T∕CITS 179-2024 抗核抗體間接免疫熒光法檢測及臨床應(yīng)用指南

ICS11.020CCSC10CITST/CITS179—2024抗核抗體間接免疫熒光法檢測及臨床應(yīng)用Guidelinesforantinuclearantibodytestingbyindirectimmunofluorescenceandclinicalapplication2024-11-27發(fā)布2024-11-27實(shí)施中國檢驗(yàn)檢測學(xué)會發(fā)布前言 I 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14縮略語 15檢測原理與方法 25.1檢測原理 25.2檢測方法 26開展前準(zhǔn)備工作 26.1性能驗(yàn)證 26.2人員培訓(xùn) 26.3儀器校準(zhǔn) 26.4制定SOP 27IIF-ANA檢測操作 37.1檢驗(yàn)前 37.2檢驗(yàn)中 37.3結(jié)果判讀 37.4結(jié)果報(bào)告 38質(zhì)量控制 48.1室內(nèi)質(zhì)控 48.2室間質(zhì)評 58.3數(shù)據(jù)總結(jié) 59ANA檢測的臨床應(yīng)用 59.1自身免疫性疾病的診斷 59.2病情監(jiān)測與療效評估 5參考文獻(xiàn) 6I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院、歐蒙醫(yī)學(xué)診斷（中國）有限公司、國軍標(biāo)（北京）標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)研究院提出。本文件由中國檢驗(yàn)檢測學(xué)會歸口。本文件起草單位：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院、國軍標(biāo)（北京）標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)研究院、歐蒙醫(yī)學(xué)診斷（中國）有限公司、安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院、巴彥淖爾市醫(yī)院、北京大學(xué)深圳醫(yī)院、北京實(shí)安科技有限公司、北京醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)會、北京中檢體外診斷工程技術(shù)研究中心、福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院、廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院、哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院、湖州市中心醫(yī)院、華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院、淮安市第二人民醫(yī)院、江蘇三聯(lián)生物工程股份有限公司、晉江市醫(yī)院（上海市第六人民醫(yī)院福建醫(yī)院）、蘭州大學(xué)第一醫(yī)院、泉州市第一醫(yī)院、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院、上海市皮膚病醫(yī)院、上海市第一人民醫(yī)院嘉定醫(yī)院（上海市嘉定區(qū)江橋醫(yī)院）、上海市光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院、上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院、同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院、無錫市第二人民醫(yī)院、沃芬醫(yī)療器械商貿(mào)（北京）有限公司、廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院、新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、應(yīng)急總醫(yī)院、臺州市中心醫(yī)院、通標(biāo)偉業(yè)（北京）標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)研究院。本文件主要起草人：盛慧明、林錦驃、劉萬陽、李川、戴其全、朱俊、閆利明、杜靜、李娜、穆紅、范春梅、陳惠娟、張曉琍、王健、袁育林、薛麗、杜雪飛、鄒偉華、吳士及、梁勇、潘維華、朱宗林、于海濤、張志珊、翁文浩、杜芳、鄭冰、鄭英霞、羅清瓊、伍均、高華利、薛鸞、宗明、龔芳、唐小梅、宣景秀、李輝、孟存仁、許慧、吳曉宇、許雪英。I抗核抗體間接免疫熒光法檢測及臨床應(yīng)用指南本文件提供了間接免疫熒光法檢測抗核抗體的原理與方法、開展前準(zhǔn)備工作、IIF-ANA檢測操作、質(zhì)量控制和ANA檢測臨床應(yīng)用等方面的指導(dǎo)。本文件適用于醫(yī)療機(jī)構(gòu)、第三方實(shí)驗(yàn)室開展抗核抗體檢測工作及臨床醫(yī)生對抗核抗體檢測結(jié)果的解讀和應(yīng)用。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1抗核抗體antinuclearantibodies；ANA以真核細(xì)胞的各組分為靶抗原的自身抗體總稱。3.2抗體antibody機(jī)體免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B細(xì)胞增殖分化為漿細(xì)胞后產(chǎn)生的一類能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合并介導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫效應(yīng)的球蛋白。[來源：GB/T40265—2021，3.1]3.3抗原antigen可以誘導(dǎo)生物體產(chǎn)生抗體的物質(zhì)，能夠被相應(yīng)抗體識別并與之結(jié)合。[來源：GB/T40265—2021，3.2]3.4間接免疫熒光法indirectimmunofluorescenceassay；IIF用特異性抗體（抗原）與標(biāo)本中相應(yīng)抗原（抗體）反應(yīng)后，再用熒光素標(biāo)記的第二抗體（抗抗體）與抗原-抗體復(fù)合物中第一抗體結(jié)合后，在熒光顯微鏡下觀察特征性熒光，以檢測抗原或抗體的方法。4縮略語下列縮略語適用于本文件。AILD：自身免疫性肝病(autoimmuneliverdiseases)CAD：計(jì)算機(jī)輔助診斷系統(tǒng)（computeraideddiagnosis）DM:皮肌炎（dermatomyositis）HEp-2：人喉癌上皮細(xì)胞（humanepithelioma-2）MCTD：混合性結(jié)締組織?。╩ixedconnectivetissuedisease）1PM：多發(fā)性肌炎（polymyositis）SS：干燥綜合征（Sj?gren′ssyndrome）SSc：系統(tǒng)性硬化癥（systemicsclerosis）SLE：系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemiclupuserythematosus）SOP：標(biāo)準(zhǔn)操作程序（standardoperationprocedure）5檢測原理與方法5.1檢測原理將含有細(xì)胞核成分的細(xì)胞（如HEp-2）作為抗原底物，與患者血清中的ANA進(jìn)行反應(yīng)，利用抗原抗體反應(yīng)及熒光標(biāo)記技術(shù)檢測ANA。如果血清中存在ANA，它們會與細(xì)胞核成分特異性結(jié)合。隨后加入熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體（以下簡稱二抗），該抗體會與ANA結(jié)合，從而在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，表明ANA的存在。5.2檢測方法IIF法是檢測抗核抗體的參考方法。采用IIF法檢測時(shí)宜滿足以下條件：a)在HEp-2實(shí)驗(yàn)基質(zhì)中，每顯微鏡視野（放大倍數(shù)為200倍）可見3個(gè)～5個(gè)有絲分裂細(xì)胞；b)二抗使用熒光素標(biāo)記的抗人IgG抗體；c)樣本稀釋方法可根據(jù)不同的檢測試劑而采用10稀釋系統(tǒng)或倍比稀釋系統(tǒng)。6開展前準(zhǔn)備工作6.1性能驗(yàn)證在開展IIF-ANA檢測前宜進(jìn)行性能驗(yàn)證，驗(yàn)證內(nèi)容包括但不限于：a)符合率；b)精密度（重復(fù)性）；e)抗干擾能力。6.2人員培訓(xùn)實(shí)驗(yàn)操作以及結(jié)果判讀的人員宜參加培訓(xùn)并通過考核、獲得相關(guān)授權(quán)后方可獨(dú)立工作。培訓(xùn)的內(nèi)容包括但不限于：a)實(shí)驗(yàn)基本原理和操作步驟；b)儀器和顯微鏡的操作、維護(hù)保養(yǎng)和處理一般性故障；c)質(zhì)量控制及失控處理；d)熒光模型判讀及相關(guān)抗體臨床意義；e)試劑更換批號比對。6.3儀器校準(zhǔn)儀器校準(zhǔn)內(nèi)容包括但不限于：a)加樣體積的準(zhǔn)確性和精密度在儀器說明書規(guī)定的范圍內(nèi)；b)攜帶污染率評估；c)顯微鏡及CAD的光強(qiáng)度，宜采用熒光顯微鏡校準(zhǔn)玻片或光功率計(jì)校準(zhǔn)，結(jié)果在儀器說明書規(guī)定d)至少每年校準(zhǔn)1次，對于使用頻次高的儀器，宜增加校準(zhǔn)頻率。6.4制定SOP6.4.1SOP包括但不限于下列內(nèi)容：2a)項(xiàng)目信息：項(xiàng)目名稱、檢測原理及方法、試劑、熒光顯微鏡、自動化儀器（如使用自動熒光制片機(jī)、CAD）等；b)樣本要求：檢測樣本類型及儲存要求；c)室內(nèi)質(zhì)控程序及可接受標(biāo)準(zhǔn)；d)實(shí)驗(yàn)操作步驟：具體實(shí)驗(yàn)步驟（手工和儀器）和注意事項(xiàng)等；e)項(xiàng)目性能參數(shù)：符合率、精密度、檢出限、臨界值和抗干擾能力等；f)結(jié)果報(bào)告：結(jié)果解釋、臨床意義、備注信息等；g)其他信息：熒光片保存條件（試劑保存及完成的熒光載片保存條件）等。6.4.2如果使用自動化儀器（自動化熒光制片機(jī)、CAD），其SOP的內(nèi)容在滿足6.4.1所列內(nèi)容基礎(chǔ)上還包括但不限于：a)儀器校準(zhǔn)要求；b)儀器操作步驟及維護(hù)保養(yǎng)；c)常見故障及處理措施。7IIF-ANA檢測操作7.1檢驗(yàn)前檢驗(yàn)前完成的內(nèi)容包括：a)確認(rèn)環(huán)境溫濕度符合檢測體系的要求，室溫宜為18℃~25℃,濕度宜為30％～70%;b)測試樣本和試劑平衡至室溫，熒光片進(jìn)行室溫平衡時(shí)不宜從包裝的鋁膜中拆出；c)按試劑說明書配制緩沖液，并充分混合。注：如果使用自配緩沖液，建議考慮緩沖液的pH值為7.2～7.4。7.2檢驗(yàn)中檢驗(yàn)中的操作包括：a)每批實(shí)驗(yàn)宜有血清基質(zhì)的質(zhì)控品；b)加樣時(shí)加樣槍不宜接觸到細(xì)胞，不宜產(chǎn)生氣泡，液體宜覆蓋整個(gè)孔，且不外溢到相鄰孔中；c)洗片時(shí)，不宜將洗液直接對著孔內(nèi)沖洗，避免損傷基質(zhì)上包被的細(xì)胞和組織；d)加熒光二抗前，宜去除熒光片上多余的洗液；e)觀察玻片的疏水性，保持熒光片上的試劑呈液滴狀態(tài)，避免液體散開并外流至其他孔中；f)實(shí)驗(yàn)過程中手指避免觸碰熒光片的基質(zhì)；g)封片時(shí)，孔內(nèi)不宜有氣泡產(chǎn)生；h)完成實(shí)驗(yàn)后，宜立刻讀片；如不能立即讀片，宜按熒光片要求的保存條件進(jìn)行保存；i)實(shí)驗(yàn)過程由全自動儀器完成時(shí)，實(shí)驗(yàn)過程中宜確保每個(gè)樣本孔的樣本及試劑加樣準(zhǔn)確；實(shí)驗(yàn)過程洗液宜充足，沒有干片現(xiàn)象。7.3結(jié)果判讀7.3.1結(jié)果判讀宜在顯微鏡下進(jìn)行操作。使用光源為汞燈的顯微鏡時(shí)，在接通電源后宜預(yù)熱10min~15min，汞燈電源開、關(guān)時(shí)間宜間隔30min以上。使用光源為LED燈的顯微鏡時(shí)即開即用。宜定期維護(hù)保養(yǎng)顯微鏡，記錄顯微鏡每次使用時(shí)長，到達(dá)使用壽命宜及時(shí)更換。7.3.2結(jié)果判讀宜包括以下內(nèi)容：a)只有在質(zhì)控結(jié)果符合要求的情況下，才可進(jìn)行結(jié)果判讀；b)低倍鏡（20倍物鏡）用于判讀陰陽性結(jié)果，高倍鏡（40倍物鏡）用于判讀熒光模型；c)采用CAD的實(shí)驗(yàn)室，判讀結(jié)果由讀片人員復(fù)核后進(jìn)行報(bào)告；d)結(jié)果判讀宜“雙人雙核”，結(jié)果不一致時(shí)由兩人討論后進(jìn)行結(jié)果報(bào)告；e)若手工記錄判讀結(jié)果錄入信息系統(tǒng)，宜雙人核對，準(zhǔn)確錄入結(jié)果。7.4結(jié)果報(bào)告7.4.1IIF-ANA檢測結(jié)果報(bào)告宜包括：3a)檢測方法；b)定性結(jié)果（陽性/陰性）；c)熒光模型；d)陽性結(jié)果的滴度；e)必要的臨床建議。7.4.2IIF-ANA檢測結(jié)果報(bào)告格式范例見表1。表1IIF-ANA檢測結(jié)果報(bào)告范例序號報(bào)告內(nèi)容1檢測結(jié)果：陰性檢測方法：間接免疫熒光法建議：無2細(xì)胞核陽性熒光模型包括：核均質(zhì)型、核顆粒型、致密細(xì)顆粒型、著絲點(diǎn)型、核點(diǎn)型、核仁型、核膜型和核多形性型等檢測結(jié)果：陽性。熒光滴度：1:100/320/1000/3200/10000或1:80/160/320/640/1280/2560或（依據(jù)各實(shí)驗(yàn)室采用的試劑廠家推薦的滴度系統(tǒng)報(bào)告）檢測方法：間接免疫熒光法建議：如果臨床懷疑SLE、SS、SSc、MCTD或PM/DM等，考慮進(jìn)一步檢測疾病相關(guān)抗體3細(xì)胞胞漿陽性熒光模型包括：胞漿纖維型、胞漿顆粒型、胞漿網(wǎng)狀/線粒體樣型、胞漿極性/高爾基體樣型和胞漿棒環(huán)狀型檢測結(jié)果：陽性。熒光滴度：1:100/320/1000/3200/10000或1:80/160/320/640/1280/2560或（依據(jù)各實(shí)驗(yàn)室采用的試劑廠牌推薦的滴度系統(tǒng)報(bào)告）檢測方法：間接免疫熒光法建議：如果臨床懷疑SLE、AILD或PM/DM等，考慮進(jìn)一步檢測疾病相關(guān)抗體4細(xì)胞有絲分裂期核型陽性熒光模型包括：中心粒型、紡錘體型、中間體型、染色體型檢測結(jié)果：陽性。熒光滴度：1:100/320/1000/3200/10000或1:80/160/320/640/1280/2560（依據(jù)各實(shí)驗(yàn)室采用的試劑廠家推薦的滴度系統(tǒng)報(bào)告）檢測方法：間接免疫熒光法建議：臨床相關(guān)性不明5混合熒光模型陽性：參照：2、3和4，熒光模型的報(bào)告優(yōu)先級順序?yàn)榧?xì)胞核熒光模型、細(xì)胞漿熒光模型、細(xì)胞有絲分裂期熒光模型。相同優(yōu)先級的熒光模型，宜按滴度高低順序依次報(bào)告檢測結(jié)果：陽性。熒光滴度：1:100/320/1000/3200/10000或1:80/160/320/640/1280/2560（依據(jù)各實(shí)驗(yàn)室采用的試劑廠家推薦的滴度系統(tǒng)報(bào)告）檢測方法：間接免疫熒光法建議：參照2、3和4，根據(jù)熒光模型進(jìn)行相應(yīng)建議7.4.3混合熒光模型的報(bào)告優(yōu)先級順序?yàn)榧?xì)胞核熒光模型、細(xì)胞漿熒光模型、細(xì)胞有絲分裂期熒光模型，相同優(yōu)先級的模型宜按滴度高低順序依次報(bào)告。7.4.4HEp-2細(xì)胞核、細(xì)胞胞漿及細(xì)胞有絲分裂期熒光模型宜納入ANA陽性結(jié)果。7.4.5針對靶抗原特異性自身抗體檢測結(jié)果，報(bào)告宜包括檢測方法、檢測結(jié)果、參考區(qū)間及必要的臨床建議。8質(zhì)量控制8.1室內(nèi)質(zhì)控48.1.1室內(nèi)質(zhì)控品包括陰性、陽性/弱陽性2個(gè)水平，可使用商品化的質(zhì)控血清或自制血清作為室內(nèi)質(zhì)控品。不宜僅采用商品化試劑盒中自帶的陰陽性對照品作為實(shí)驗(yàn)檢測的室內(nèi)質(zhì)控品。8.1.2自制室內(nèi)質(zhì)控品可采用ANA檢測陰性、弱陽性、陽性混合血清或來源于單一患者的血清作為室內(nèi)質(zhì)控品，充分混勻分裝后對自制質(zhì)控品進(jìn)行均一性和穩(wěn)定性驗(yàn)證。8.1.3質(zhì)控結(jié)果同時(shí)滿足以下條件則表明室內(nèi)質(zhì)控品結(jié)果符合要求：a)陰性、陽性一致；b)陽性質(zhì)控?zé)晒饽Ｐ鸵恢?；c)陽性質(zhì)控品的滴度在靶值±一個(gè)滴度范圍內(nèi)。8.2室間質(zhì)評宜參加衛(wèi)生主管部門組織的室間質(zhì)評。如果室間質(zhì)評中未涉及的必報(bào)熒光模型，宜定期（一年兩次）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間比對。8.3數(shù)據(jù)總結(jié)宜計(jì)算過去12個(gè)月ANA陽性率的均值，確立變異系數(shù)（coefficient