藻種培養(yǎng)方法

藻種培養(yǎng)方法一、

藻種的兩種培養(yǎng)類型一般來說藻種的培養(yǎng)有兩種方式：一種是長期保存所需要的培養(yǎng)方法，一種是以實驗為目的，短期內保藏藻種的培養(yǎng)方法。長期培養(yǎng)最主要的問題是選擇一種合適的培養(yǎng)基，可以在3個月到一年的時間內連續(xù)培養(yǎng)藻種。最適合長期培養(yǎng)藻種的培養(yǎng)基是agar（固體瓊脂培養(yǎng)基），但是使用agar有一個弊端，即培養(yǎng)物保持無菌的問題；我們可以加一層蒸餾水（咸水的藻類可以加滅菌過人工的海水）在agar上，這種做法可以保證在長期保種的過程中減少agar水分和營養(yǎng)的流失。長期保種使用的培養(yǎng)基，不要選擇營養(yǎng)過于豐富的，因為多數(shù)的藻，尤其是絲狀藻，在營養(yǎng)豐富的環(huán)境生長，會發(fā)生形態(tài)結構上的變化，如果要做生理生態(tài)方面研究，實驗材料的形態(tài)結構是不能異常的。適合長期保種的貧營養(yǎng)的培養(yǎng)基有這些：Bold’s基礎培養(yǎng)基，以及該培養(yǎng)基加上蛋白胨或者瓊脂制成的agar，適合長期培養(yǎng)綠藻；Allen及其改良后的配方可以長期培養(yǎng)一般常見的藍藻和綠藻；土水培養(yǎng)基和它的一個改良的系列也實用培養(yǎng)多數(shù)藻種。對于我?guī)焯峁┑脑宸N，由于藻種長期習慣的原因，建議使用我們提供的原配方來培養(yǎng)，在長期培養(yǎng)的時候，可以適當稀釋原培養(yǎng)基，在藻種培養(yǎng)過程中，生長速率會變慢，可以保持其形態(tài)結構不變。另外，長期培養(yǎng)的時候，除了選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)基，還可以降低溫度5～8C（降溫的過程最好能循序漸進，突然改變環(huán)境溫度，可能會導致藻種不適應而死亡）。光照強度可以減小為原先的一半。在實驗之前3到4周，將長期培養(yǎng)的藻種接種到我們提供的培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基必須滅菌），按照我們給予的培養(yǎng)條件培養(yǎng)，在實驗前6天左右，再次接種。短期培養(yǎng)則可以直接按照我們提供的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件培養(yǎng)。由于試驗的需要，常常要求在短期時間內獲得大量的培養(yǎng)物，我們可以采用通氣培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)。通氣培養(yǎng)可以通CO2或潔凈的空氣，視培養(yǎng)物的多少來決定通氣泵的大小，在通氣的硅膠管中設置一個緩沖瓶，塞上滅菌后的脫脂棉，幫助凈化空氣，如果對通氣有更高的要求，可以在通氣管中加上一層濾膜。使用搖床培養(yǎng)，需要注意藻種的生理周期。二、

培養(yǎng)基的選擇和配制1、培養(yǎng)基的選擇①

BG11是我?guī)炫囵B(yǎng)藍藻使用最廣泛的培養(yǎng)基。除了極少部分藍藻，大部分都使用BG11。按照我們給的配方配制好后高壓滅菌，BG11經常會產生絮狀沉淀。這是因為其中有Ca+和CO32-,我們可以在滅菌后再超凈臺上用滅菌過的注射器來加兩者之中的另外一種。通常我們建議將氯化鈣的母液單獨滅菌后在無菌室保存，在配置好BG11的工作液并滅菌之后，在超凈臺上用注射器將氯華鈣加入。②

SE是我?guī)煊脕砼囵B(yǎng)常見的綠藻所使用的培養(yǎng)基。一般來說，如果配制了母液，用母液來配培養(yǎng)基，滅菌后是不會產生沉淀的。配置的時候注意先將所需要的蒸餾水準備好，將需要的藥品逐個加入，等到一種藥品充分溶解之后再加入第二種。另外，土水在蒸餾過濾后，是不需要滅菌的，因為高壓滅菌的過程會讓其中的一些營養(yǎng)成分損失。③

水是培養(yǎng)基成分中很重要的一個方面。配培養(yǎng)基，可以取蒸餾水、自來水、去離子水，也可以取藻種采集地的水。使用經過處理的水，如雙蒸水、去離子水，有時候并不合適培養(yǎng)，因為儀器在處理過程中會帶入微量的有毒物質。采集藻種采集地的水來培養(yǎng)是最理想的，但是需要經過一些處理，處理的手段和過程要盡可能保持其營養(yǎng)成分不變。如果是咸水或者海水的藻類采集地采集的水，應將其置于5℃的黑暗中，保持6個月。如果是泉水或者湖水等淡水的水源，水樣置于20℃的室溫，立即通過活性炭方法處理：每升水加④

咸水和微咸水的藻類需要的人工咸水的合成效果關鍵在于如何蒸餾；還有一些水華藍藻難以培養(yǎng)，主要原因是因為在野外生長時，通常底泥提供的營養(yǎng)元素可以溶在水中，但是在實驗室培養(yǎng)，經過高壓滅菌，很多營養(yǎng)都損失了。所以我們建議不用高壓滅菌法，使用巴斯德（pasteur）滅菌方法：加熱到73～78℃，保持15～20分鐘，間隔24小時滅菌一次，一共三次。2、培養(yǎng)基的配制主要介紹一下培養(yǎng)基的配制方法和滅菌方法：1.

配制貯液。培養(yǎng)基一般由三個方面組成：微量元素、大量元素、維生素。準備100ml～200ml的試劑瓶若干，洗凈，滅菌。按照我們提供的培養(yǎng)基配方中貯液的濃度，配制大量元素和微量元素的貯液放在以上準備的試劑瓶（遇光易反應的藥品，請放在棕色試劑瓶），置于4℃左右的冰箱保存。將需要使用的維生素（最好是針劑），也置于42.

配制培養(yǎng)基。一般可以配制1000ml左右的培養(yǎng)基留待使用。先準備1000ml大燒杯，洗凈。按照我們培養(yǎng)基配方中的working

solution，先加入需要的蒸餾水，然后用移液管向其中加配制好的貯液（注意，不可先加貯液，最后加蒸餾水）。一邊加，一邊攪拌，依次加入所有組分，最后留下維生素不加。搖勻。三、

滅菌①、

對培養(yǎng)器材的滅菌：滅菌在藻種的培養(yǎng)中，是十分重要的一個環(huán)節(jié)。藻種培養(yǎng)、轉接、培養(yǎng)基制備等等，任何一個環(huán)節(jié)都必須使用滅菌的器械，否則藻種都會染菌，甚至染上其它的藻類。所有的培養(yǎng)藻種所需要的三角瓶、試管，燒杯，接種環(huán)，吸管，注射器，針頭等培養(yǎng)，轉接藻種所需要的器材都必須經過高壓滅菌，配制培養(yǎng)基所需要的移液管、用來裝培養(yǎng)基所需要的瓶也必須經過滅菌，轉接藻種需要的滴管、接種環(huán)、涂布所需要的玻璃棒、培養(yǎng)皿等都必須滅菌。培養(yǎng)所需要的三角瓶、試管、培養(yǎng)皿，滅菌前洗凈，三角瓶可以用牛皮紙內襯粗濾紙來包住瓶口，用棉線纏緊；或者自做棉塞，外部再加上牛皮紙包住；試管必須和棉塞或者試管塞一起用牛皮紙包好滅菌。培養(yǎng)皿可以5～10個一起用牛皮紙包好滅菌。移液管、滴管、接種環(huán)都可以分別用牛皮紙包好滅菌。所有玻璃器皿都采用高壓滅菌：在1.5大氣壓下保持30分鐘。使用之前不能在敞開的環(huán)境打開，只能在超凈臺打開。滅菌結束后，放在烤箱烘干。所有滅菌后的器皿、培養(yǎng)基只能在超凈臺打開使用。使用巴斯德滅菌法滅菌的原水，也不能在超凈臺之外的地方打開使用。長期沒有使用了但曾經滅菌過的器材或培養(yǎng)基，如果需要使用，必須重新滅菌一次。②

、培養(yǎng)基滅菌注意事項：配制培養(yǎng)基的時候一些經過高壓滅菌成分會發(fā)生改變的微量元素，應在滅菌后在超凈臺上用滅菌的注射器添加。如維生素，但是維生素的滅菌也必須很嚴格，往往藻種污染到細菌都是因為維生素引起的，可以使用0.22μm或0.45μm的濾膜來過濾維生素溶液。土水（土壤侵出液）在蒸餾過后只能使用過濾的方法滅菌，不能經過高溫高壓滅菌。洗凈若干帶橡皮塞的鹽水瓶（800ml或500ml），將培養(yǎng)基注入，塞上橡皮塞。然后剪一小塊紗布，包在橡皮塞外面，用棉線將塞子和瓶子纏緊，這樣保證在滅菌的過程中，培養(yǎng)基不會把橡皮塞沖開。最后在橡皮塞頭上插一個小針頭，這個做法可以在滅菌的時候放氣，也是為了保證培養(yǎng)基不會在滅菌的時候把橡皮塞沖開。然后開始滅菌。滅菌結束后，立即降針頭拔出。將培養(yǎng)基放置在潔凈的地方，免受污染。四、

藻種培養(yǎng)條件1、

光照培養(yǎng)一個藻種最初，先將少量的藻種轉接到新鮮的培養(yǎng)基中，放在冷白熒光燈管（200－400footcandle）保持7～10天，觀察最初的生長狀況。生長較好以后，移到低光照區(qū)域（50－100footcandle），保持低速率的生長。實驗需要的藻種的培養(yǎng)中，我們推薦使用冷白熒光管來作為光照來源。因為如果使用白熾燈泡和直射的日光作為光源的話，光照會產熱，改變培養(yǎng)的溫度。在陽光照射下培養(yǎng)溫度通常可以上升10℃培養(yǎng)的時候，光照與培養(yǎng)物的細胞密度也有關，一般密度比較小的時候，不適合使用較強烈的光照。我?guī)焯峁┑脑宸N，在細胞密度在105數(shù)量級左右時，我們推薦在2000lux的光照下培養(yǎng)。接種后，細胞密度很低的情況下，需要放置在弱光照下培養(yǎng)，隨著細胞密度增大，逐漸加強光照。培養(yǎng)藻類，每天要定期給一段時間的置于黑暗中培養(yǎng)。大多數(shù)藻種的光暗比都是12h：12h，也有16h：8h。2、

溫度大多數(shù)淡水藻都可以在20～25℃左右生長，高于30℃有些藍藻不能堅持到24小時就會死亡。一般所有的綠藻生長的溫度相對比較廣一些。在10℃左右會幾乎停止生長，但是不會死亡。非水華類的藍藻更加可以耐低溫的環(huán)境，低于我?guī)斓拇蟛糠衷宸N，沒有特別說明，其培養(yǎng)溫度都是20～25℃。3、

特殊藻種培養(yǎng)要求衣藻如果在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長，都會有變成類似四集藻型的趨勢。所以建議培養(yǎng)的時候稀釋一下SE培養(yǎng)基，或者用土水培養(yǎng)基來保持它的形態(tài)結構。團藻屬的藻類需要勤接種，使用營養(yǎng)太豐富的培養(yǎng)基，它可能會由群體散開成為單個游動的細胞。培養(yǎng)含有葉綠素的鞭毛藻，可以用土水培養(yǎng)基加上一粒豌豆；無色的鞭毛藻，可以用土水培養(yǎng)基加上一兩粒谷粒或者小麥。硅藻可以使用很多種培養(yǎng)基來培養(yǎng)，但是培養(yǎng)基中必須含有硅，建議硅藻的培養(yǎng)基中Na2SiO3

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9H2O達到10－30mg/l。藻種的采集、分離技術浮游藻類定性樣品可以用浮游生物網(wǎng)25#網(wǎng)采集，在自然水體中采集藻類的時候，如果為了分離和檢驗藻類生活水體的相關指標，通常還需要采集自然水體作分析用。浮游藻類定量樣品用采水器采集1升水，裝瓶加入5～10ml魯哥氏液固定，并貼上標簽，并需要記錄水體pH值，氣溫和水溫，地點和日期附著生長的藻類和絲狀藻類可以從碎石，碎葉或者其它一些可能供藻類著附生長的植物上刮下采集，裝瓶。采集到的活體樣品，應在短期內觀察，分離；很多種類，尤其是鞭毛類的藻會在很短的時間內死亡。要確定所培養(yǎng)的藻種是一個純的品系，必須從樣品中分離出單克隆。一個純的藻的單克隆必須是由一個單細胞繁殖而來。絲狀藻的純品系，必須來自一根絲體上的幾個連續(xù)的細胞。介紹幾種分離的技術：1．

毛細管清洗技術選擇直徑為3～4mm的軟玻璃管，或者其它任何適合拉成毛細管的巴氏滴管，用鑷子夾住滴管的前端，放在酒精噴燈的外焰上，直到玻璃變軟，迅速移離火焰，同時快速拉成毛細管。由于拉的時候的力度和掌握時機的不同，毛細管的口徑會有不同，所以經常練習，達到熟練，可以將毛細管拉成自己需要的口徑，即剛剛適合要挑取的藻細胞進入的大小。然后用鑷子把毛細管頭端夾斷，注意夾斷的時候的用力均勻，盡量要保證毛細管口平滑，避免成為鋸齒狀邊緣。在管的另一段加上膠吸頭或者軟的橡皮管。用滴管吸取少量采集樣品滴在滅菌后的點滴板上的凹陷上，置于解剖鏡下觀察。如果樣品中藻細胞濃度很大，種類繁多，可以將樣品用蒸餾水或者培養(yǎng)基稀釋。然后在至少6～12個凹陷上滴入蒸餾水和培養(yǎng)基。在解剖鏡下觀察，移動毛細管的細管頭在需要挑取的細胞上，小心進入液體中，迅速挑取，將細胞排放在另一個裝有蒸餾水或者培養(yǎng)基的凹陷里。用以上方法挑取12～15個單細胞，然后在裝有蒸餾水或者培養(yǎng)基的凹陷中清洗6～12次，每清洗一次，必須重新拉一次毛細管。經過有效的清洗，將最后得到的單細胞放在8個裝滿培養(yǎng)基的滅菌過的小試管中，放在適合被挑取藻生長的光照條件和溫度條件下，開始培養(yǎng)，3～6周后即可以鏡檢看是否生長了。用毛細管分離的方法分離絲狀藻類，按照以上所述的方法拉一根毛細管，前端帶上一小鉤，小心勾住藻樣中的一根單絲體，分離出來，在點滴板的凹陷清洗6～12次。清洗結束后，取一含0.5％～0.75％低濃度的agar平板，將清洗后的藻絲體在平板上拖動幾次，除去絲體表面的一些體表寄生菌。2．

噴霧技術1964年，Wiedemanl.建立了一種相對簡單的技術，既可以分離，也可以用來純化。首先滅菌一批15ml的離心管，取8～9ml藻樣放入離心管，調節(jié)轉速2000rpm，離心45～90秒，去除上清液，然后加入蒸餾水或者滅菌后的培養(yǎng)基，重復以上操作12次左右。經過最后清洗，倒去2ml上清液。取15cm長的小滴管拉成毛細管（毛細部分長度需略長于離心管），將該毛細管夾斷，使毛細部分略長于離心管，插入到離心管底部，離心管口用棉花塞住，毛細管留出一部分在棉花之上。將離心管直立固定在鐵架臺，將壓縮空氣通過一滅菌過的滴管放出，噴在毛細管頭部，這把從離心管底部通過毛細管出來的藻細胞均勻吹出，在距離離心管25cm處放置一個滅菌過的agar培養(yǎng)皿，這樣經壓縮空氣噴出的藻細胞就到達平板上。噴霧結束后，將agar用parafilm膜密封好，置于適當培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，幾天后，單細胞的藻，或者單藻落長出來，可以在無菌的條件下用毛細管挑出來，放入滅菌后的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。3．

其它技術這里介紹幾種其它的分離技術。倒平板法：制作營養(yǎng)成分相對較少的固體培養(yǎng)基，滅菌后冷卻，當培養(yǎng)基已經變涼但還未凝固的時候，取少量采集樣品，與之混合，攪拌，倒在滅菌后的培養(yǎng)皿上，等它凝固，密封培養(yǎng)。培養(yǎng)一周左右，將生長出來的單克隆從原培養(yǎng)基上割下來，放入新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。劃平板法：當藻單元的直徑小于10μm時，最容易的分離方法就是劃平板或涂平板法。這兩者中的任何一種分離方法，都可能得到無菌的培養(yǎng)物。準備一個裝有用瓊脂（1-1.5%）固化的培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，滴1-2滴自然采集物于瓊脂的邊緣。用火焰滅菌一個線環(huán)，或者一彎玻璃棒（將棒浸入70%酒精溶液，放在火焰上點燃并移離火焰；重復幾次。）使用無菌的線環(huán)或玻棒，在無菌條件下將滴在瓊脂上的自然采集物滴平行劃在瓊脂表面上。如有需要，可用蠟筆（記號筆）在培養(yǎng)皿的外底部劃線標記，在合適條件下培養(yǎng)4-8天，然后在顯微鏡的高倍鏡下觀察，檢查該樣品是否為單藻株。將挑得的單克隆利用上述方法再劃平板，讓其再長出新的藻落。第二次劃平板可以減少細菌污染藻落的可能性，也使各藻落更趨于來自同一藻單元。最后，從目的藻落挑取藻單元到液體或瓊脂培養(yǎng)基。涂平板法：該方法與劃平板法相似，只是它是將藻單元涂抹在瓊脂培養(yǎng)基的表面，而不是用線環(huán)劃線。準備一個培養(yǎng)皿，用巴斯德吸管吸一滴自然采集物，將其固定在桌子上，細端離開桌面向上傾斜。在其粗端套上氣泵，使在其細端產生較高壓力的空氣流。一手持有瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)的瓊脂表面與產生氣流的細管垂直，距離約200mm。一手持吸有自然采集物的巴斯德吸管，對準高速空氣流擠出采集物液滴，使在高速空氣流下產生的水霧均勻噴灑在瓊脂培養(yǎng)基表面，密封培養(yǎng)。培養(yǎng)一周左右，在顯微鏡的高倍鏡下觀察，檢查該樣品是否為單藻株，將挑得的單克隆轉移到液體或瓊脂培養(yǎng)基。5、為：檸檬酸和檸檬酸鐵銨6、EDTA：乙二胺四乙酸BG-11

Stock

FinalNaNO3

1.5g

1.5g/LCaCl2

18g/500ml

1ml/L

36mg/LNa2CO3

10/500ml

1ml/L

20mg/LMgSO4.7H2O

37.5g/500ml

1ml/L

75mg/LK2HPO4

15.25g/500ml

1ml/L

30.5mg/LorK2HPO4

?3H2O

20g/500ml

1ml/L

40mg/LFe-EDTA

mix

1ml/LA5+Co

1ml/L

Fe-EDTA

mixNa2EDTA

0.1g/100ml

Fe.NH3Citrate

0.1g/100ml

Citric

Acid

0.6g/100mlA5+Co

g/LH3BO3

2.86MnCl2.2