基因工程的基本操作程序（第3課時(shí)）-高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第2節(jié)

基因工程的基本操作程序第3課時(shí)1.目的基因的篩選和獲取-前提利用PCR獲取和擴(kuò)增人工合成2.構(gòu)建基因表達(dá)載體-核心目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞-關(guān)鍵農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(植物)、顯微注射法(動(dòng)物)、

感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法(微生物);4.目的基因的檢測(cè)與鑒定-保證分子檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯個(gè)體水平：是否具有抗性以及抗性強(qiáng)度等基因工程的基本操作程序檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因方法：PCR等技術(shù)提取DNA根據(jù)目的基因的序列設(shè)計(jì)PCR引物PCR操作是否擴(kuò)增出目的基因瓊脂糖凝膠電泳DNA測(cè)序技術(shù)你知道PCR會(huì)擴(kuò)增出哪些不同的片段嗎？只含目的基因片段目的基因在整個(gè)DNA片段的中央位置復(fù)制3次后這兩個(gè)DNA分子量相同嗎？種類1種類2種類3種類4種類5怎么鑒定PCR的產(chǎn)物？電泳?、貾CR利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)調(diào)節(jié)溫度來(lái)控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。②PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了DNA半保留復(fù)制的原理。探究·實(shí)踐：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1.實(shí)驗(yàn)原理(1)PCR在體外進(jìn)行DNA片段的擴(kuò)增原理(2)DNA片段電泳鑒定的原理①DNA分子具有____________，在一定的____下，這些基團(tuán)可以帶上________________。在_________的作用下，這些___________會(huì)向著__________________的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是電泳?？山怆x的基團(tuán)pH正電荷或負(fù)電荷帶電分子與它所帶電荷相反電場(chǎng)②PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。③凝膠中的DNA分子通過(guò)染色，可以在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來(lái)。一般使用的電泳緩沖液pH=8，DNA分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中DNA便向正極移動(dòng)。電泳：

在電場(chǎng)的作用下，DNA、RNA、蛋白質(zhì)等這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是電泳。正極負(fù)極電場(chǎng)力瓊脂糖凝膠濃度（%）分離DNA分子大?。↘b）遷移速率0.61～20慢快0.70.8～100.90.5～71.20.4～61.50.2～42.00.1～3瓊脂糖凝膠濃度越大，分離的DNA分子越小，遷移速率越快DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度關(guān)系PCR儀2.材料用具①PCR儀（自動(dòng)控溫，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增）②微量離心管（實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）(1)用具：微量離心管2.材料用具①4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴(kuò)增緩沖液、無(wú)菌水、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等。②PCR反應(yīng)體系的配方(見教材)。(2)材料：PCR反應(yīng)體系的配方10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液(含Mg2+)5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液(實(shí)為dNTP)1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1～5U/μL的TaqDNA聚合酶(即為耐高溫的DNA聚合酶)1～2U模板DNA(1pg～1μg)5～10μL總體積50μL三點(diǎn)提醒在PCR過(guò)程中實(shí)際加入的為dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。引物既可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈。細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，也需要引物，一般為RNA片段；PCR引物一般為DNA片段。真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2＋。1233.方法步驟(1)DNA片段的擴(kuò)增用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說(shuō)明書，在微量離心管中依次加入各組分。待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）。使DNA充分變性，以利于引物更好地與模板結(jié)合。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃，5min30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。移液離心擴(kuò)增PCR實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程[思考]為什么最后1次變性時(shí)間延長(zhǎng)？

TaqDNA聚合酶活性會(huì)隨著循環(huán)次數(shù)增加而下降。在每一輪循環(huán)中，部分片段可能沒有完全延伸完，TaqDNA聚合酶就脫落了。最后1次變性時(shí)間延長(zhǎng)，讓這些DNA打開，重新延伸。3.方法步驟(2)DNA片段的電泳鑒定配制瓊脂糖溶液根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。制備凝膠加樣電泳觀察記錄

常用的核酸染色劑有EB(溴化乙錠)、GoldView等，EB能插入DNA分子中的堿基對(duì)之間，導(dǎo)致EB與DNA結(jié)合。嵌入核酸堿基間的EB能吸收300nm波長(zhǎng)的紫外光，發(fā)出可見熒光。其熒光強(qiáng)度與DNA分子的含量成正比。(2)DNA片段的電泳鑒定配制瓊脂糖溶液根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。制備凝膠將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過(guò)凝膠1mm為宜。加樣電泳觀察記錄(2)DNA片段的電泳鑒定配制瓊脂糖溶液根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。制備凝膠將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過(guò)凝膠1mm為宜。加樣將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物。電泳觀察記錄(2)DNA片段的電泳鑒定配制瓊脂糖溶液根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。制備凝膠將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過(guò)凝膠1mm為宜。加樣將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物。電泳接通電源，根據(jù)電泳槽陽(yáng)極至陰極之間的距離來(lái)設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳。觀察記錄取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。DNA片段的電泳結(jié)果①為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。②該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購(gòu)買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。③在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。④在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。⑤PCR擴(kuò)增不能隨意加大試劑用量。4.操作提示(1)你是否成功擴(kuò)增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？

可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細(xì)程度來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果。

若出現(xiàn)一條條帶，表明PCR擴(kuò)增是成功的。5.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)

如果擴(kuò)增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)?。如果擴(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；復(fù)性溫度過(guò)低；DNA聚合酶的質(zhì)量不好等。5.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)(2)如果擴(kuò)增不成功，可能的原因有？如果不止一條條帶，請(qǐng)分析產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的可能原因。1.用PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時(shí)，得到以下電泳圖譜，其中1號(hào)為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣液(Marker)，10號(hào)為蒸餾水。PCR時(shí)加入的模板DNA如圖所示。據(jù)此做出分析不合理的是(

)A.PCR產(chǎn)物的分子大小在250至500bp之間B.3號(hào)樣品為不含目的基因的載體DNAC.9號(hào)樣品對(duì)應(yīng)植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株D.10號(hào)的電泳結(jié)果能確定反應(yīng)體系等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有干擾B2．下列有關(guān)電泳的敘述，錯(cuò)誤的是（

）

A．電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程

B．待測(cè)樣品中DNA分子的大小和構(gòu)象、凝膠的濃度等都會(huì)影響DNA

在電泳中的遷移速率

C．進(jìn)行電泳時(shí)，帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相同的電極移動(dòng)

D．PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定C3.下圖為轉(zhuǎn)基因抗凍番茄培育過(guò)程的示意圖（其中ampr為抗氨芐青霉素基因）。下列敘述錯(cuò)誤的是（）A．④過(guò)程中可利用目的基因作為探針對(duì)植株進(jìn)行篩選B．可同時(shí)選用限制酶PstI、SmaI對(duì)含目的基因的DNA進(jìn)行剪切C．過(guò)程②可采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將含目的基因的表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞D．質(zhì)粒上的抗性基因有利于篩選含目的基因的細(xì)胞和促進(jìn)目的基因的表達(dá)D4.設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理(如下圖)，請(qǐng)分別說(shuō)明理由。(1)第1組：

；

第2組：