中醫(yī)藥防治動(dòng)脈粥樣硬化的系列研究

中醫(yī)藥防治動(dòng)脈粥樣硬化的系列研究南方醫(yī)科大學(xué)賈鈺華主要內(nèi)容一、動(dòng)物模型二、研究?jī)?nèi)容三、研究方法四、研究結(jié)果五、展望前景前言動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是主要發(fā)生在全身大、中彈力血管處的慢性病變（粥樣斑塊）。AS與多種因素密切相關(guān)，其中脂質(zhì)代謝異常、血管內(nèi)皮損傷、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、病理性血管生成都是誘發(fā)AS的中心環(huán)節(jié)。血液流變學(xué)異常、血小板活化及血管內(nèi)皮損傷是AS血的重要生物學(xué)表現(xiàn)。AS斑塊是痰濁與血瘀凝結(jié)的結(jié)果。一、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊動(dòng)物模型1.國(guó)家有關(guān)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理的有關(guān)法規(guī)是證候模型研究中動(dòng)物選擇的基本依據(jù)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)學(xué)有關(guān)從動(dòng)物生理特性，研究指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作，自然發(fā)病等方面選擇動(dòng)物的原理為證候模型研究中動(dòng)物的選擇所遵循。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在遺傳、微生物質(zhì)量控制方面存在著單純性與代表性的基本矛盾，即動(dòng)物的品質(zhì)越高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果就越均一，但其代表性也越弱。從作為人類模型這一本質(zhì)屬性來(lái)說(shuō)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的首要衡量標(biāo)準(zhǔn)是與人類的相似性，標(biāo)準(zhǔn)化必須服從于相似性。從標(biāo)準(zhǔn)化出發(fā)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳和微生物控制是錯(cuò)誤的。2.建立與中醫(yī)學(xué)相適應(yīng)的，實(shí)證的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物評(píng)價(jià)、管理體系證候模型研究的動(dòng)物選擇應(yīng)從中醫(yī)角度考慮體質(zhì)因素。證候模型研究的動(dòng)物選擇還應(yīng)從中醫(yī)角度考慮技術(shù)因素：豬的皮膚結(jié)構(gòu)與人相似，適合制作溫病模型觀察汗出；豬的舌象與人相似適合于模型舌象觀察；體形較大的動(dòng)物適合于做按摩治療研究；豚鼠耳蝸較為敏感，常用于“腎主耳”的研究。3.證候模型研究應(yīng)盡量選擇在其日常生活中就能出現(xiàn)相應(yīng)證候的動(dòng)物。遺傳性證候模型由于具有生物學(xué)特性恒定，重復(fù)性好的特點(diǎn)，應(yīng)更多地建立。如在病的基礎(chǔ)上篩選出證候較一致的動(dòng)物模型，如自發(fā)性遺傳性糖尿病陰虛證中國(guó)田鼠(Cricetulusgriseus)，將健康中國(guó)田鼠在兄弟姐妹鼠間交配，第三、第四代時(shí)出現(xiàn)自發(fā)性遺傳性糖尿病，發(fā)生率可達(dá)65～90%。4.動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型構(gòu)建的方法5.AS痰濁血瘀證候現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)(1)動(dòng)脈粥樣硬化痰濁證候的生物學(xué)基礎(chǔ)

脂質(zhì)代謝紊亂——痰濁從痰證論治AS是具有中醫(yī)特色的一種方法結(jié)合脂質(zhì)代謝紊亂，尤其是HDL-C的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)作用，從細(xì)胞和分子水平對(duì)痰濁型AS的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行更深入的研究，將有助于揭示AS痰濁證候的微觀生物學(xué)基礎(chǔ)。(2)動(dòng)脈粥樣硬化血瘀證候的生物學(xué)基礎(chǔ)血瘀證:血凝而不行、血泣則不通、凝血蘊(yùn)里而不散等，說(shuō)明血在脈中發(fā)生瘀滯的狀態(tài)血行失度、血脈不通皆是產(chǎn)生AS血瘀證候根本原因。現(xiàn)代研究表明，血液流變學(xué)異常、血小板活化及血管內(nèi)皮損傷是AS血瘀證候的重要生物學(xué)表現(xiàn)。內(nèi)皮細(xì)胞損傷是血管病變的始動(dòng)因素，內(nèi)皮素(ET)是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷特異性指標(biāo)之一。ET、NO及二者的平衡，血栓素(TXA2)、前列腺素(PGI2)及二者間的平衡(TXA2／PGI2)，組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、組織型纖溶酶原激活劑抑制物(PAI)及二者的比值炎癥病理和纖維化——血瘀證機(jī)制。研究證實(shí)在AS從早期內(nèi)皮被修飾的脂質(zhì)活化到最終的斑塊破裂都有炎性反應(yīng)的參與。如：AS發(fā)生時(shí)諸多細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)與核因子-κB(NF-κB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的開(kāi)放有關(guān)（3）動(dòng)脈粥樣硬化痰濁血瘀證與組學(xué)技術(shù)高脂血癥及AS不同痰瘀證候可能的血漿標(biāo)志蛋白與不同的臟腑功能之間存在不同的關(guān)聯(lián)組合。采用代謝組學(xué)技術(shù)，探討痰瘀證候的動(dòng)態(tài)演變、時(shí)相特點(diǎn)和由痰致瘀在代謝方面的變化。高脂血癥前期以脂質(zhì)代謝紊亂為特點(diǎn)，隨著病程進(jìn)展，參與血液凝固過(guò)程的乙酰糖蛋白出現(xiàn)，同時(shí)酮體及乳酸升高。我們的經(jīng)驗(yàn)體會(huì)無(wú)論是大鼠還是小鼠，僅僅用高脂飼料喂養(yǎng)的方法，只能制造高脂血癥模型（痰濁證），很難制作出AS斑塊模型（痰濁血瘀證）；制作出AS斑塊動(dòng)物模型，雖然有多種方法，如球囊損傷法，但死亡率高，成本大，操作不易；用ApoE-/-小鼠+高脂飼料喂養(yǎng)的方法，成功率高，成本相對(duì)較低，操作相對(duì)容易，且符合痰濁血瘀證的特征。ApoE-/-小鼠+高脂飼料喂養(yǎng)的方法，是制作痰濁血瘀證AS斑塊模型的理想方法。二、研究?jī)?nèi)容

AS的發(fā)生發(fā)展中具有諸多因素。本課題組近年來(lái)，采用在體與離體水平相結(jié)合的方法，使用中醫(yī)藥干預(yù)AS模型小鼠與細(xì)胞，從抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及減少病理性血管生成等方面，進(jìn)行防治AS的系列研究。冠心病等AS疾病屬中醫(yī)胸痹、心悸怔忡、心痛范疇。其病因病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)。氣虛、痰瘀互阻是重要的病理因素。痰瘀互結(jié)以致病，補(bǔ)氣活血是主要防治方法。二、研究?jī)?nèi)容基于對(duì)冠心病等AS疾病病機(jī)的充分認(rèn)識(shí)，在臨床上采用中藥復(fù)方定心方（DXR）治療冠心病多年收到了良好療效。DXR重用赤芍和丹參為君，活血化瘀、涼血止痛，取“去瘀生新”之義；以歸心肝經(jīng)之黃連、苦參為臣，解毒清熱，瀉火寧心；佐以三七、瓜蔞活血祛痰，茯苓、黨參健脾益氣，靈芝、酸棗仁養(yǎng)心安神；諸藥合而共奏益氣養(yǎng)心、活血解毒、清熱祛痰之功效。二、研究?jī)?nèi)容二、研究?jī)?nèi)容近幾年的研究?jī)?nèi)容主要有六個(gè)方面：一、定心方上調(diào)ApoE-/-小鼠PTEN表達(dá)抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成的研究；二、定心方經(jīng)Ang1-Tie2通路干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的實(shí)驗(yàn)研究；三、定心方通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路減輕ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制；二、研究?jī)?nèi)容四、梔子苷通過(guò)miR-101/MKP-1/MAPK通路抑制動(dòng)脈粥樣硬化炎癥的機(jī)制研究；五、梔子苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化并發(fā)非酒精性脂肪肝ApoE-/-小鼠炎癥和氧化應(yīng)激的影響；六、三七皂苷R1上調(diào)miR-146a水平和減輕ApoE-/-小鼠肝臟炎癥損傷的研究三、研究方法1.在體水平實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)8周齡雄性ApoE-/-小鼠90只，8周齡雄性野生型C57BL/6J小鼠作為空白對(duì)照。飼養(yǎng)室溫18～26℃，相對(duì)濕度55%左右，光照時(shí)間為12h。飼養(yǎng)籠具及引水瓶定期消毒。小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠3～4只。高脂飼料（0.15%膽固醇，21%豬油，78.85%原糧）由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心配制。小鼠分組：雄性ApoE-/-小鼠，隨機(jī)分為9組，每組10只。分別為模型組，辛伐他汀組，DXR低、中、高劑量組，梔子苷組，三七皂苷低、中、高劑量組，所有小鼠均高脂飼料喂養(yǎng)，并以同周齡雄性C57BL/6J小鼠作為空白對(duì)照組。三、研究方法DXR低、中、高劑量組分別以9.30g/kg、18.59g/kg、37.18g/kg藥液灌胃，辛伐他汀組以5mg/kg藥液灌胃，梔子苷以50mg/kg藥液灌胃，三七皂苷R1低、中、高劑量組分別為12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg，腹腔注射給藥，其他組給予等劑量生理鹽水灌胃。各組小鼠自由飲水，根據(jù)小鼠體重(每?jī)芍軠y(cè)量1次)，以校正給藥量，藥液灌胃均每日1次，連續(xù)12周。三、研究方法三、研究方法2.離體水平人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）購(gòu)自于CascadeBiologics公司，細(xì)胞培養(yǎng)用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃，5%的CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，2~3d傳代一次，實(shí)驗(yàn)采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。三、研究方法含藥血清的制備實(shí)驗(yàn)分組：以含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞18h，待細(xì)胞貼壁后，分為5組：空白對(duì)照組、模型組、DXR高、中、低劑量組?？瞻讓?duì)照組加入10％FBS的DMEM培養(yǎng)液，其余各組加入10％FBS的DMEM培養(yǎng)液+ox-LDL，終濃度為100ug/ml。以上各組共同繼續(xù)培養(yǎng)24h，棄去上清后，空白對(duì)照組加入含15％空白大鼠血清的DMEM培養(yǎng)液，模型組加入10％FBS的DMEM培養(yǎng)液，定心方高中低劑量組分別加入20%、15%、5%含DXR含藥血清的DMEM培養(yǎng)液，共同培育24h后收集細(xì)胞。生化檢測(cè)HE、Masson染色免疫組化RT-qPCRWesternBlot

ELISA

三、研究方法三、研究方法細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)

小管形成實(shí)驗(yàn)1、定心方上調(diào)ApoE-/-小鼠PTEN表達(dá)抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成的研究①DXR給藥組血脂水平較模型組明顯降低，表明DXR有降脂作用；②模型組小鼠血清中總超氧化物歧化酶，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，總抗氧化能力較空白對(duì)照組明顯降低，而丙二醛水平明顯升高。DXR治療后血清中總超氧化物歧化酶，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，總抗氧化能力升高，丙二醛水平降低，表明DXR有抑制ApoE-/-小鼠氧化應(yīng)激的作用；

四、研究結(jié)果③與空白對(duì)照組小鼠相比，所有ApoE-/-小鼠均有斑塊形成。經(jīng)不同劑量DXR治療后主動(dòng)脈病變減輕，DXR高劑量組管腔狹窄程度減輕最為明顯，斑塊面積最??；④模型組小鼠主動(dòng)脈PTEN水平較空白對(duì)照組明顯降低，而經(jīng)過(guò)辛伐他汀及DXR不同劑量治療后均可升高PTEN水平。

四、研究結(jié)果2、定心方經(jīng)Ang1-Tie2通路干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的實(shí)驗(yàn)研究①受DXR干預(yù)小鼠的斑塊內(nèi)CD34標(biāo)記的小血管數(shù)目明顯減少，證明DXR具有抑制小鼠血管生成的作用；

四、研究結(jié)果注：A.空白組B.模型組C.辛伐他汀組D.DXR低劑量組E.DXR中劑量組F.DXR高劑量組（200倍光鏡下視野）②DXR中劑量組和高劑量組對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移具有抑制作用。DXR含藥血清組也具有降低血管內(nèi)皮細(xì)胞在體外分化成管狀結(jié)構(gòu)的能力；③受DXR含藥血清干預(yù)的HUVEC中的Ang1蛋白和Tie2蛋白表達(dá)量上調(diào)，與血管生成相關(guān)的VEGF蛋白表達(dá)量下降。說(shuō)明DXR含藥血清可以激活人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的Ang1-Tie2通路，進(jìn)而調(diào)控下游指標(biāo)VEGF，實(shí)現(xiàn)對(duì)血管生成的調(diào)控；

四、研究結(jié)果④雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)證明，受DXR含藥血清干預(yù)的雞胚組形成的一級(jí)血管與二級(jí)血管數(shù)量顯著低于模型組。

四、研究結(jié)果

3、定心方通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路減輕ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制①DXR可顯著降低MMP9表達(dá)與MMP9/TIMP1比值，并上調(diào)TIMP1表達(dá)；②DXR可促進(jìn)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC分泌NO及SOD，起到抗氧化應(yīng)激作用；③DXR各組細(xì)胞的p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)均顯著降低。

四、研究結(jié)果4、梔子苷通過(guò)miR-101/MKP-1/MAPK通路抑制動(dòng)脈粥樣硬化炎癥的機(jī)制研究

①梔子苷降低小鼠血脂血糖水平，調(diào)控糖脂代謝紊亂；②梔子苷減小動(dòng)脈粥樣硬化小鼠體內(nèi)斑塊大小，減緩纖維斑塊的發(fā)展；③梔子苷顯著降低小鼠血清中炎癥因子如TNF-α、IL-6的表達(dá)；④梔子苷可以上調(diào)MKP-1表達(dá)，降低p38的活化程度；⑤梔子苷顯著下調(diào)miR-101的轉(zhuǎn)錄水平

四、研究結(jié)果5、梔子苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化并發(fā)非酒精性脂肪肝ApoE-/-小鼠炎癥和氧化應(yīng)激的影響①梔子苷能夠有效降低ApoE-/-小鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基酶水平；②梔子苷能夠降低小鼠肝臟中TNF-α、IL-6水平，具有抑制炎癥及減輕肝損傷的作用；

四、研究結(jié)果③梔子苷顯著降低肝臟中丙二醛水平，升高總超氧化物歧化酶水平。④HE染色表明梔子苷能夠有效減少AS斑塊面積，同時(shí)能夠一定程度抑制肝臟脂肪變性。

四、研究結(jié)果

6、三七皂苷R1上調(diào)miR-146a水平和減輕ApoE-/-小鼠肝臟炎癥損傷的研究

①模型組小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基酶含量顯著高于空白對(duì)照組，使用中、高劑量三七皂苷R1干預(yù)后，小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶與天冬氨酸氨基酶的含量顯著降低；②肝臟組織形態(tài)學(xué)結(jié)果也表明，與模型組比較，三七皂苷R1能明顯減輕AS小鼠肝細(xì)胞的脂肪變性，改善肝功能；

四、研究結(jié)果③三七皂苷R1干預(yù)小鼠后，TNF-α和IL-6均顯著下降，且高劑量組療效更為顯著，表明三七皂苷R1能明顯抑制AS炎癥因子的表達(dá)；④三七皂苷R1及辛伐他汀干預(yù)后進(jìn)一步升高肝臟miR-146a水平，從而發(fā)揮其抑制炎癥的作用。這可能是三七皂苷R1減輕AS小鼠肝損傷及炎癥反應(yīng)的重要分子機(jī)制。

四、研究結(jié)果

中醫(yī)藥因其獨(dú)特的辨證論治理論體系及全面調(diào)節(jié)機(jī)體機(jī)能的特色，在干預(yù)AS的研究方面取得了一定的進(jìn)展。