T-GRM 097-2024 耐鹽深色有隔內(nèi)生真菌篩選與鑒定技術(shù)體系

ICS13.020.01CCSD00/09GRM系ScreeningandIdentificationofSaltTolerantDIT/GRM097—2024前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 3.1耐鹽深色有隔內(nèi)生真菌（SalttolerantDarkSeptateEndophytes，STDSE） 3.2耐鹽性（SaltTolerance） 3.3篩選（Screening） 3.4分離（Isolation） 3.5形態(tài)學(xué)鑒定（MorphologicalIdentification 3.6分子學(xué)鑒定（MolecularIdentification 3.7菌落直徑（ColonyDiameter） 3.8梯度鹽脅迫固體培養(yǎng)基（SaltStressMedium） 3.9菌絲生長速率（MycelialGrowthRate） 23.10菌落抑制率（ColonyInhibitionRate） 24操作規(guī)程 24.1耐鹽深色有隔內(nèi)生真菌的分離純化與保藏參照附錄A執(zhí)行。 24.2耐鹽深色有隔內(nèi)生真菌的鑒定參照附錄B執(zhí)行。 24.3耐鹽深色有隔內(nèi)生真菌的耐鹽性參照附錄C執(zhí)行。 25耐鹽性評價 25.1形態(tài)學(xué)特性 25.2分子鑒定 25.3耐鹽性 26包裝、運(yùn)輸和貯存 26.1包裝 26.2運(yùn)輸 26.3貯存 2附錄A（規(guī)范性）耐鹽深色有隔內(nèi)生真菌的分離純化與保藏 3A.1供試材料 3A.2儀器設(shè)備 3A.3篩選步驟 3附錄B（規(guī)范性）耐鹽深色有隔內(nèi)生真菌的鑒定 4B.1供試材料 4B.2儀器設(shè)備 4B.3深色有隔內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定 4B.4深色有隔內(nèi)生真菌的分子生物學(xué)鑒定 4附錄C（規(guī)范性）耐鹽深色有隔內(nèi)生真菌的耐鹽性 5C.1供試材料 5T/GRM097—2024C.2儀器設(shè)備 5C.3操作步驟 5C.4結(jié)果計算 5T/GRM097—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。耐鹽深色有隔內(nèi)生真菌（SalttolerantDarkSeptateEndophytes，STDSE）是一類存在于植物體內(nèi)、具有特殊生態(tài)適應(yīng)性的重要微生物資源，廣泛分布于鹽堿地及其他逆境環(huán)境中。該類真菌在提高宿主植物耐鹽性、促進(jìn)植物生長、改善鹽堿地土壤生態(tài)功能方面具有重要潛力。耐鹽深色有隔內(nèi)生真菌的篩選與鑒定流程團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的制定，包括樣品采集、真菌分離培養(yǎng)、耐鹽性評價及真菌鑒定等關(guān)鍵步驟，建立科學(xué)、易操作的篩選和鑒定技術(shù)體系，為耐鹽真菌資源的開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)與技術(shù)指導(dǎo)。這不僅有助于提高耐鹽深色有隔內(nèi)生真菌的篩選效率和鑒定準(zhǔn)確性，也為鹽堿地生態(tài)環(huán)境的恢復(fù)與可持續(xù)發(fā)展提供了可行的技術(shù)支持。本文件由中關(guān)村綠色礦山產(chǎn)業(yè)聯(lián)盟提出并歸口。本文件起草單位：西安科技大學(xué)西部礦山生態(tài)環(huán)境修復(fù)研究院、中國礦業(yè)大學(xué)（北京）礦山生態(tài)修復(fù)研究院、天山實(shí)驗(yàn)室、北京合生元生態(tài)環(huán)境工程技術(shù)有限公司。本文件主要起草人：畢銀麗、彭蘇萍、張士雙、譚海、全文智、武超、解琳琳、肖禮、王坤、柯增鳴、白雪蕊、張延旭1T/GRM097—2024耐鹽深色有隔內(nèi)生真菌篩選與鑒定技術(shù)體系本文件規(guī)定了耐鹽深色有隔內(nèi)生菌分離篩選樣品的采集、分離、培養(yǎng)、耐鹽性評價及鑒定貯存等要本文件適用于從鹽堿地區(qū)植物內(nèi)生組織中分離篩選耐鹽深色有隔內(nèi)生真菌。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定GB/T603化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備GB19489-2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T5009.5-2016食品中還原糖的測定《微生物分類鑒定手冊》NY/T3833-2021微生物肥料菌種保藏技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1耐鹽深色有隔內(nèi)生真菌（SalttolerantDarkSeptateEndophytes，STDSE）耐鹽深色有隔內(nèi)生真菌是指一類能夠在高鹽環(huán)境中生存、與植物共生而不引起病害的真菌，其菌絲體呈現(xiàn)深色且具有明顯的橫隔結(jié)構(gòu)。3.2耐鹽性（SaltTolerance）微生物或植物在一定濃度鹽分（如NaCl）存在下維持正常生長和代謝活動的能力。3.3篩選（Screening）通過設(shè)定不同鹽濃度梯度，比較菌株的生長特性，從中篩選出耐鹽性強(qiáng)的目標(biāo)真菌。3.4分離（Isolation）從植物樣本中獲取單一菌種的過程，包括樣本處理、消毒、培養(yǎng)及分離純化步驟，最終得到內(nèi)生真菌的純培養(yǎng)物。3.5形態(tài)學(xué)鑒定（MorphologicalIdentification）：通過觀察微生物的物理特征（如形狀、大小、顏色、菌絲和孢子結(jié)構(gòu)）和生長特性識別和分類微生物的方法。3.6分子學(xué)鑒定（MolecularIdentification）：通過分析微生物的DNA或RNA序列來確定其種類和關(guān)系的方法。3.7菌落直徑（ColonyDiameter）真菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)一定時間后，菌落的直徑大小，通常作為表征菌體生長狀況的重要指標(biāo)之3.8梯度鹽脅迫固體培養(yǎng)基（SaltStressMedium）2T/GRM097—2024鹽脅迫培養(yǎng)基是指培養(yǎng)基中添加了一定濃度的鹽（如NaCl模擬極端鹽脅迫環(huán)境，研究微生物在鹽堿條件下的生長、適應(yīng)性和耐鹽性。3.9菌絲生長速率（MycelialGrowthRate）指單位時間內(nèi)真菌菌絲在培養(yǎng)基表面或內(nèi)部的延伸速度，通常通過測量菌落直徑的日增長量來表示。3.10菌落抑制率（ColonyInhibitionRate）指在特定鹽脅迫環(huán)境條件下，菌株菌落直徑相比對照組的生長抑制程度。4操作規(guī)程4.1耐鹽深色有隔內(nèi)生真菌的分離純化與保藏參照附錄A執(zhí)行。4.2耐鹽深色有隔內(nèi)生真菌的鑒定參照附錄B執(zhí)行。4.3耐鹽深色有隔內(nèi)生真菌的耐鹽性參照附錄C執(zhí)行。5耐鹽性評價5.1形態(tài)學(xué)特性菌絲呈深色，顯微鏡下觀察到明顯的有隔結(jié)構(gòu)，符合深色有隔真菌的形態(tài)特征。5.2分子鑒定分子鑒定結(jié)果顯示，菌株ITS序列與已知的深色有隔真菌類群相似性≥95%。5.3耐鹽性在≥3%（w/v）的NaCl濃度下，菌株能正常生長，菌落直徑顯著高于對照組50%以上，且具有較強(qiáng)的耐鹽適應(yīng)能力（在6%以上仍能生長）。若分離菌株滿足以上三個方面的標(biāo)準(zhǔn)，即可判定為耐鹽深色有隔內(nèi)生真菌，并可納入后續(xù)應(yīng)用或資源庫保藏。6包裝、運(yùn)輸和貯存6.1包裝液體狀態(tài)產(chǎn)品使用0.2μm濾膜的透氣蓋棕色培養(yǎng)瓶進(jìn)行包裝。固體產(chǎn)品使用直徑90mm的培養(yǎng)皿封裝，并用無菌封口膜對培養(yǎng)皿進(jìn)行密閉處理，操作在無菌環(huán)境中進(jìn)行。孢子粉末產(chǎn)品使用EP管或者使用密封性良好的玻璃瓶（內(nèi)加干燥劑）進(jìn)行包裝。6.2運(yùn)輸運(yùn)輸過程中液體狀態(tài)產(chǎn)品勿倒置，固體產(chǎn)品避免重壓和碰撞，所有產(chǎn)品皆需低溫（2-8℃)運(yùn)輸并且必須按照貨物運(yùn)輸規(guī)定進(jìn)行，切勿與人體和土壤有害的物品混裝。6.3貯存液體和固體產(chǎn)品應(yīng)放于低溫（2-8℃)避光的環(huán)境中。濕度保持在50%-70%范圍內(nèi)，保持保存環(huán)境的密閉性。孢子粉應(yīng)放于低溫（2-8℃)避光干燥的環(huán)境中并保持保存環(huán)境的密閉性。3T/GRM097—2024（規(guī)范性）耐鹽深色有隔內(nèi)生真菌的分離純化與保藏A.1供試材料植物材料：選取鹽堿環(huán)境下的健康植物的細(xì)根。分離培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potatodextroseagar，PDA）實(shí)驗(yàn)試劑：無水乙醇，次氯酸鈉，氨芐青霉素、硫酸鏈霉素。A.2儀器設(shè)備電子天平（感量0.01g），無菌操作臺，超純水系統(tǒng)，高壓蒸汽滅菌鍋（137℃,0.25MPa），恒溫培養(yǎng)箱。A.3篩選步驟A.3.1樣本采集隨機(jī)選取樣地內(nèi)長勢良好的植物，去除植株根圍枯枝落葉層，在距植株主干0-30cm范圍內(nèi)選取新鮮的健康的細(xì)根樣品，并標(biāo)記（取樣植物，取樣時間，取樣地點(diǎn)）。A.3.2內(nèi)生真菌的分離將植物根段用去離子水洗滌干凈，在75%（v/v）乙醇中消毒5min；然后用10%（v/v）次氯酸鈉消毒5min，去無菌水漂洗3次并在無菌濾紙上干燥。滅菌處理后的根段用無菌的剪刀將根段剪成3-5cm左右的小段放入PDA培養(yǎng)基（50mg·L-1氨芐青霉素和50mg·L-1硫酸鏈霉素）中，在27℃下倒置黑暗培養(yǎng)，并每天觀察。將根段上長出的深色菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基再行培養(yǎng)和純化。A.3.3深色有隔內(nèi)生真菌的純化培養(yǎng)基上有新菌絲長出時，及時用滅過菌的接種針將菌絲邊緣連同少量培養(yǎng)基挑到新的PDA平板上，反復(fù)挑取3~A次，直至獲得單一菌株，并對菌株命名編號。A.3.4深色內(nèi)生真菌的純化判定標(biāo)準(zhǔn)菌落的形態(tài)和顏色一致，無雜色；并通過顯微鏡觀察，確認(rèn)菌絲形態(tài)特征是有橫隔結(jié)構(gòu)。A.3.5消毒可靠性檢驗(yàn)將洗滌液涂布于PDA固體培養(yǎng)基，設(shè)為對照，用于檢查消毒效果。具體操作步驟如下：取100μL表面消毒最后一次沖洗后的無菌水，涂布在PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)，觀察是否有菌絲長出，檢驗(yàn)表面消毒效果。如果對照有菌絲長出，視為試驗(yàn)失敗，需重新進(jìn)行分離。A.3.6菌種保藏對分離的深色有隔內(nèi)生真菌進(jìn)行4℃保存和冷凍干燥保藏。具體操作參照標(biāo)準(zhǔn)NY/T3833-2021。4T/GRM097—2024（規(guī)范性）耐鹽深色有隔內(nèi)生真菌的鑒定B.1供試材料菌株：分離菌株。活化培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potatodextroseagar，PDA）實(shí)驗(yàn)試劑：無水乙醇，次氯酸鈉，氨芐青霉素、硫酸鏈霉素、氯化鈉、Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、DreamTaq-TMDNAPolymerase、dNTP、瓊脂糖、SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒、DNALadderMixmaker引物、槍頭、PCR管、離心管、pMDl8-TVector連接試劑盒和SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒。B.2儀器設(shè)備電子天平（感量0.01g），超純水系統(tǒng)，高壓蒸汽滅菌鍋（137℃,0.25MPa），恒溫?fù)u床，恒溫培-8℃~10℃)。B.3深色有隔內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定將純化后的內(nèi)生真菌繼續(xù)接種到PDA培養(yǎng)基上，依據(jù)《真菌鑒定手冊》中形態(tài)學(xué)鑒定的方法對內(nèi)生真菌的顏色、生長速度和菌落形態(tài)進(jìn)行定期觀察和記錄。B.4深色有隔內(nèi)生真菌的分子生物學(xué)鑒定B.4.1菌種活化將鑒定得到的深色有隔內(nèi)生真菌活化，用無菌打孔器在菌落邊緣切取直徑5mm的菌餅，置于PDA培養(yǎng)基中，28℃黑暗培養(yǎng)10d，以保證其菌絲和孢子的活力。B.4.2DNA提取挑取50mg左右的深色有隔內(nèi)生真菌菌絲，參照真菌基因組DNA提取試劑盒（上海生工）的方法提取深色有隔內(nèi)生真菌DNA。B.4.3擴(kuò)增提取出的DNA用于ITS序列的擴(kuò)增。擴(kuò)增引物為真菌ITS基因序列通用引物，上游引物：ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’），下游引物：ITS4-R（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR反應(yīng)體系如下（25μL）：10XPCRbuffer、dNTP（各10mM）、TaqPlusDNAPolymerase），PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec,57℃退火30sec，72℃延伸90sec，共30個循環(huán)；72℃修復(fù)延伸10min。B.4.4測序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后，凝膠成像儀下觀察，可以看到700bp左右的條帶。PCR產(chǎn)物回收參照SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒說明書，回收產(chǎn)物送商業(yè)公司測序。B.4.5序列比對利用Blast（/Blast.cgi）將待測菌株的ITS序列與Genbank中已知真菌的ITS序列進(jìn)行比對。將測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列導(dǎo)入到ClustalX1.83中進(jìn)行校準(zhǔn)對齊，通過MEGA5.05將待測菌與標(biāo)準(zhǔn)菌的序列進(jìn)行對比，計算出進(jìn)化距離并用neighbor-joining法建樹，BacillussubtilisNCDO1769作為外群，采用Bootstrap法，重復(fù)次數(shù)為1000。5T/GRM097—2024（規(guī)范性）