生物化學(xué) 第五節(jié) 蛋白質(zhì)性質(zhì)

第五節(jié)

蛋白質(zhì)性質(zhì)一．蛋白質(zhì)分子的大小，形狀以及分子量的測定

1、其分子量變化范圍為104—106或更高

2、其形狀有纖維蛋白（肌球蛋白），球蛋白（β-脂蛋白）以及介于兩者之間的橢圓形蛋白質(zhì)（如清蛋白）

3、高分子特性蛋白質(zhì)膠體性，變性，免疫學(xué)性質(zhì)蛋白質(zhì)分子量的測定方法1、蛋白質(zhì)最小分子量的測定2、超離心法3、分子篩層析法4、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）1、蛋白質(zhì)最小分子量的測定用化學(xué)方法測定蛋白質(zhì)中某一特定成分的百分含量，根據(jù)公式可計算出最小分子量。最小分子量=原子量/組成百分?jǐn)?shù)*100

如細胞色素C含鐵量為0.45%，其最低分子量為：55.8/0.45%）*100=12,237CsCl2不常用，因其價格昂貴。所必需的儀器低溫超速離心機，耗價不菲！2、超離心法用分析型的超速離心機測定蛋白質(zhì)的分子量，轉(zhuǎn)速達50,000r/min以上時，溶液中蛋白質(zhì)分子發(fā)生沉淀，計算其沉降系數(shù)S，求出其分子量。公式如下：3、分子篩層析法又稱凝膠過濾，主要用于測定球蛋白分子量。一般球蛋白洗脫體積取決于分子大小，在一定的分子量范圍內(nèi)，洗脫液的體積Ve是分子量對數(shù)的線形函數(shù)。即在一定分子量范圍內(nèi)，球形蛋白質(zhì)洗脫體積Ve取決于分子大小M：

Ve=K1-K2lgM（其中K1，K2為常數(shù)，由實驗條件確定）

4、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）

SDS指十二烷基硫酸鈉

SDS：sodiumdodecyl

sulfate——

polyacrylamid

gelelectrophresis

電泳系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)電泳速度主要取決于它的分子量，而與電荷無關(guān)。對照標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，可近似得到被測蛋白質(zhì)的分子量。要獲得其精確的分子量，要根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸的組成（或一級結(jié)構(gòu)）計算。

蛋白質(zhì)是大分子，又具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，所以蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，外界因素可引起蛋白質(zhì)的變性。二．蛋白質(zhì)的變性吳憲最早提出并闡明蛋白質(zhì)的變性（denaturationofprotein）概念：某些物理的和化學(xué)的因素使蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變或者破壞，導(dǎo)致其生物活性的喪失和一些理化性質(zhì)的改變。變性并不涉及共價鍵（肽鍵和二硫鍵等）的破裂，一級結(jié)構(gòu)保持完好，只是蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象的改變或破壞。

變性的本質(zhì)：空間結(jié)構(gòu)的改變或破壞，一級結(jié)構(gòu)不變。（因為肽鍵穩(wěn)定而次級鍵不穩(wěn)定）。變性的特征：

1、生物學(xué)活性喪失。

2、理化性質(zhì)改變。變性并非是壞事，變形的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)疏松，容易為蛋白水解酶水解。如食用變性蛋白質(zhì)更利于消化。變性后，蛋白質(zhì)溶解度降低所以容易從中沉淀下來。但遇強酸強堿時，蛋白質(zhì)雖然變性但仍可保持溶解狀態(tài)。酶，蛋白質(zhì)性質(zhì)中的實驗內(nèi)容。變性的意義1、醫(yī)藥生產(chǎn)，應(yīng)用（滅菌：酒精，高壓蒸汽，紫外線）等方面都利用蛋白質(zhì)變性原理。2、保護：如重金屬引起變性，可用雞蛋清或牛奶保護3、消化吸收4、某些活性蛋白質(zhì)（藥用蛋白）在生產(chǎn)中需避免變性。三．蛋白質(zhì)的兩性電離與等電點

從蛋白質(zhì)組成氨基酸的結(jié)構(gòu)可見，氨基酸分子有-COOH，-NH2，且組成的氨基酸有酸性氨基酸和堿性氨基酸等，所以蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì)。

1、蛋白質(zhì)具有兩性性質(zhì)蛋白質(zhì)的組成單位是具有兩性性質(zhì)的氨基酸，蛋白質(zhì)分子中除了N末端自由的-NH2和C末端自由的-COOH外，側(cè)鏈上尚有不少可以解離的基團如-NH2

（堿性氨基酸）-COOH（酸性氨基酸），-OH（Ser）等。所以蛋白質(zhì)也是兩性物質(zhì)。2、蛋白質(zhì)的等電點（isoelectricpoint）pI

具有兩性性質(zhì)的蛋白質(zhì)在溶液中帶電情況主要取決于溶液的pH，使蛋白質(zhì)所帶正負電荷相等，凈電荷為零時，溶液的pH，稱為蛋白質(zhì)的等電點(pI)。

一般地說，含酸性氨基酸較多的蛋白質(zhì)為酸性蛋白，其等電點也偏酸，含堿性氨基酸較多的蛋白質(zhì)為堿性蛋白，等電點偏堿。如與DNA共同構(gòu)成核蛋白的組蛋白。當(dāng)溶液的pH>pI時，蛋白質(zhì)帶負電荷，pH<pI時，蛋白質(zhì)帶正電荷。

注意電泳緩沖液的pH，蛋白質(zhì)帶何種電荷就向何方向泳動盤狀電泳。

四．蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

蛋白質(zhì)分子大小約為直徑1—100nm，達到膠體質(zhì)點范圍，因此具有膠體溶液的布朗運動，光散射現(xiàn)象，不能透過半透膜以及具有吸附能力，所以蛋白質(zhì)水溶液是一種膠體，是一種比較穩(wěn)定的親水膠體。蛋白質(zhì)形成親水膠體有兩個基本穩(wěn)定因素：

1）、蛋白質(zhì)表面具有水化膜

2）、蛋白質(zhì)表面具有同性電荷這兩個因素被破壞，則蛋白質(zhì)沉淀。五．蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)

precipitationreaction

由于蛋白質(zhì)表面水化膜和蛋白質(zhì)表面同性電荷發(fā)生變化，蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的沉淀。蛋白質(zhì)的沉淀有以下幾種方法：

1）中性鹽沉淀、2）有機溶劑的沉淀、

3）加熱沉淀、4）重金屬鹽沉淀、

5）等電點沉淀、6）生物堿試劑的沉淀。要強調(diào)的是denaturation與precipitation是兩個不同的概念，p91中性鹽沉淀反應(yīng)鹽溶作用：蛋白質(zhì)在低鹽濃度下溶解度增加的現(xiàn)象。鹽析：高鹽濃度時，因為破壞蛋白質(zhì)水化膜并中和電荷，促使蛋白質(zhì)顆粒相互聚集而沉淀，稱為鹽析作用。最常用的中性鹽為(NH4)2SO4。鹽析沉淀出的蛋白質(zhì)不變性，所以多用于酶，激素等具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)的分離制備。有機溶劑沉淀

可與水混合的有機溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等，對水的親和力很大，能破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化膜，使蛋白質(zhì)沉淀。 在常溫下，有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引起變性，例如酒精消毒滅菌就是如此。但若在低溫條件下，則變性進行較緩慢，可用于分離制備各種血漿蛋白質(zhì)。

加熱沉淀反應(yīng)

加熱可以使蛋白質(zhì)變性沉淀，但偏酸或偏堿（需遠離pI）加熱雖然仍能使蛋白質(zhì)變性，但不容易產(chǎn)生沉淀。

重金屬鹽沉淀反應(yīng)堿性環(huán)境

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在pH>pI溶液中時，帶負電荷，可與重金屬離子如汞、鉛、銅、銀等結(jié)合成不溶性的蛋白鹽而沉淀。臨床上搶救重金屬鹽中毒的病人時，給予大量蛋白質(zhì)（生蛋清或牛奶）以生成蛋白鹽以減少重金屬離子的吸收。在重金屬鹽類沉淀蛋白質(zhì)時，實驗發(fā)現(xiàn)重金屬鹽不可過多，過多就會使沉淀消失，如過量CuSO4和AgNO3。生物堿試劑的沉淀反應(yīng)

原理與重金屬鹽沉淀反應(yīng)相反，即蛋白質(zhì)在pH<pI的酸性環(huán)境中時，帶正電荷，可以與生物堿試劑(如苦味酸、鎢酸、三氯醋酸、鞣酸)以及某些酸(如過氯酸、硝酸)的酸根負離子結(jié)合成不溶性的鹽而沉淀。六．蛋白質(zhì)顏色反應(yīng)P91表4-11

茚三酮反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)酚試劑法茚三酮反應(yīng)

在pH5-7時，蛋白質(zhì)與茚三酮加熱產(chǎn)生藍紫色，它是對α-NH2的反應(yīng)，所以蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸以及伯胺類化合物均呈陽性反應(yīng)。所以Glu（+）雙縮脲反應(yīng)

堿性條件下，蛋白質(zhì)與Cu2+產(chǎn)生紫紅色反應(yīng)，它針對蛋白質(zhì)分子中肽鍵的反應(yīng)，用于定性與定量，以及測定蛋白質(zhì)水解程度。比較氨基酸