高通量測序技術(shù)及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用

高通量測序技術(shù)及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用1、1什么就是高通量測序技術(shù)高通量序技術(shù)(next-generationsequencing)就是對傳統(tǒng)Sanger法測序得一次革命性得改變,就是一次可對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定得高通量得測序技術(shù),同時高通量測序使得對一個物種得轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌得分析成為可能,所以又被稱為深度測序(deepsequencing)。

一、高通量測序技術(shù)1、2為什么要發(fā)展高通量測序技術(shù)快速和準確地獲取生物體得遺傳信息對于生命科學研究一直具有十分重要得意義。對于每個生物體來說,基因組包含了整個生物體得遺傳信息。測序技術(shù)能夠真實地反映基因組DNA上得遺傳信息,進而比較全面地揭示基因組得復雜性和多樣性,因而在生命科學研究中扮演了十分重要得角色。1977年Sanger等發(fā)明得雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明得化學降解法,標志著第一代測序技術(shù)得誕生。盡管第一代測序技術(shù)已經(jīng)幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量得測序工作,但由于其存在成本高、速度慢等方面得不足,并不就是最理想得測序方法。經(jīng)過不斷得開發(fā)和測試,進入21世紀后,以Roche公司得454技術(shù)、Illumina公司得Solexa技術(shù)和ABI公司得SOLiD技術(shù)為標志得第二代測序技術(shù)誕生了。1、3高通量測序技術(shù)得特點速度快準確度高成本低覆蓋度深產(chǎn)出巨大二

高通量測序技術(shù)得原理高通量測序技術(shù)包括Roche公司得454技術(shù)、Illumina公司得Solexa技術(shù)和ABI公司得SOLiD技術(shù)。下面對三種高通量測序技術(shù)得原理和特點分別進行具體介紹。454Pyrosequencing基于磁珠得焦磷酸測序:A磁珠制備設(shè)備B454測序儀C454測序原理大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點454測序流程與BaseCalling每次加入一種堿基然后再對熒光強度進行讀取。堿基聚合反應(yīng)產(chǎn)生焦磷酸ppi,ppi在硫化酶催化下生成ATP,ATP在熒光酶催化下激發(fā)熒光,熒光強度和焦磷酸得量成正比。454技術(shù)得主要缺點就是無法準確測量同聚物(homopolymer)得長度。例如當待測序列中出現(xiàn)Poly(A)得情況下,測序反應(yīng)中會一次加上多個T,而加入T得數(shù)目只能從熒光信號得強度來推測,有可能造成結(jié)果不準確。也正就是因為這個原因,454技術(shù)主要得錯誤不就是來自核苷酸得替換,而就是來自插入或缺失。454技術(shù)最大得優(yōu)勢在于較長得讀取長度,使得后繼得序列拼接工作更加高效、準確。IlluminaSolexa簡介橋式PCR邊合成邊測序可逆終止物HiSeq2000Solexa得特點與主要應(yīng)用讀長較短,100－150bp通量高,25G每天,120-150G每Run主要應(yīng)用:RNA測序、表觀遺傳學研究ABISOLiD簡介SOLiD

SequencingbyOligoLigation/DetectionOligo連接測序:通過連接酶連接,再對oligo上熒光基團進行檢測SOLiD5500xlABISOLiD測序前期制備A樣品片段化磁珠連接B乳化PCR3‘末端修飾C磁珠富集轉(zhuǎn)到測序玻片ABISOLiD測序原理測序流程依次加入五種引物進行五次測序。加入測序引物及加入oligo連接酶連接,激發(fā)熒光檢測,循環(huán)一個流程,換一種引物再循環(huán)一個流程,五個流程結(jié)果疊加分析出序列。SOLiD得特點與主要應(yīng)用讀長較短,50-75bp精度高,可達Q40通量高,20-30G每天,1Run可達120G主要應(yīng)用:基因組重測序、SNP檢測等三種平臺得技術(shù)差異平臺454SolexaSOLiDPCR磁珠乳化PCR橋式PCR磁珠乳化PCR測序載體磁珠玻片玻片測序方式焦磷酸、熒光可逆終止物、熒光連接酶、熒光結(jié)果序列FastQFastQCSFastQ三、高通量測序技術(shù)在農(nóng)業(yè)上得應(yīng)用目前,高通量測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動植物全基因組測序、基因組重測序、轉(zhuǎn)錄組測序、小RNAs測序和表觀基因組測序等方面。下面對高通量測序技術(shù)在農(nóng)業(yè)研究中得一些具體應(yīng)作以介紹。3、1全基因組重測序全基因組重測序就是對已知基因組序列得物種進行不同個體得基因組測序,并在此基礎(chǔ)上對個體或群體進行差異性分析。全基因組重測序得個體,通過序列比對,可以找到大量得單核苷酸多態(tài)性位點(SNP)、插入缺失位點(InDel,Insertion/Deletion)、結(jié)構(gòu)變異位點(SV,StructureVariation),通過生物信息學手段,分析不同個體基因組間得結(jié)構(gòu)差異,同時完成注釋。

3、1、1利用重測序進行進化分析及SNP篩選

Lai等(2010)對6個玉米(Zeamays)骨干自交系進行了全基因組重測序,共發(fā)現(xiàn)

1273124個單核苷酸多態(tài)性位點(SNPs),得到30178個1～6bp得插入缺失位點(InDels),新發(fā)現(xiàn)得這些SNPs和InDels提供了1個高密度得全基因組標記信息,同時也鑒定出數(shù)百個基因獲得與丟失變異(Presence/AbsenceVariations,PAVs)。3、1、2利用重測序技術(shù)鑒定突變體突變基因Ashelford等(2011)對一個擬南芥突變體ebi－1得回交系進行基因組重測序,隨后又通過對突變體得表達數(shù)據(jù)進行調(diào)查使得候選SNPs數(shù)目得以有效縮小,最終成功鑒定出1個在AtNFXL－2基因中引起ebi－1突變表型得SNPs位點該研究證實利用回交系材料可以降低遺傳背景噪音,對其進行測序分析可有效減少候選SNPs數(shù)目。3、2全基因組denovo測序

全基因組denovo測序也稱為從頭測序,就是直接對某個物種進行基因組全測序,然后利用生物信息學方法對序列進行拼接和組裝,得到完整得物種基因組序列、基因組測序?qū)ρ芯课锓N得基因組和功能基因信息、闡明物種