基因工程的基本操作程序（第1課時(shí)）課件-高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第2節(jié)基因工程的基本操作程序第1課時(shí)能說(shuō)出基因工程的基本操作程序。能說(shuō)出目的基因篩選與獲取的常用方法。能闡明PCR技術(shù)的原理、條件、過(guò)程。普通棉花轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉將蘇云金桿菌中的Bt抗蟲(chóng)蛋白基因轉(zhuǎn)入普通棉花如何能培育出自身就能抵抗蟲(chóng)害的棉花新品種呢？資料：蘇云金桿菌通過(guò)產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲(chóng)蛋白），破壞鱗翅目昆蟲(chóng)的消化系統(tǒng)來(lái)殺死棉鈴蟲(chóng)?？茖W(xué)家將“殺蟲(chóng)基因”轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生Bt抗蟲(chóng)蛋白抵抗蟲(chóng)害。目的基因從社會(huì)中來(lái)培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程蘇云金桿菌普通棉花（無(wú)抗蟲(chóng)特性）棉花細(xì)胞抗蟲(chóng)棉提取表達(dá)Bt基因?qū)肱c載體拼接重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲?。ㄇ疤幔?.基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（關(guān)鍵）4.目的基因的檢測(cè)與鑒定（保證）Bt基因從社會(huì)中來(lái)一、目的基因的篩選與獲取在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因就是目的基因。根據(jù)需求的不同，目的基因也不同，主要指編碼蛋白質(zhì)的基因，如遇生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。

抗逆性、毒物降解等生產(chǎn)藥物、工業(yè)用酶重組人胰島素注射液轉(zhuǎn)基因番木瓜

它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉1.目的基因蘇云金桿菌制成殺蟲(chóng)劑掌握目的基因的功能掌握目的基因的結(jié)構(gòu)防治棉花害蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)殺蟲(chóng)作用與Bt基因有關(guān)掌握Bt基因的序列深入了解Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物(Bt抗蟲(chóng)蛋白)Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉較為合適的目的基因2.獲取目的基因常用的方法①?gòu)纳锝M織中直接獲?、趶幕蛭膸?kù)中獲?、廴斯ず铣散芾肞CR獲取和擴(kuò)增目的基因基因比較小、核苷酸序列已知通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成基因組文庫(kù)（某生物全部基因）部分基因文庫(kù)（主要是cDNA文庫(kù)）前提：方法：基因文庫(kù)的類(lèi)型基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)（主要是cDNA文庫(kù)）基因組文庫(kù)的構(gòu)建提取某生物全部DNA用適當(dāng)限制酶切割許多DNA片段該生物基因組文庫(kù)每個(gè)受體菌含有一段不同的DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌群含有某種生物全部基因片段的重組DNA的克隆群體②從基因文庫(kù)中獲取含有某種生物部分基因片段的重組DNA的克隆群體。cDNA文庫(kù)的構(gòu)建——mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成mRNA雜交雙鏈單鏈DNA雙鏈cDNA(cDNA)該生物cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)中的基因含有啟動(dòng)子、終止子、內(nèi)含子，cDNA文庫(kù)中的基因不含以上結(jié)構(gòu)。與載體連接導(dǎo)入受體菌群逆轉(zhuǎn)錄酶核酸酶HDNA聚合酶某一發(fā)育時(shí)期質(zhì)粒質(zhì)粒cDNA片段逆轉(zhuǎn)錄酶導(dǎo)入細(xì)菌中逆轉(zhuǎn)錄cDNAmRNAcDNA文庫(kù)細(xì)胞基因組DNA質(zhì)粒質(zhì)粒DNA片段導(dǎo)入細(xì)菌中基因組文庫(kù)文庫(kù)類(lèi)型cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)大小基因中啟動(dòng)子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無(wú)有無(wú)有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以④利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因PCR擴(kuò)增儀蘇云金桿菌Bt基因？快速獲得大量Bt基因提取1.說(shuō)出PCR的概念、原理、目的、優(yōu)點(diǎn)。2.結(jié)合體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程，思考PCR的進(jìn)行需要哪些條件？所需設(shè)備是什么？3.構(gòu)建出PCR的大致過(guò)程；PCR擴(kuò)增為什么需要引物？4.如何對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定？PCR技術(shù)與DNA復(fù)制過(guò)程有哪些異同？請(qǐng)同學(xué)們自主閱讀教材P77-79，小組合作思考討論完成問(wèn)題。

二、PCRPCR擴(kuò)增（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外（PCR擴(kuò)增儀）提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。原理操作環(huán)境緩沖溶液、DNA模板、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、與兩條模板鏈結(jié)合的2種引物。目的及優(yōu)點(diǎn)：可在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因1.概念DNA復(fù)制的條件:原則:③能量：親代DNA的兩條鏈4種游離的脫氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接酶等由細(xì)胞代謝提供的ATP①模板：②原料：④酶：

堿基互補(bǔ)配對(duì)原則從子鏈的5'端向3'端延伸方向:特點(diǎn):邊解旋邊復(fù)制、半保留復(fù)制

、多起點(diǎn)雙向復(fù)制體外復(fù)制怎么改進(jìn)體外用高溫代替體外需用耐高溫的DNA聚合酶子鏈合成需要引物

引物為DNA聚合酶提供了游離的3′端，使DNA聚合酶從3′端延伸子鏈。(DNA聚合酶不具有從頭合成子鏈的功能)溫故而知新

引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。用于PCR的引物通常為20~30個(gè)核苷酸。在細(xì)胞中為一段單鏈RNA，在PCR中為一段人工合成的單鏈DNA。什么是引物子鏈延伸子鏈延伸引物是決定PCR特異性的關(guān)鍵-5′3′-引物5′--3′5′--3′引物3′--5′微量離心管緩沖液

PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進(jìn)行。真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2+

激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2+。DNA模板四種脫氧核苷酸(dNTP)引物分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種引物耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）2.所需原料3.過(guò)程耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）4種脫氧核苷酸（dNTP）引物待擴(kuò)增的DNA片段（模板）5’5’

變性

復(fù)性

延伸溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。長(zhǎng)度相同但C-G含量高的引物需要設(shè)定的復(fù)性溫度較高DNA解鏈為單鏈高溫(95℃)變性低溫(50℃)復(fù)性中溫(72℃)延伸引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈Taq酶從引物起始進(jìn)行子鏈的合成PCR過(guò)程可以在PCR擴(kuò)增儀(PCR儀)中自動(dòng)完成。第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)模板，經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)產(chǎn)物。5′--3′3′-5’3′--5′5′--3′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)模板，經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪循環(huán)產(chǎn)物。每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加_____，即呈_____形式擴(kuò)增（約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。一倍指數(shù)4.PCR相關(guān)計(jì)算長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA____個(gè)含有引物A的DNA____個(gè)含有引物B的DNA____個(gè)211引物A引物B擴(kuò)增一次中長(zhǎng)鏈-短鏈DNA____個(gè)2長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA____個(gè)含有引物A的DNA____個(gè)含有引物B的DNA____個(gè)233擴(kuò)增兩次中長(zhǎng)鏈-短鏈DNA____個(gè)4長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA____個(gè)含有引物A的DNA____個(gè)含有引物B的DNA____個(gè)277短鏈-短鏈DNA______個(gè)2出現(xiàn)完整的目的基因

擴(kuò)增三次中長(zhǎng)鏈-短鏈DNA____個(gè)長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA____個(gè)含有引物A的DNA____個(gè)含有引物B的DNA____個(gè)短鏈-短鏈DNA______個(gè)擴(kuò)增四次2815156擴(kuò)增次數(shù)1次2次3次4次n次DNA總數(shù)212223242n長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA中長(zhǎng)鏈-短鏈DNA短鏈-短鏈DNA含引物A(或B)的DNA20022240226822(n-1)2n-2n137152n-14.PCR相關(guān)計(jì)算一個(gè)DNA，一對(duì)引物（A與B），通過(guò)PCR擴(kuò)增n次：①子代DNA分子數(shù)為：___個(gè)②子代DNA分子中含模板鏈DNA分子數(shù)為：__個(gè)③子代含有的目的基因數(shù)目：_____個(gè)④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子數(shù)為：______個(gè)⑤復(fù)制過(guò)程中共需引物_______個(gè)⑥第n次復(fù)制需要引物___個(gè)2n22n-12n＋1-22n2n-2n1.復(fù)性過(guò)程一定是引物與DNA模板鏈結(jié)合嗎？

復(fù)性時(shí)引物與DNA模板的結(jié)合是隨機(jī)的，也存在解開(kāi)的兩條DNA單鏈的結(jié)合，但兩條模板鏈重新結(jié)合的概率較低。原因是①模板鏈一般比較長(zhǎng)，比引物復(fù)雜得多，重新結(jié)合的概率較低。②加入引物的量足夠多，而模板鏈數(shù)量少，引物與模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞機(jī)會(huì)?！就卣寡由?】2.延伸時(shí)需要加入兩種引物，原因是什么？

DNA是反向平行的雙鏈，DNA聚合酶只能從引物3′端延伸DNA鏈，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時(shí)被擴(kuò)增。3.兩種引物的要求：①引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列；②引物5'端可以修飾，3'端不可修飾；③引物長(zhǎng)度不宜過(guò)短，防止引物隨機(jī)結(jié)合。【拓展延伸1】PCR引物的設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增高效性。1.引物設(shè)計(jì)需考慮的兩個(gè)因素?cái)U(kuò)增特異性擴(kuò)增高效性引物特異性：只擴(kuò)增出目標(biāo)DNA的特性高效性：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物的量特異性太強(qiáng)，擴(kuò)增效率就會(huì)下降，提高擴(kuò)增效率，擴(kuò)增特異性就會(huì)下降【拓展延伸2】2.引物設(shè)計(jì)的原則（1）引物長(zhǎng)度

一般在20-30堿基之間。過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，

不適于Taq酶進(jìn)行反應(yīng)。過(guò)短特異性差。（2）引物G-C含量一般在40%~60%之間，G-C含量過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。（4）復(fù)性溫度復(fù)性溫度高，擴(kuò)增特異性強(qiáng)，復(fù)性溫度低，擴(kuò)增效率高。

如果引物堿基數(shù)較少，可以適當(dāng)提高復(fù)性溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當(dāng)降低復(fù)性溫度，使DNA雙鏈結(jié)合。一對(duì)引物的復(fù)性溫度相差4℃～6℃不會(huì)影響PCR的產(chǎn)率，但是理想情況下一對(duì)引物的復(fù)性溫度是一樣的。（3）引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列

堿基要隨機(jī)分布，且引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物之間配對(duì)結(jié)合，從而影