lián)，形成了一個復雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同維持著甜菊醇生物合成的平衡和穩(wěn)定。例如，某些酶基因的表達可能受到上游調(diào)控因子的影響，而這些調(diào)控因子又可能與其他代謝途徑相互作用，從而影響整個甜菊醇生物合成途徑的效率和產(chǎn)量。對甜菊醇生物合成途徑關(guān)鍵基因的深入研究，有助于我們從分子層面理解甜菊醇的合成機制，為利用畢赤酵母進行甜菊醇的異源合成提供堅實的理論基礎(chǔ)。通過對這些關(guān)鍵基因的功能解析和調(diào)控研究，我們可以有針對性地對畢赤酵母進行基因工程改造，優(yōu)化甜菊醇的合成途徑，提高甜菊醇的產(chǎn)量和質(zhì)量。2.1.2畢赤酵母內(nèi)源代謝途徑對甜菊醇合成的影響畢赤酵母作為一種重要的微生物底盤細胞，其內(nèi)源代謝途徑十分復雜，這些代謝途徑相互交織，構(gòu)成了一個龐大而有序的代謝網(wǎng)絡(luò)。在這個網(wǎng)絡(luò)中，各個代謝途徑之間相互關(guān)聯(lián)、相互影響，共同維持著畢赤酵母細胞的正常生長和代謝活動。當利用畢赤酵母進行甜菊醇的異源合成時，畢赤酵母的內(nèi)源代謝途徑會對甜菊醇的合成產(chǎn)生多方面的影響，深入了解這些影響對于優(yōu)化甜菊醇的異源合成工藝具有重要意義。從碳代謝途徑來看，畢赤酵母主要通過糖酵解途徑（EMP）、磷酸戊糖途徑（PPP）和三羧酸循環(huán)（TCA）來實現(xiàn)對碳源的利用和能量的產(chǎn)生。在以葡萄糖為碳源的情況下，葡萄糖首先通過EMP途徑被分解為丙酮酸，丙酮酸一部分進入TCA循環(huán)，進一步氧化分解產(chǎn)生能量和中間代謝產(chǎn)物；另一部分則可能通過其他途徑進行代謝。PPP途徑則主要參與產(chǎn)生還原力（NADPH）和一些重要的中間代謝產(chǎn)物，如核糖-5-磷酸等。這些碳代謝途徑產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物，如丙酮酸、乙酰輔酶A等，是甜菊醇生物合成的重要前體物質(zhì)。乙酰輔酶A是MVA途徑和MEP途徑的起始物質(zhì)，它在萜類化合物的合成中起著關(guān)鍵作用。畢赤酵母內(nèi)源碳代謝途徑的流量分配會直接影響到這些前體物質(zhì)的供應(yīng)。如果碳代謝途徑的流量主要流向TCA循環(huán)，用于產(chǎn)生能量，那么用于甜菊醇合成的前體物質(zhì)供應(yīng)可能會不足，從而限制甜菊醇的合成。通過優(yōu)化碳源種類和濃度，以及調(diào)節(jié)相關(guān)代謝途徑的關(guān)鍵酶活性，可以改變碳代謝途徑的流量分配，提高前體物質(zhì)的供應(yīng)，促進甜菊醇的合成。在研究中發(fā)現(xiàn)，當適當提高葡萄糖的濃度，并調(diào)節(jié)EMP途徑中關(guān)鍵酶的活性時，丙酮酸和乙酰輔酶A的產(chǎn)量增加，進而促進了甜菊醇前體物質(zhì)的合成，提高了甜菊醇的產(chǎn)量。畢赤酵母的氮代謝途徑也會對甜菊醇合成產(chǎn)生影響。氮源是畢赤酵母生長和代謝所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，主要參與蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的合成。在氮代謝過程中，畢赤酵母通過吸收外界的氮源，如銨鹽、硝酸鹽等，將其轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)的氨基酸、核苷酸等物質(zhì)。氮源的種類和濃度會影響畢赤酵母的生長速率和代謝活性。如果氮源供應(yīng)不足，畢赤酵母的生長會受到抑制，從而影響到甜菊醇合成相關(guān)基因的表達和酶的活性。氮代謝途徑中的一些中間產(chǎn)物，如谷氨酰胺、谷氨酸等，也可能參與到甜菊醇合成途徑中某些酶的調(diào)節(jié)。適當控制氮源的種類和濃度，維持氮代謝的平衡，對于甜菊醇的合成至關(guān)重要。研究表明，在培養(yǎng)基中添加適量的有機氮源，如酵母提取物，可以提高畢赤酵母的生長速率和代謝活性，促進甜菊醇合成相關(guān)基因的表達，從而提高甜菊醇的產(chǎn)量。在脂質(zhì)代謝方面，畢赤酵母能夠合成和利用各種脂質(zhì)，包括脂肪酸、甘油三酯等。脂質(zhì)代謝途徑與甜菊醇合成途徑存在一定的關(guān)聯(lián)。脂肪酸的合成需要乙酰輔酶A作為前體物質(zhì)，這與甜菊醇合成的前體物質(zhì)來源相同。如果脂質(zhì)代謝途徑過于活躍，消耗了大量的乙酰輔酶A，那么用于甜菊醇合成的乙酰輔酶A就會減少，從而影響甜菊醇的合成。通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝途徑中的關(guān)鍵酶，如脂肪酸合成酶等，可以減少乙酰輔酶A的不必要消耗，提高其在甜菊醇合成途徑中的利用率。在一些研究中，通過基因工程手段敲低脂肪酸合成酶基因的表達，減少了脂肪酸的合成，使得更多的乙酰輔酶A能夠用于甜菊醇的合成，從而提高了甜菊醇的產(chǎn)量。畢赤酵母的內(nèi)源代謝途徑還會影響細胞內(nèi)的能量狀態(tài)和氧化還原平衡。甜菊醇的合成是一個耗能過程，需要充足的能量供應(yīng)。畢赤酵母通過細胞呼吸產(chǎn)生的ATP為甜菊醇合成提供能量。如果細胞內(nèi)的能量狀態(tài)不佳，ATP供應(yīng)不足，甜菊醇的合成將受到影響。細胞內(nèi)的氧化還原平衡也會影響甜菊醇合成相關(guān)酶的活性。例如，一些細胞色素P450酶在催化反應(yīng)時需要合適的氧化還原環(huán)境，細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)失衡可能會導致這些酶的活性降低，進而影響甜菊醇的合成。維持畢赤酵母細胞內(nèi)良好的能量狀態(tài)和氧化還原平衡，對于甜菊醇的異源合成至關(guān)重要?？梢酝ㄟ^優(yōu)化發(fā)酵條件，如控制溶氧、調(diào)節(jié)碳氮比等，來維持細胞內(nèi)的能量狀態(tài)和氧化還原平衡，促進甜菊醇的合成。在發(fā)酵過程中，適當提高溶氧水平，可以增加細胞的呼吸作用，產(chǎn)生更多的ATP，為甜菊醇合成提供充足的能量；同時，調(diào)節(jié)碳氮比可以維持細胞內(nèi)的氧化還原平衡，保證甜菊醇合成相關(guān)酶的活性，從而提高甜菊醇的產(chǎn)量。2.2基因工程技術(shù)在甜菊醇異源合成中的應(yīng)用2.2.1目的基因的克隆與表達載體構(gòu)建從植物中克隆甜菊醇合成關(guān)鍵基因是實現(xiàn)畢赤酵母中甜菊醇異源合成的首要步驟，這一過程涉及復雜的分子生物學技術(shù)和精細的操作流程。以甜葉菊為例，首先需要從新鮮的甜葉菊葉片中提取高質(zhì)量的總RNA。在提取過程中，通常采用改良的CTAB法或商業(yè)化的RNA提取試劑盒，這些方法能夠有效去除植物組織中的多糖、多酚等雜質(zhì)，確保提取的RNA完整性和純度。通過紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳對提取的RNA進行濃度和質(zhì)量檢測，保證其A260/A280比值在1.8-2.0之間，且在凝膠電泳中呈現(xiàn)清晰的28S和18SrRNA條帶，表明RNA無明顯降解。獲得高質(zhì)量的總RNA后，利用逆轉(zhuǎn)錄酶將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄過程中，選擇合適的引物至關(guān)重要，通常采用oligo(dT)引物或隨機引物，以確保能夠全面地逆轉(zhuǎn)錄各種mRNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中包含RNA模板、引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、緩沖液等成分，在適宜的溫度和時間條件下進行反應(yīng)，一般在42℃反應(yīng)60分鐘左右，然后通過70℃加熱10分鐘使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應(yīng)。以cDNA為模板，通過聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增甜菊醇合成關(guān)鍵基因，如古巴焦磷酸合酶（CPPS）基因、貝殼杉烯合成酶（KS）基因、貝殼杉烯氧化酶（KO）基因等。在設(shè)計PCR引物時，需根據(jù)目標基因的保守序列進行設(shè)計，并在引物兩端引入合適的限制性內(nèi)切酶位點，以便后續(xù)與表達載體進行連接。引物設(shè)計還需考慮引物的長度、GC含量、Tm值等因素，以確保引物的特異性和擴增效率。PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、dNTPs、緩沖液等，反應(yīng)條件通常為94℃預變性5分鐘，然后進行30-35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30秒、55-65℃退火30秒、72℃延伸1-2分鐘，最后72℃延伸10分鐘。擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，觀察是否出現(xiàn)預期大小的條帶。表達載體的構(gòu)建是實現(xiàn)目的基因在畢赤酵母中有效表達的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。常用的畢赤酵母表達載體包括pPIC9K、pPICZαA等，這些載體具有多種元件，以確保目的基因的穩(wěn)定表達和篩選。啟動子是表達載體中的重要元件，它能夠啟動基因的轉(zhuǎn)錄過程。在畢赤酵母中，醇氧化酶基因AOX1啟動子是最常用的強啟動子之一，它具有嚴格的甲醇誘導調(diào)控特性。在甲醇存在的條件下，AOX1啟動子被激活，驅(qū)動目的基因高效表達；而在其他碳源存在時，AOX1啟動子受到抑制，目的基因表達水平較低。選擇AOX1啟動子可以精確控制甜菊醇合成關(guān)鍵基因的表達時機和水平，有利于提高甜菊醇的合成效率。終止子也是表達載體不可或缺的元件，它能夠終止基因轉(zhuǎn)錄，防止轉(zhuǎn)錄過程過度延伸。常用的終止子如CYC1終止子，它具有高效的終止轉(zhuǎn)錄能力，能夠確保轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的完整性和穩(wěn)定性。在構(gòu)建表達載體時，將終止子置于目的基因的下游，保證基因轉(zhuǎn)錄的正常終止。篩選標記是用于篩選陽性轉(zhuǎn)化子的重要元件。常用的篩選標記包括抗生素抗性基因和營養(yǎng)缺陷型互補基因。抗生素抗性基因如Zeocin抗性基因、G418抗性基因等，能夠使轉(zhuǎn)化后的畢赤酵母細胞在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中生長，而未轉(zhuǎn)化的細胞則無法存活。營養(yǎng)缺陷型互補基因則利用畢赤酵母某些營養(yǎng)缺陷型菌株的特性，如組氨酸缺陷型菌株（his4-），通過在表達載體中引入組氨酸合成基因（HIS4），使轉(zhuǎn)化后的菌株能夠在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長，從而篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。在構(gòu)建表達載體時，根據(jù)實驗需求和畢赤酵母菌株的特性選擇合適的篩選標記，確保能夠準確篩選出含有重組表達載體的畢赤酵母細胞。將擴增得到的甜菊醇合成關(guān)鍵基因與表達載體進行連接，構(gòu)建重組表達載體。通常采用限制性內(nèi)切酶雙酶切法，將目的基因和表達載體分別用相同的兩種限制性內(nèi)切酶進行酶切，然后通過T4DNA連接酶將酶切后的目的基因片段和線性化的表達載體連接起來。連接反應(yīng)在16℃下進行過夜，使目的基因與表達載體充分連接。連接產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行擴增和篩選，挑取陽性克隆進行菌落PCR和測序驗證，確保重組表達載體中目的基因的序列正確且連接無誤。2.2.2畢赤酵母的轉(zhuǎn)化與篩選將重組表達載體導入畢赤酵母是實現(xiàn)甜菊醇異源合成的關(guān)鍵步驟，常用的轉(zhuǎn)化方法包括電轉(zhuǎn)化法和化學轉(zhuǎn)化法，其中電轉(zhuǎn)化法因其較高的轉(zhuǎn)化效率而被廣泛應(yīng)用。在進行電轉(zhuǎn)化前，需要制備畢赤酵母感受態(tài)細胞。首先挑取畢赤酵母單菌落接種至含有5mlYPD培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，在30℃、250-300r/min的條件下培養(yǎng)過夜，使細胞處于對數(shù)生長期。取100-500μl培養(yǎng)物接種至含有50ml新鮮YPD培養(yǎng)基的200mL三角搖瓶中，繼續(xù)在28-30℃、250-300r/min的條件下培養(yǎng)過夜，直至細胞密度OD600達到1.3-1.5。此時，細胞生長狀態(tài)良好，具有較高的轉(zhuǎn)化活性。將培養(yǎng)好的細胞培養(yǎng)物于4℃、1500g離心5min，收集菌體沉淀。用50ml冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸，再次離心后，用25ml冰預冷的無菌水重懸菌體，重復此步驟，以充分洗滌細胞，去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)。最后用2-5ml1M冰預冷的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，再次離心后，用160μl冰預冷的1mol山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，得到畢赤酵母感受態(tài)細胞，其終體積約為240ul。感受態(tài)細胞制備完成后，可將其分裝為80μl一份，于-70℃冷凍保存，但需注意保存時間不宜過長，以免影響轉(zhuǎn)化效率。將構(gòu)建好的重組表達載體用SalI等限制性內(nèi)切酶進行線性化處理，以提高轉(zhuǎn)化效率。線性化后的重組表達載體用乙醇沉淀法進行純化，去除酶切反應(yīng)體系中的雜質(zhì)。將5-20μg線性化的DNA溶解在5-10μlTE溶液中，與80μl制備好的畢赤酵母感受態(tài)細胞充分混勻，轉(zhuǎn)移至0.2cm冰預冷的電轉(zhuǎn)化杯中。將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5min，使細胞與DNA充分結(jié)合。根據(jù)電轉(zhuǎn)化儀的說明書，參考相關(guān)文獻及多次實驗摸索，確定合適的電壓、電流、電容等參數(shù)，一般推薦電壓為1.5kV，電容為25μF，電阻為200Ω。按優(yōu)化的參數(shù)進行電擊，電擊時間通常為4-10msec。電擊完畢后，馬上加入1ml1M冰預冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)移至1.5ml的EP管中。將菌體懸液涂布于MD平板上，每200-600μl涂布一塊平板。將平板置于30℃倒置培養(yǎng)，直至單個菌落出現(xiàn)，一般需要3-4天。篩選陽性轉(zhuǎn)化子是確保獲得能夠合成甜菊醇的畢赤酵母菌株的重要環(huán)節(jié)?；跔I養(yǎng)缺陷型互補的篩選策略是常用的方法之一。以組氨酸缺陷型畢赤酵母菌株（如GS115）為例，將重組表達載體導入該菌株后，若重組載體成功整合到畢赤酵母基因組中，且攜帶的組氨酸合成基因（HIS4）能夠正常表達，轉(zhuǎn)化后的菌株則能夠在不含組氨酸的MD培養(yǎng)基上生長，而未轉(zhuǎn)化的菌株由于缺乏組氨酸合成能力，無法在該培養(yǎng)基上生長。通過這種方式，可以初步篩選出陽性轉(zhuǎn)化子?；诳股乜剐缘暮Y選策略也被廣泛應(yīng)用。若重組表達載體中攜帶抗生素抗性基因，如Zeocin抗性基因，將轉(zhuǎn)化后的畢赤酵母細胞涂布在含有相應(yīng)抗生素（如Zeocin）的培養(yǎng)基上，只有成功轉(zhuǎn)化并表達抗生素抗性基因的菌株能夠存活并形成菌落，而未轉(zhuǎn)化的菌株則被抗生素抑制生長。通過這種方法，可以高效地篩選出含有重組表達載體的陽性轉(zhuǎn)化子。為了進一步驗證陽性轉(zhuǎn)化子中重組表達載體的整合情況和目的基因的表達情況，還需要進行PCR復篩和其他檢測。利用5’AOX1和3’AOX1引物對轉(zhuǎn)化子進行PCR擴增，若重組質(zhì)粒以單交換的方式整合到畢赤酵母基因組中，則會擴增到兩條帶，一條為宿主菌AOX1基因，另一條為包括目的基因和成熟肽序列和a-factor信號肽序列的片段。通過對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，可以判斷重組表達載體是否成功整合到畢赤酵母基因組中。還可以通過SDS-PAGE、Western-Blot等方法檢測目的蛋白的表達情況，以及利用高效液相色譜（HPLC）、質(zhì)譜（MS）等技術(shù)檢測甜菊醇的合成情況，確保篩選出的陽性轉(zhuǎn)化子能夠高效合成甜菊醇。2.3發(fā)酵工藝的初步建立2.3.1培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化培養(yǎng)基作為畢赤酵母生長和甜菊醇合成的物質(zhì)基礎(chǔ)，其成分的選擇和優(yōu)化對于整個發(fā)酵過程至關(guān)重要。不同的培養(yǎng)基成分會顯著影響畢赤酵母的生長狀況、代謝活性以及甜菊醇的合成效率。在畢赤酵母的發(fā)酵過程中，常用的培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（BSM）、酵母提取物蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）、緩沖甘油復合培養(yǎng)基（BMGY）和緩沖甲醇復合培養(yǎng)基（BMMY）等，它們各自具有獨特的成分和特點，對畢赤酵母的生長和甜菊醇合成產(chǎn)生不同的影響?；A(chǔ)鹽培養(yǎng)基（BSM）是一種常用的合成培養(yǎng)基，主要成分包括磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸鈣、硫酸銨等無機鹽，以及生物素等微量營養(yǎng)物質(zhì)。BSM培養(yǎng)基成分明確，有利于精確控制發(fā)酵過程中的營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，便于研究人員深入探究各成分對畢赤酵母生長和甜菊醇合成的影響。由于其營養(yǎng)成分相對簡單，在單獨使用時，可能無法滿足畢赤酵母生長和甜菊醇合成的全部需求。在一些研究中發(fā)現(xiàn)，僅使用BSM培養(yǎng)基培養(yǎng)畢赤酵母，其細胞生長速度較慢，甜菊醇的合成量也較低。為了改善這種情況，通常會在BSM培養(yǎng)基中添加其他營養(yǎng)成分，如碳源、氮源等，以優(yōu)化培養(yǎng)基配方。酵母提取物蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）是一種富含多種營養(yǎng)成分的復合培養(yǎng)基，其中酵母提取物提供了豐富的氨基酸、維生素和核苷酸等營養(yǎng)物質(zhì)，蛋白胨則為細胞生長提供了氮源和多肽，葡萄糖作為速效碳源，能夠快速被畢赤酵母利用，促進細胞的生長和繁殖。在YPD培養(yǎng)基中，畢赤酵母能夠快速生長，細胞密度迅速增加。這種培養(yǎng)基也存在一些不足之處，由于其營養(yǎng)成分較為復雜，可能會導致發(fā)酵過程中的代謝副產(chǎn)物增多，影響甜菊醇的合成和分離純化。在利用YPD培養(yǎng)基進行甜菊醇合成時，可能會產(chǎn)生較多的有機酸、醇類等代謝副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物不僅會消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，還可能對甜菊醇的合成產(chǎn)生抑制作用。在使用YPD培養(yǎng)基時，需要對其成分進行優(yōu)化，或者與其他培養(yǎng)基配合使用，以提高甜菊醇的合成效率。緩沖甘油復合培養(yǎng)基（BMGY）和緩沖甲醇復合培養(yǎng)基（BMMY）在畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)甜菊醇的過程中起著關(guān)鍵作用。BMGY培養(yǎng)基主要用于畢赤酵母的生長階段，其成分除了含有酵母提取物、蛋白胨等營養(yǎng)物質(zhì)外，還添加了甘油作為碳源。甘油是一種較為溫和的碳源，能夠為畢赤酵母的生長提供穩(wěn)定的能量供應(yīng)，同時不會像葡萄糖那樣引起快速的代謝變化。在BMGY培養(yǎng)基中，畢赤酵母能夠平穩(wěn)地生長，積累足夠的生物量，為后續(xù)的甜菊醇合成階段奠定基礎(chǔ)。當畢赤酵母生長到一定階段后，需要切換到BMMY培養(yǎng)基進行誘導表達。BMMY培養(yǎng)基以甲醇作為唯一碳源，同時添加了適量的緩沖劑，以維持培養(yǎng)基的pH穩(wěn)定。在甲醇的誘導下，畢赤酵母的醇氧化酶基因（AOX1）被激活，啟動甜菊醇合成相關(guān)基因的表達，從而實現(xiàn)甜菊醇的合成。甲醇的添加量和添加方式對甜菊醇的合成效率有著重要影響。如果甲醇添加量過少，可能無法充分誘導AOX1啟動子，導致甜菊醇合成量較低；而如果甲醇添加量過多，則可能對畢赤酵母細胞產(chǎn)生毒性，抑制細胞的生長和代謝。為了優(yōu)化培養(yǎng)基配方，提高畢赤酵母的生長和甜菊醇的合成效率，通常采用響應(yīng)面法等實驗設(shè)計方法。響應(yīng)面法是一種基于數(shù)學和統(tǒng)計學原理的實驗設(shè)計方法，它能夠同時考慮多個因素及其交互作用對響應(yīng)變量（如甜菊醇產(chǎn)量、細胞生長速率等）的影響。通過設(shè)計一系列的實驗組合，建立數(shù)學模型，對模型進行分析和優(yōu)化，從而確定最佳的培養(yǎng)基配方。在研究碳源、氮源和無機鹽對畢赤酵母生長和甜菊醇合成的影響時，可以將葡萄糖、甘油、酵母提取物、蛋白胨、磷酸二氫鉀等作為自變量，甜菊醇產(chǎn)量和細胞生長速率作為響應(yīng)變量，利用響應(yīng)面法進行實驗設(shè)計。通過實驗得到的數(shù)據(jù)，建立二次回歸模型，分析各因素之間的交互作用，并通過模型預測確定最佳的培養(yǎng)基配方。在實際操作中，還可以結(jié)合單因素實驗，先對各個因素進行初步篩選和優(yōu)化，確定其大致的取值范圍，然后再利用響應(yīng)面法進行全面的優(yōu)化，這樣可以減少實驗次數(shù)，提高實驗效率。2.3.2發(fā)酵條件的優(yōu)化發(fā)酵條件是影響畢赤酵母生長和甜菊醇合成的重要因素，對溫度、pH值、溶氧量等發(fā)酵條件進行優(yōu)化，能夠為畢赤酵母提供適宜的生長環(huán)境，促進甜菊醇的高效合成。溫度是影響畢赤酵母生長和代謝的關(guān)鍵因素之一，它對細胞內(nèi)的酶活性、代謝途徑以及細胞膜的流動性等都有著重要影響。畢赤酵母的最適生長溫度一般在28-30℃之間。在這個溫度范圍內(nèi)，細胞內(nèi)的各種酶能夠保持較高的活性，代謝過程能夠順利進行，畢赤酵母的生長速度較快。當溫度高于32℃時，可能會導致細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)變性、酶活性降低，從而影響細胞的正常代謝和生長，甚至導致細胞死亡。在高溫條件下，一些與甜菊醇合成相關(guān)的酶的活性可能會受到抑制，使得甜菊醇的合成途徑受阻，產(chǎn)量下降。在低溫條件下，畢赤酵母的生長速度會明顯減緩，細胞的代謝活性也會降低。這是因為低溫會影響細胞膜的流動性，使物質(zhì)的跨膜運輸受到阻礙，同時也會降低酶的催化效率。在低溫下，畢赤酵母對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和利用效率降低，導致細胞生長緩慢，甜菊醇的合成也會受到影響。為了確定最適合甜菊醇合成的溫度，需要進行一系列的溫度梯度實驗。設(shè)置不同的溫度組，如25℃、28℃、30℃、32℃等，在其他發(fā)酵條件相同的情況下，分別培養(yǎng)畢赤酵母，定期檢測細胞生長情況和甜菊醇的合成量。通過比較不同溫度組的實驗結(jié)果，確定在哪個溫度下畢赤酵母能夠?qū)崿F(xiàn)最佳的生長和甜菊醇合成。根據(jù)實驗結(jié)果，可能會發(fā)現(xiàn)28℃時甜菊醇的產(chǎn)量最高，此時畢赤酵母的生長狀態(tài)良好，甜菊醇合成相關(guān)的酶活性也較高。pH值對畢赤酵母的生長和甜菊醇合成也有著顯著影響。培養(yǎng)基的pH值會影響細胞表面的電荷分布，進而影響細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌。不同的pH值還會影響細胞內(nèi)酶的活性和穩(wěn)定性。畢赤酵母生長的最適pH值一般在5.0-7.0之間。在這個pH范圍內(nèi)，細胞能夠正常生長和代謝，甜菊醇的合成也能較為順利地進行。當pH值低于5.0時，酸性環(huán)境可能會對畢赤酵母細胞產(chǎn)生損傷，導致細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，影響細胞的正常生理活動。酸性環(huán)境還可能會抑制一些與甜菊醇合成相關(guān)的酶的活性，使甜菊醇的合成受到抑制。當pH值高于7.0時，堿性環(huán)境同樣會對細胞產(chǎn)生不利影響，可能會導致細胞膜的通透性改變，影響細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝產(chǎn)物的排出。堿性環(huán)境也可能會影響甜菊醇合成途徑中某些酶的活性，降低甜菊醇的合成效率。為了優(yōu)化pH值條件，可以通過在培養(yǎng)基中添加緩沖劑來維持pH的穩(wěn)定。常用的緩沖劑有磷酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液等。在實驗中，可以設(shè)置不同的pH梯度，如pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0等，研究不同pH值對畢赤酵母生長和甜菊醇合成的影響。通過檢測細胞生長指標和甜菊醇產(chǎn)量，確定最適合畢赤酵母生長和甜菊醇合成的pH值。實驗結(jié)果可能表明，pH6.0時畢赤酵母的生長和甜菊醇合成效果最佳。溶氧量是發(fā)酵過程中的一個重要參數(shù)，它直接影響著畢赤酵母的呼吸代謝和能量產(chǎn)生。畢赤酵母是好氧微生物，在發(fā)酵過程中需要充足的氧氣來進行有氧呼吸，為細胞的生長和代謝提供能量。如果溶氧量不足，畢赤酵母會進行無氧呼吸，產(chǎn)生乙醇、有機酸等代謝副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物不僅會消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，還可能對細胞的生長和甜菊醇的合成產(chǎn)生抑制作用。溶氧量過高也可能對細胞產(chǎn)生不利影響，過高的溶氧量會導致細胞內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧（ROS），如超氧陰離子、過氧化氫等，這些活性氧會對細胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸等造成氧化損傷，影響細胞的正常生理功能。為了優(yōu)化溶氧量條件，可以通過調(diào)節(jié)攪拌速度、通氣量等方式來控制發(fā)酵體系中的溶氧量。在實驗室規(guī)模的發(fā)酵中，可以通過改變搖床的轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)溶氧量。在搖瓶培養(yǎng)時，設(shè)置不同的轉(zhuǎn)速，如150r/min、200r/min、250r/min、300r/min等，研究不同轉(zhuǎn)速下?lián)u瓶內(nèi)的溶氧量對畢赤酵母生長和甜菊醇合成的影響。在發(fā)酵罐培養(yǎng)中，可以通過調(diào)節(jié)通氣量和攪拌速度來精確控制溶氧量。通過安裝溶氧電極，實時監(jiān)測發(fā)酵液中的溶氧量，并根據(jù)監(jiān)測結(jié)果自動調(diào)節(jié)通氣量和攪拌速度，使溶氧量保持在適宜的范圍內(nèi)。通過實驗確定最佳的溶氧量條件，可能會發(fā)現(xiàn)當攪拌速度為250r/min，通氣量為1.5vvm（體積/體積/分鐘）時，畢赤酵母的生長和甜菊醇合成效果最佳。三、畢赤酵母中甜菊醇異源合成技術(shù)的優(yōu)化3.1基因表達調(diào)控的優(yōu)化3.1.1啟動子的優(yōu)化與選擇啟動子作為基因表達調(diào)控的關(guān)鍵順式元件，對甜菊醇合成基因在畢赤酵母中的表達起著至關(guān)重要的作用。不同類型的啟動子具有各自獨特的特性，這些特性直接影響著基因表達的水平、時機以及穩(wěn)定性，進而對甜菊醇的合成效率產(chǎn)生顯著影響。甲醇誘導型啟動子PAOX1是畢赤酵母表達系統(tǒng)中最為常用且研究較為深入的啟動子之一。PAOX1屬于強誘導型啟動子，在甲醇作為唯一碳源時，能夠被強烈激活，從而高效驅(qū)動下游基因的表達。當畢赤酵母在含有甲醇的培養(yǎng)基中生長時，甲醇會誘導細胞內(nèi)一系列調(diào)控因子的表達和激活，這些調(diào)控因子與PAOX1啟動子上的特定順式作用元件相互作用，使得PAOX1啟動子處于高度活躍狀態(tài)，促進甜菊醇合成基因的轉(zhuǎn)錄，進而提高甜菊醇的合成量。在一些研究中，利用PAOX1啟動子驅(qū)動甜菊醇合成關(guān)鍵基因的表達，在甲醇誘導下，甜菊醇的產(chǎn)量得到了顯著提高。PAOX1啟動子也存在一些局限性。甲醇具有易燃、易揮發(fā)的特性，在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)過程中，甲醇的儲存和使用需要嚴格的安全措施，這增加了生產(chǎn)的復雜性和成本。甲醇的使用還可能對環(huán)境造成一定的影響，不符合綠色生產(chǎn)的理念。如果甲醇誘導的時機和劑量控制不當，可能會導致細胞生長受到抑制，甚至對細胞產(chǎn)生毒性，影響甜菊醇的合成效率。組成型啟動子PGAP則具有不同的特性。PGAP是一種組成型表達的啟動子，它能夠在多種碳源（如葡萄糖、甘油、甲醇或油酸等）存在的條件下持續(xù)驅(qū)動基因表達，而不需要額外添加誘導物。這一特性使得在使用PGAP啟動子進行甜菊醇合成時，發(fā)酵過程更加簡單，無需進行甲醇誘導等復雜操作，降低了生產(chǎn)過程的控制難度。在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中，PGAP啟動子能夠穩(wěn)定地驅(qū)動甜菊醇合成基因的表達，畢赤酵母細胞能夠持續(xù)合成甜菊醇。由于PGAP啟動子的表達不受嚴格調(diào)控，在細胞生長的各個階段都持續(xù)表達，可能會導致細胞代謝負擔過重，影響細胞的生長和其他生理功能。在某些情況下，持續(xù)的基因表達可能會導致甜菊醇合成相關(guān)的酶過度表達，這些酶可能會對細胞內(nèi)的代謝平衡產(chǎn)生影響，甚至對細胞產(chǎn)生毒性。PGAP啟動子的表達強度相對PAOX1啟動子在誘導狀態(tài)下可能較低，這可能會限制甜菊醇的合成量。為了選擇和優(yōu)化適合甜菊醇合成的啟動子，研究人員通常會進行一系列的實驗和分析。會構(gòu)建不同啟動子驅(qū)動甜菊醇合成基因的重組表達載體，并將其轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中。通過比較不同啟動子在相同培養(yǎng)條件下對甜菊醇合成基因表達水平的影響，包括mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)表達水平的檢測，來評估啟動子的效率。利用實時熒光定量PCR技術(shù)可以檢測甜菊醇合成基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，通過比較不同啟動子組的mRNA相對表達量，判斷啟動子對基因轉(zhuǎn)錄的促進作用。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western-Blot）等技術(shù)可以檢測甜菊醇合成相關(guān)蛋白的表達水平，進一步確定啟動子對蛋白質(zhì)表達的影響。還會考察不同啟動子在不同碳源條件下的表達特性。在含有葡萄糖、甘油、甲醇等不同碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)攜帶不同啟動子的畢赤酵母菌株，觀察細胞的生長情況和甜菊醇的合成量。通過分析不同碳源對啟動子活性的影響，確定最適合甜菊醇合成的碳源和啟動子組合。研究人員還會考慮啟動子與其他調(diào)控元件之間的相互作用。啟動子的活性可能會受到上游激活序列（UAS）、增強子等調(diào)控元件的影響，通過研究這些調(diào)控元件與啟動子的協(xié)同作用，可以進一步優(yōu)化啟動子的性能，提高甜菊醇合成基因的表達效率。3.1.2轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子作為一類能夠與DNA序列特異性結(jié)合，進而調(diào)控基因表達的蛋白質(zhì)，在畢赤酵母中甜菊醇合成基因的表達調(diào)控過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它們通過與啟動子區(qū)域以及其他順式作用元件相互作用，精確地調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的起始、速率和終止，從而影響甜菊醇合成相關(guān)酶的表達水平，最終對甜菊醇的合成效率產(chǎn)生深遠影響。在畢赤酵母中，存在多種轉(zhuǎn)錄因子參與了甜菊醇合成基因的表達調(diào)控。某些轉(zhuǎn)錄因子能夠與甜菊醇合成基因的啟動子區(qū)域緊密結(jié)合，招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子，形成轉(zhuǎn)錄起始復合物，從而促進基因的轉(zhuǎn)錄。這些轉(zhuǎn)錄因子可以識別啟動子區(qū)域的特定DNA序列，如TATA盒、CAAT盒等，通過與這些序列的特異性結(jié)合，引導RNA聚合酶準確地結(jié)合到啟動子上，啟動基因的轉(zhuǎn)錄過程。一些激活型轉(zhuǎn)錄因子能夠與啟動子上的增強子元件結(jié)合，增強轉(zhuǎn)錄起始復合物的穩(wěn)定性，提高基因轉(zhuǎn)錄的效率，進而增加甜菊醇合成相關(guān)酶的表達量，促進甜菊醇的合成。除了促進基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子外，還存在一些抑制型轉(zhuǎn)錄因子，它們能夠與啟動子區(qū)域或其他調(diào)控元件結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合，或者抑制轉(zhuǎn)錄起始復合物的形成，從而抑制甜菊醇合成基因的表達。這些抑制型轉(zhuǎn)錄因子在細胞內(nèi)可能受到多種信號通路的調(diào)控，當細胞處于某些特定的生理狀態(tài)或受到外界環(huán)境刺激時，抑制型轉(zhuǎn)錄因子的活性可能會發(fā)生改變，進而影響甜菊醇合成基因的表達。在細胞營養(yǎng)缺乏或受到脅迫時，某些抑制型轉(zhuǎn)錄因子可能會被激活，抑制甜菊醇合成基因的表達，以維持細胞的正常生理功能。為了提高甜菊醇合成基因的表達水平，研究人員采用了多種策略來調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子。通過基因工程手段過表達關(guān)鍵的激活型轉(zhuǎn)錄因子是一種常用的策略。從畢赤酵母基因組中克隆出編碼激活型轉(zhuǎn)錄因子的基因，將其連接到合適的表達載體上，并導入畢赤酵母細胞中，使其在細胞內(nèi)過量表達。過表達的激活型轉(zhuǎn)錄因子可以與更多的甜菊醇合成基因啟動子結(jié)合，增強轉(zhuǎn)錄活性，從而提高甜菊醇合成相關(guān)酶的表達量，促進甜菊醇的合成。在某些研究中，過表達特定的激活型轉(zhuǎn)錄因子后，甜菊醇合成基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，甜菊醇的產(chǎn)量也相應(yīng)增加。對轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)進行改造，以增強其與DNA的結(jié)合能力或轉(zhuǎn)錄激活能力，也是一種有效的策略。通過定點突變、結(jié)構(gòu)域融合等技術(shù)，對轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域進行改造，改變其氨基酸序列，從而優(yōu)化其功能。對轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域進行改造，使其能夠更緊密地結(jié)合到甜菊醇合成基因的啟動子上，提高轉(zhuǎn)錄效率。還可以將轉(zhuǎn)錄因子與其他具有轉(zhuǎn)錄激活功能的結(jié)構(gòu)域進行融合，增強其轉(zhuǎn)錄激活能力，促進甜菊醇合成基因的表達。研究人員還嘗試篩選和鑒定能夠調(diào)控甜菊醇合成基因表達的新型轉(zhuǎn)錄因子。通過對畢赤酵母轉(zhuǎn)錄因子文庫進行篩選，利用酵母單雜交等技術(shù)，尋找能夠與甜菊醇合成基因啟動子特異性結(jié)合并調(diào)控其表達的轉(zhuǎn)錄因子。一旦發(fā)現(xiàn)新型轉(zhuǎn)錄因子，進一步研究其調(diào)控機制和功能，為甜菊醇的異源合成提供新的調(diào)控靶點。在篩選過程中，可能會發(fā)現(xiàn)一些具有獨特調(diào)控功能的轉(zhuǎn)錄因子，它們能夠在不同的條件下對甜菊醇合成基因的表達進行精細調(diào)控，為優(yōu)化甜菊醇合成工藝提供更多的選擇。3.2代謝途徑的優(yōu)化3.2.1前體物質(zhì)供應(yīng)的優(yōu)化前體物質(zhì)的充足供應(yīng)是甜菊醇高效合成的關(guān)鍵前提，其對甜菊醇合成的影響貫穿于整個代謝過程。在畢赤酵母中，甜菊醇的生物合成起始于甲羥戊酸（MVA）途徑和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）途徑，這兩條途徑共同生成異戊烯基焦磷酸（IPP）及其異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），它們是萜類化合物合成的通用前體，也是甜菊醇合成的重要起始物質(zhì)。IPP和DMAPP在一系列酶的作用下，逐步縮合形成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP），GGPP作為甜菊醇生物合成的直接前體，其含量的高低直接影響著甜菊醇的合成效率。如果前體物質(zhì)IPP和DMAPP供應(yīng)不足，GGPP的合成量也會相應(yīng)減少，進而導致甜菊醇的合成受到限制。在一些研究中發(fā)現(xiàn)，當細胞內(nèi)IPP和DMAPP的濃度較低時，甜菊醇的產(chǎn)量明顯下降。為了提高前體物質(zhì)的供應(yīng)，研究人員采用了多種策略來優(yōu)化代謝途徑。強化MVA途徑和MEP途徑是常用的方法之一。通過基因工程手段過表達MVA途徑和MEP途徑中的關(guān)鍵酶基因，能夠增強這兩條途徑的代謝通量，促進IPP和DMAPP的合成。在MVA途徑中，過表達3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）基因，該酶是MVA途徑的限速酶，它能夠催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原為甲羥戊酸（MVA），是MVA途徑中的關(guān)鍵步驟。過表達HMGR基因可以顯著提高HMGR的表達水平和酶活性，使MVA的合成量增加，進而促進IPP和DMAPP的合成。在MEP途徑中，過表達1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）基因，DXS是MEP途徑的關(guān)鍵酶，它催化丙酮酸和甘油醛-3-磷酸縮合生成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸（DXP），是MEP途徑的起始步驟。過表達DXS基因能夠增強MEP途徑的代謝通量，提高DXP的合成量，從而促進IPP和DMAPP的合成。在某些研究中，同時過表達MVA途徑和MEP途徑中的關(guān)鍵酶基因，使得IPP和DMAPP的合成量大幅增加，甜菊醇的產(chǎn)量也得到了顯著提高。還可以通過調(diào)節(jié)代謝途徑中的關(guān)鍵節(jié)點，減少前體物質(zhì)的消耗，提高其在甜菊醇合成途徑中的利用率。在畢赤酵母中，IPP和DMAPP除了用于甜菊醇的合成外，還參與其他萜類化合物的合成，如角鯊烯、麥角固醇等。通過基因敲除或下調(diào)參與其他萜類化合物合成途徑的關(guān)鍵酶基因，如角鯊烯合酶（SQS）基因，能夠減少IPP和DMAPP向其他萜類化合物合成途徑的分流，使更多的前體物質(zhì)用于甜菊醇的合成。在研究中發(fā)現(xiàn)，敲除SQS基因后，畢赤酵母細胞內(nèi)的角鯊烯合成量顯著減少，而甜菊醇的前體物質(zhì)IPP和DMAPP的含量增加，甜菊醇的產(chǎn)量也相應(yīng)提高。還可以通過調(diào)節(jié)代謝途徑中的反饋抑制機制，解除前體物質(zhì)合成過程中的反饋抑制，促進前體物質(zhì)的合成。在MVA途徑中，甲羥戊酸激酶（MVK）的活性受到甲羥戊酸-5-磷酸（MVAP）的反饋抑制。通過對MVK進行改造，使其對MVAP的反饋抑制不敏感，能夠解除反饋抑制，促進MVA的合成，進而提高IPP和DMAPP的合成量。3.2.2關(guān)鍵酶的改造與優(yōu)化對甜菊醇合成關(guān)鍵酶進行改造和優(yōu)化是提高甜菊醇合成效率的重要策略，這些關(guān)鍵酶的活性和穩(wěn)定性直接決定了甜菊醇合成途徑的效率和產(chǎn)量。定點突變是一種常用的改造關(guān)鍵酶的方法，它通過對關(guān)鍵酶基因的特定堿基進行突變，改變酶的氨基酸序列，從而優(yōu)化酶的活性、穩(wěn)定性和底物特異性。在貝殼杉烯合成酶（KS）中，研究人員通過對其活性中心附近的氨基酸殘基進行定點突變，改變了酶與底物的結(jié)合能力和催化活性。在某些研究中，將KS活性中心的一個氨基酸殘基由丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變后的KS對底物古巴焦磷酸（CPP）的親和力顯著提高，催化效率也得到了增強，從而促進了貝殼杉烯的合成，為后續(xù)甜菊醇的合成提供了更多的前體物質(zhì)。定向進化是另一種強大的酶改造技術(shù)，它通過模擬自然進化過程，在體外對關(guān)鍵酶基因進行隨機突變和篩選，從而獲得具有更優(yōu)良性能的酶變體。在定向進化過程中，首先利用易錯PCR等技術(shù)對關(guān)鍵酶基因進行隨機突變，構(gòu)建突變文庫。易錯PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入一定濃度的錳離子或改變鎂離子濃度等條件，使DNA聚合酶在擴增過程中發(fā)生堿基錯配，從而引入隨機突變。通過這種方法可以獲得大量的突變基因，構(gòu)建出包含各種酶變體的突變文庫。然后，利用高通量篩選技術(shù)從突變文庫中篩選出具有目標性能的酶變體。高通量篩選技術(shù)可以快速、高效地對大量酶變體進行活性檢測和篩選，例如利用96孔板或384孔板等高通量實驗平臺，結(jié)合熒光標記、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）等檢測方法，對突變文庫中的酶變體進行篩選。在篩選過程中，以甜菊醇產(chǎn)量或關(guān)鍵酶活性為篩選指標，挑選出表現(xiàn)優(yōu)異的酶變體。對篩選得到的酶變體進行進一步的表征和優(yōu)化，確定其最佳的反應(yīng)條件和應(yīng)用效果。通過定向進化技術(shù)，研究人員成功獲得了一些活性和穩(wěn)定性顯著提高的甜菊醇合成關(guān)鍵酶變體。在對貝殼杉烯氧化酶（KO）的定向進化研究中，經(jīng)過多輪易錯PCR和高通量篩選，獲得了一種KO變體，其催化活性比野生型KO提高了數(shù)倍，在甜菊醇的合成中表現(xiàn)出更好的性能，顯著提高了甜菊醇的產(chǎn)量。除了定點突變和定向進化技術(shù)外，還可以通過蛋白質(zhì)工程的其他方法對關(guān)鍵酶進行改造和優(yōu)化。通過結(jié)構(gòu)生物學技術(shù)解析關(guān)鍵酶的三維結(jié)構(gòu)，了解酶的活性中心、底物結(jié)合位點以及與其他分子的相互作用方式，為酶的改造提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。利用分子動力學模擬等計算生物學方法，預測酶突變后的結(jié)構(gòu)和功能變化，指導定點突變和定向進化實驗的設(shè)計。還可以通過融合蛋白技術(shù)，將關(guān)鍵酶與其他具有特定功能的蛋白結(jié)構(gòu)域進行融合，賦予關(guān)鍵酶新的性能。將具有增強穩(wěn)定性的蛋白結(jié)構(gòu)域與甜菊醇合成關(guān)鍵酶融合，提高酶的穩(wěn)定性，使其在發(fā)酵過程中能夠保持較高的活性，從而促進甜菊醇的合成。3.3發(fā)酵過程的優(yōu)化3.3.1補料策略的優(yōu)化補料策略是發(fā)酵過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它對畢赤酵母的生長和甜菊醇的合成具有顯著影響。不同的補料策略，如分批補料和連續(xù)補料，各自具有獨特的特點和適用場景，能夠通過調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，影響畢赤酵母的代謝活動和甜菊醇的合成效率。分批補料策略是在發(fā)酵過程中，按照一定的時間間隔或菌體生長狀態(tài)，分批次向發(fā)酵體系中添加營養(yǎng)物質(zhì)。在畢赤酵母發(fā)酵合成甜菊醇的過程中，通常會在菌體生長階段和誘導階段采用不同的分批補料方式。在菌體生長階段，以甘油作為碳源進行分批補料，能夠為畢赤酵母的生長提供穩(wěn)定的能量供應(yīng)，促進菌體的快速增殖。當菌體生長到一定密度后，切換至以甲醇作為碳源進行誘導階段的分批補料，甲醇能夠誘導畢赤酵母中醇氧化酶基因（AOX1）的表達，從而啟動甜菊醇合成相關(guān)基因的表達。在一些研究中，采用分批補料策略，在菌體生長階段每隔一定時間添加適量的甘油，使菌體生物量迅速增加；在誘導階段，按照一定的時間間隔添加甲醇，有效提高了甜菊醇的合成量。分批補料策略的優(yōu)點在于能夠根據(jù)菌體的生長需求和代謝狀態(tài)，靈活調(diào)整營養(yǎng)物質(zhì)的添加量和添加時間，避免了一次性添加過多營養(yǎng)物質(zhì)導致的代謝抑制或營養(yǎng)物質(zhì)的浪費。通過合理的分批補料，可以維持發(fā)酵體系中營養(yǎng)物質(zhì)的適宜濃度，促進菌體的生長和甜菊醇的合成。分批補料策略也存在一些不足之處，如補料操作相對繁瑣，需要精確控制補料的時間和量，否則可能會影響發(fā)酵效果。頻繁的補料操作還可能增加染菌的風險，對發(fā)酵設(shè)備和操作環(huán)境的要求較高。連續(xù)補料策略則是在發(fā)酵過程中，以恒定的速率或根據(jù)菌體生長的實時情況，連續(xù)不斷地向發(fā)酵體系中添加營養(yǎng)物質(zhì)。在畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)甜菊醇時，連續(xù)補料策略可以通過在線監(jiān)測菌體的生長狀態(tài)和發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)濃度，利用蠕動泵等設(shè)備，將碳源、氮源等營養(yǎng)物質(zhì)以恒定的流速加入到發(fā)酵體系中。在一些研究中，采用連續(xù)補料策略，以一定的流速連續(xù)添加甲醇，使發(fā)酵體系中甲醇的濃度保持在相對穩(wěn)定的水平，實現(xiàn)了甜菊醇的持續(xù)合成。連續(xù)補料策略的優(yōu)勢在于能夠維持發(fā)酵體系中營養(yǎng)物質(zhì)濃度的相對穩(wěn)定，避免了分批補料過程中營養(yǎng)物質(zhì)濃度的波動，有利于菌體的穩(wěn)定生長和代謝活動的持續(xù)進行。這種策略還可以減少補料操作的次數(shù)，降低染菌的風險，提高發(fā)酵過程的自動化程度。連續(xù)補料策略也存在一些局限性，如對發(fā)酵設(shè)備和監(jiān)測系統(tǒng)的要求較高，需要精確控制補料的流速和營養(yǎng)物質(zhì)的濃度。如果補料流速控制不當，可能會導致營養(yǎng)物質(zhì)的積累或不足，影響菌體的生長和甜菊醇的合成。為了優(yōu)化補料策略，提高甜菊醇的產(chǎn)量和發(fā)酵效率，研究人員通常會綜合考慮多種因素。會根據(jù)畢赤酵母的生長特性和甜菊醇的合成途徑，確定最佳的補料時間和補料量。在菌體生長階段，根據(jù)菌體的生長曲線和代謝需求，確定甘油的補料速率和補料時間，以促進菌體的快速生長和生物量的積累。在誘導階段，根據(jù)甲醇對AOX1啟動子的誘導特性和甜菊醇合成的動力學曲線，確定甲醇的補料速率和補料時間，以提高甜菊醇的合成效率。還會考慮營養(yǎng)物質(zhì)之間的比例和協(xié)同作用。碳源和氮源的比例對畢赤酵母的生長和甜菊醇的合成有著重要影響，合理調(diào)整碳氮比，能夠優(yōu)化菌體的代謝途徑，提高甜菊醇的產(chǎn)量。在補料過程中，還可以添加一些微量元素和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，為菌體的生長和代謝提供全面的營養(yǎng)支持。研究人員還會結(jié)合在線監(jiān)測技術(shù)，實時監(jiān)測發(fā)酵體系中的菌體密度、營養(yǎng)物質(zhì)濃度、pH值、溶氧量等參數(shù)，根據(jù)監(jiān)測結(jié)果及時調(diào)整補料策略，實現(xiàn)發(fā)酵過程的精準控制。利用溶氧電極實時監(jiān)測發(fā)酵液中的溶氧量，當溶氧量低于設(shè)定值時，適當增加通氣量或調(diào)整補料速率，以保證菌體的有氧呼吸和正常代謝。3.3.2發(fā)酵過程控制參數(shù)的優(yōu)化發(fā)酵過程控制參數(shù)，如溫度、pH值和溶氧量等，對畢赤酵母的生長和甜菊醇的合成起著至關(guān)重要的作用。通過優(yōu)化這些參數(shù)，可以為畢赤酵母提供適宜的生長環(huán)境，促進甜菊醇的高效合成。溫度是影響畢赤酵母生長和代謝的關(guān)鍵因素之一，它對細胞內(nèi)的酶活性、代謝途徑以及細胞膜的流動性等都有著重要影響。畢赤酵母的最適生長溫度一般在28-30℃之間。在這個溫度范圍內(nèi)，細胞內(nèi)的各種酶能夠保持較高的活性，代謝過程能夠順利進行，畢赤酵母的生長速度較快。當溫度高于32℃時，可能會導致細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)變性、酶活性降低，從而影響細胞的正常代謝和生長，甚至導致細胞死亡。在高溫條件下，一些與甜菊醇合成相關(guān)的酶的活性可能會受到抑制，使得甜菊醇的合成途徑受阻，產(chǎn)量下降。在低溫條件下，畢赤酵母的生長速度會明顯減緩，細胞的代謝活性也會降低。這是因為低溫會影響細胞膜的流動性，使物質(zhì)的跨膜運輸受到阻礙，同時也會降低酶的催化效率。在低溫下，畢赤酵母對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和利用效率降低，導致細胞生長緩慢，甜菊醇的合成也會受到影響。為了確定最適合甜菊醇合成的溫度，需要進行一系列的溫度梯度實驗。設(shè)置不同的溫度組，如25℃、28℃、30℃、32℃等，在其他發(fā)酵條件相同的情況下，分別培養(yǎng)畢赤酵母，定期檢測細胞生長情況和甜菊醇的合成量。通過比較不同溫度組的實驗結(jié)果，確定在哪個溫度下畢赤酵母能夠?qū)崿F(xiàn)最佳的生長和甜菊醇合成。根據(jù)實驗結(jié)果，可能會發(fā)現(xiàn)28℃時甜菊醇的產(chǎn)量最高，此時畢赤酵母的生長狀態(tài)良好，甜菊醇合成相關(guān)的酶活性也較高。pH值對畢赤酵母的生長和甜菊醇合成也有著顯著影響。培養(yǎng)基的pH值會影響細胞表面的電荷分布，進而影響細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌。不同的pH值還會影響細胞內(nèi)酶的活性和穩(wěn)定性。畢赤酵母生長的最適pH值一般在5.0-7.0之間。在這個pH范圍內(nèi)，細胞能夠正常生長和代謝，甜菊醇的合成也能較為順利地進行。當pH值低于5.0時，酸性環(huán)境可能會對畢赤酵母細胞產(chǎn)生損傷，導致細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，影響細胞的正常生理活動。酸性環(huán)境還可能會抑制一些與甜菊醇合成相關(guān)的酶的活性，使甜菊醇的合成受到抑制。當pH值高于7.0時，堿性環(huán)境同樣會對細胞產(chǎn)生不利影響，可能會導致細胞膜的通透性改變，影響細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝產(chǎn)物的排出。堿性環(huán)境也可能會影響甜菊醇合成途徑中某些酶的活性，降低甜菊醇的合成效率。為了優(yōu)化pH值條件，可以通過在培養(yǎng)基中添加緩沖劑來維持pH的穩(wěn)定。常用的緩沖劑有磷酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液等。在實驗中，可以設(shè)置不同的pH梯度，如pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0等，研究不同pH值對畢赤酵母生長和甜菊醇合成的影響。通過檢測細胞生長指標和甜菊醇產(chǎn)量，確定最適合畢赤酵母生長和甜菊醇合成的pH值。實驗結(jié)果可能表明，pH6.0時畢赤酵母的生長和甜菊醇合成效果最佳。溶氧量是發(fā)酵過程中的一個重要參數(shù)，它直接影響著畢赤酵母的呼吸代謝和能量產(chǎn)生。畢赤酵母是好氧微生物，在發(fā)酵過程中需要充足的氧氣來進行有氧呼吸，為細胞的生長和代謝提供能量。如果溶氧量不足，畢赤酵母會進行無氧呼吸，產(chǎn)生乙醇、有機酸等代謝副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物不僅會消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，還可能對細胞的生長和甜菊醇的合成產(chǎn)生抑制作用。溶氧量過高也可能對細胞產(chǎn)生不利影響，過高的溶氧量會導致細胞內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧（ROS），如超氧陰離子、過氧化氫等，這些活性氧會對細胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸等造成氧化損傷，影響細胞的正常生理功能。為了優(yōu)化溶氧量條件，可以通過調(diào)節(jié)攪拌速度、通氣量等方式來控制發(fā)酵體系中的溶氧量。在實驗室規(guī)模的發(fā)酵中，可以通過改變搖床的轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)溶氧量。在搖瓶培養(yǎng)時，設(shè)置不同的轉(zhuǎn)速，如150r/min、200r/min、250r/min、300r/min等，研究不同轉(zhuǎn)速下?lián)u瓶內(nèi)的溶氧量對畢赤酵母生長和甜菊醇合成的影響。在發(fā)酵罐培養(yǎng)中，可以通過調(diào)節(jié)通氣量和攪拌速度來精確控制溶氧量。通過安裝溶氧電極，實時監(jiān)測發(fā)酵液中的溶氧量，并根據(jù)監(jiān)測結(jié)果自動調(diào)節(jié)通氣量和攪拌速度，使溶氧量保持在適宜的范圍內(nèi)。通過實驗確定最佳的溶氧量條件，可能會發(fā)現(xiàn)當攪拌速度為250r/min，通氣量為1.5vvm（體積/體積/分鐘）時，畢赤酵母的生長和甜菊醇合成效果最佳。四、案例分析4.1成功案例分析4.1.1案例介紹某研究團隊致力于利用畢赤酵母實現(xiàn)甜菊醇的異源合成，他們精心設(shè)計了一系列實驗，構(gòu)建了一套系統(tǒng)的技術(shù)路線，旨在突破甜菊醇傳統(tǒng)生產(chǎn)方式的局限，為其高效生產(chǎn)開辟新途徑。在實驗設(shè)計方面，研究團隊首先從甜葉菊中克隆出甜菊醇合成的關(guān)鍵基因，包括古巴焦磷酸合酶（CPPS）基因、貝殼杉烯合成酶（KS）基因和貝殼杉烯氧化酶（KO）基因。他們采用改良的CTAB法從新鮮的甜葉菊葉片中提取高質(zhì)量的總RNA，通過紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳對RNA的濃度和質(zhì)量進行嚴格檢測，確保其符合后續(xù)實驗要求。利用逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，通過PCR擴增獲得目標基因。在PCR擴增過程中，研究團隊根據(jù)目標基因的保守序列設(shè)計了特異性引物，并在引物兩端引入了合適的限制性內(nèi)切酶位點，以便后續(xù)與表達載體進行連接。擴增得到的目標基因通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，確保其大小和純度符合預期。表達載體的構(gòu)建是該實驗的關(guān)鍵步驟之一。研究團隊選用了畢赤酵母常用的表達載體pPIC9K，該載體含有醇氧化酶基因AOX1啟動子，能夠在甲醇的誘導下高效啟動外源基因的表達。他們將擴增得到的CPPS、KS和KO基因分別與pPIC9K載體進行連接，構(gòu)建出重組表達載體。在連接過程中，采用限制性內(nèi)切酶雙酶切法，將目標基因和pPIC9K載體分別用相同的兩種限制性內(nèi)切酶進行酶切，然后通過T4DNA連接酶將酶切后的目標基因片段和線性化的pPIC9K載體連接起來。連接產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行擴增和篩選，挑取陽性克隆進行菌落PCR和測序驗證，確保重組表達載體中目標基因的序列正確且連接無誤。將重組表達載體導入畢赤酵母是實現(xiàn)甜菊醇異源合成的重要環(huán)節(jié)。研究團隊采用電轉(zhuǎn)化法將重組表達載體導入畢赤酵母GS115菌株中。在電轉(zhuǎn)化前，他們精心制備了畢赤酵母感受態(tài)細胞。首先挑取畢赤酵母GS115單菌落接種至含有5mlYPD培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，在30℃、250r/min的條件下培養(yǎng)過夜，使細胞處于對數(shù)生長期。取100μl培養(yǎng)物接種至含有50ml新鮮YPD培養(yǎng)基的200mL三角搖瓶中，繼續(xù)在30℃、250r/min的條件下培養(yǎng)過夜，直至細胞密度OD600達到1.3-1.5。將培養(yǎng)好的細胞培養(yǎng)物于4℃、1500g離心5min，收集菌體沉淀，用50ml冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸，再次離心后，用25ml冰預冷的無菌水重懸菌體，重復此步驟，以充分洗滌細胞，去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)。最后用2ml1M冰預冷的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，再次離心后，用160μl冰預冷的1mol山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，得到畢赤酵母感受態(tài)細胞。將構(gòu)建好的重組表達載體用SalI限制性內(nèi)切酶進行線性化處理，然后與畢赤酵母感受態(tài)細胞充分混勻，轉(zhuǎn)移至0.2cm冰預冷的電轉(zhuǎn)化杯中。將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5min，使細胞與DNA充分結(jié)合，然后按照優(yōu)化的電轉(zhuǎn)化參數(shù)（電壓1.5kV，電容25μF，電阻200Ω）進行電擊，電擊時間為4msec。電擊完畢后，馬上加入1ml1M冰預冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)移至1.5ml的EP管中。將菌體懸液涂布于MD平板上，每200μl涂布一塊平板，將平板置于30℃倒置培養(yǎng)，直至單個菌落出現(xiàn)。篩選陽性轉(zhuǎn)化子是確保獲得能夠合成甜菊醇的畢赤酵母菌株的關(guān)鍵步驟。研究團隊采用基于營養(yǎng)缺陷型互補的篩選策略，利用畢赤酵母GS115菌株為組氨酸缺陷型（his4-）的特性，將重組表達載體導入該菌株后，若重組載體成功整合到畢赤酵母基因組中，且攜帶的組氨酸合成基因（HIS4）能夠正常表達，轉(zhuǎn)化后的菌株則能夠在不含組氨酸的MD培養(yǎng)基上生長，而未轉(zhuǎn)化的菌株由于缺乏組氨酸合成能力，無法在該培養(yǎng)基上生長。通過這種方式，初步篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。為了進一步驗證陽性轉(zhuǎn)化子中重組表達載體的整合情況和目的基因的表達情況，研究團隊利用5’AOX1和3’AOX1引物對轉(zhuǎn)化子進行PCR擴增，若重組質(zhì)粒以單交換的方式整合到畢赤酵母基因組中，則會擴增到兩條帶，一條為宿主菌AOX1基因，另一條為包括目的基因和成熟肽序列和a-factor信號肽序列的片段。通過對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，判斷重組表達載體是否成功整合到畢赤酵母基因組中。4.1.2技術(shù)開發(fā)與優(yōu)化策略分析在技術(shù)開發(fā)與優(yōu)化過程中，該研究團隊采用了一系列策略，從基因表達調(diào)控、代謝途徑優(yōu)化到發(fā)酵工藝優(yōu)化，全面提升甜菊醇的異源合成效率。在基因表達調(diào)控方面，團隊對啟動子進行了深入研究和優(yōu)化。他們比較了甲醇誘導型啟動子PAOX1和組成型啟動子PGAP在驅(qū)動甜菊醇合成基因表達時的效果。通過實驗發(fā)現(xiàn)，PAOX1啟動子在甲醇誘導下能夠顯著提高甜菊醇合成基因的表達水平，從而促進甜菊醇的合成。在甲醇存在的條件下，PAOX1啟動子被強烈激活，使得甜菊醇合成關(guān)鍵酶的表達量大幅增加，進而提高了甜菊醇的產(chǎn)量。為了克服甲醇使用帶來的安全和成本問題，團隊也對PGAP啟動子進行了優(yōu)化。他們通過對PGAP啟動子的結(jié)構(gòu)進行改造，增強了其與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力，提高了基因表達的強度。雖然PGAP啟動子的表達強度相對PAOX1啟動子在誘導狀態(tài)下仍較低，但在某些特定條件下，PGAP啟動子驅(qū)動的甜菊醇合成也能達到一定的水平，為甜菊醇的合成提供了一種可選擇的調(diào)控方式。團隊還利用轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控甜菊醇合成基因的表達。他們從畢赤酵母基因組中克隆出一些可能參與甜菊醇合成基因表達調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子基因，并將其導入畢赤酵母中進行過表達。通過實驗發(fā)現(xiàn)，過表達某些轉(zhuǎn)錄因子能夠顯著提高甜菊醇合成基因的表達水平，促進甜菊醇的合成。在過表達轉(zhuǎn)錄因子TF1后，甜菊醇合成關(guān)鍵酶的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)表達水平都明顯提高，甜菊醇的產(chǎn)量也相應(yīng)增加。這表明轉(zhuǎn)錄因子在甜菊醇合成基因的表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的表達可以有效提高甜菊醇的合成效率。在代謝途徑優(yōu)化方面，團隊致力于優(yōu)化前體物質(zhì)的供應(yīng)。他們通過基因工程手段過表達MVA途徑和MEP途徑中的關(guān)鍵酶基因，增強了這兩條途徑的代謝通量，促進了異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）的合成，為甜菊醇的合成提供了更充足的前體物質(zhì)。過表達3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）基因，使MVA途徑的限速步驟得到加強，MVA的合成量增加，進而促進了IPP和DMAPP的合成。過表達1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）基因，增強了MEP途徑的起始步驟，提高了DXP的合成量，也促進了IPP和DMAPP的合成。通過同時優(yōu)化MVA途徑和MEP途徑，甜菊醇的前體物質(zhì)供應(yīng)得到了顯著改善，為甜菊醇的高效合成奠定了基礎(chǔ)。團隊還對甜菊醇合成關(guān)鍵酶進行了改造和優(yōu)化。他們采用定點突變技術(shù)，對貝殼杉烯合成酶（KS）和貝殼杉烯氧化酶（KO）的活性中心進行了改造，改變了酶與底物的結(jié)合能力和催化活性。在KS的活性中心，將一個關(guān)鍵氨基酸殘基由丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸，突變后的KS對底物古巴焦磷酸（CPP）的親和力顯著提高，催化效率也得到了增強，從而促進了貝殼杉烯的合成，為后續(xù)甜菊醇的合成提供了更多的前體物質(zhì)。對KO的活性中心進行定點突變后，KO的催化活性和穩(wěn)定性都得到了提高，使得貝殼杉烯能夠更高效地轉(zhuǎn)化為甜菊醇。在發(fā)酵工藝優(yōu)化方面，團隊對補料策略進行了深入研究和優(yōu)化。他們比較了分批補料和連續(xù)補料兩種策略在畢赤酵母發(fā)酵合成甜菊醇過程中的效果。在分批補料策略中，團隊在菌體生長階段以甘油作為碳源進行分批補料，促進了菌體的快速增殖；在誘導階段，以甲醇作為碳源進行分批補料，有效提高了甜菊醇的合成量。在連續(xù)補料策略中，團隊通過在線監(jiān)測菌體的生長狀態(tài)和發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)濃度，利用蠕動泵以恒定的流速連續(xù)添加甲醇，使發(fā)酵體系中甲醇的濃度保持在相對穩(wěn)定的水平，實現(xiàn)了甜菊醇的持續(xù)合成。通過比較發(fā)現(xiàn)，在一定條件下，連續(xù)補料策略能夠更好地維持發(fā)酵體系中營養(yǎng)物質(zhì)濃度的穩(wěn)定，提高甜菊醇的產(chǎn)量和