酶解改性技術(shù)在提高核桃蛋白粉溶解性中的研究

核桃作為高蛋白、高脂肪的食物，其具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值以及藥用價(jià)值[1]。在食用方面，核桃可以直接食用或者作為輔料加入其他營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品中，增加營(yíng)養(yǎng)品的功能性。但在深加工方面，現(xiàn)有的研究多集中于核桃油的制備方面，而對(duì)核桃蛋白粉的研究較少，降低了核桃的附加值[2]。核桃蛋白主要包括清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白以及谷蛋白，蛋白質(zhì)含量高達(dá)24%，且富含人體必需的氨基酸[3]，但谷蛋白不溶于水，導(dǎo)致核桃蛋白在水中的溶解性較差。在深加工處理階段，由于加工條件的影響，蛋白質(zhì)的溶解性變差，在人體內(nèi)的消化吸收性能降低，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值無(wú)法更好地被人體吸收利用[4]。因此，提高核桃蛋白粉的溶解性至關(guān)重要。酶解改性技術(shù)作為生物改性的一種，具有條件溫和、專一性強(qiáng)、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，在蛋白質(zhì)改性方面應(yīng)用廣泛。酶解改性技術(shù)主要是通過(guò)破壞蛋白質(zhì)的肽鍵，使蛋白質(zhì)內(nèi)部的親水基團(tuán)暴露出來(lái)而增加其在水中的溶解性[5-6]。GUAN等[7]采用胰蛋白酶對(duì)燕麥蛋白進(jìn)行酶解改性處理，使得燕麥蛋白溶解性顯著提高，乳化性和起泡性顯著下降。MA等[8]對(duì)花生蛋白進(jìn)行酶解改性處理，使其溶解性顯著提高，因此可嘗試將胰蛋白酶應(yīng)用于大豆蛋白制品中。1材料與方法1.1試劑與儀器1.1.1試劑核桃粉（實(shí)驗(yàn)室自制）；氯化鈉（AR，南京化學(xué)試劑股份有限公司）；胰蛋白酶（質(zhì)譜級(jí)，澤葉生物）；去離子水（實(shí)驗(yàn)室自制）；HCl、正己烷（AR，上海麥克林生化科技有限公司）；NaOH（AR，南京化學(xué)試劑股份有限公司）。1.1.2儀器YJ1002型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；JC-9870A型全自動(dòng)凱氏定氮儀（青島智匯谷信息技術(shù)有限公司）；SHA-C水浴恒溫振蕩器（常州隆和儀器制造有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州科華儀器設(shè)備有限公司）；TD5Z型臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；雷磁PHSJ-6L型pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。1.2酶解改性核桃蛋白粉1.2.1酶解改性核桃蛋白粉的實(shí)驗(yàn)流程用電子天平準(zhǔn)確稱取實(shí)驗(yàn)用核桃蛋白粉10g置于250mL的圓底燒瓶中并加入10mL的去離子水使其分散溶解得到分散液，將圓底燒瓶置于45℃的水浴恒溫振蕩器中處理10min，當(dāng)分散液的溫度達(dá)到45℃后，按照1000U·g-1蛋白粉的量加入胰蛋白酶，并采用pH計(jì)測(cè)試分散液的pH值，采用HCl和NaOH將分散液的pH值調(diào)整至初始pH狀態(tài)，并取樣對(duì)分散液的水解度進(jìn)行測(cè)試。當(dāng)核桃蛋白粉的水解度達(dá)到2%時(shí)，將圓底燒瓶取出，在90℃的恒溫水浴鍋中滅酶處理10min，處理后將樣品冷卻凍干。1.2.2酶解改性核桃蛋白粉單因素實(shí)驗(yàn)分析根據(jù)前人研究成果可知，在酶解改性技術(shù)中，酶用量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%和0.7%）、料液比（5∶1、7∶1、9∶1、11∶1、13∶1和15∶1）、酶解溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃）以及酶解時(shí)間（10min、20min、30min、40min、50min和60min）是影響核桃蛋白粉溶解性的關(guān)鍵性因素。本文通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)分析方法，固定其余變量，改變一個(gè)實(shí)驗(yàn)條件，探索酶解改性技術(shù)提高核桃蛋白粉的溶解性的關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)。1.3測(cè)試與表征1.3.1蛋白質(zhì)含量測(cè)定根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》（GB5009.5—2016）對(duì)核桃蛋白粉的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)試[9]。1.3.2氨溶指數(shù)測(cè)定準(zhǔn)確稱取核桃蛋白粉樣品2g并溶解于90mL的去離子水中得到蛋白粉溶液，采用HCl和NaOH將溶液的pH調(diào)整至2.0～9.0并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度線。在10000r·min-1的條件下將溶液高速離心30min，離心結(jié)束后靜置10min測(cè)量上清液中的蛋白質(zhì)含量，上清液中的蛋白含量占樣品中總蛋白含量的百分比即為核桃蛋白的氮溶指數(shù)（NitrogenSolubilityIndex，NSI)。1.3.3水解度測(cè)定核桃蛋白粉的水解度（Degreeofhydrolysis，DH）根據(jù)pH-stat法進(jìn)行測(cè)試，記錄酶解過(guò)程中NaOH的用量。水解度W的計(jì)算公式為式中：W為水解度，%；B為NaOH的用量，mL；Nb為NaOH的摩爾濃度，mol·L-1；α為氨基的解離度，胰蛋白酶的校準(zhǔn)因子1/α為3.60；Mp為核桃蛋白粉的質(zhì)量，g；htot為核桃蛋白的肽鍵總數(shù)，7.35mmol·g-1。2結(jié)果與分析2.1酶用量對(duì)核桃蛋白溶解性的影響在料液比為9∶1、酶解溫度為50℃、酶解時(shí)間為30min的條件下，分析酶用量對(duì)核桃蛋白溶解性的影響。由圖1可知，在酶解改性過(guò)程中，隨著酶用量的增加，氨溶指數(shù)和水解度都呈現(xiàn)明顯增加的趨勢(shì)。當(dāng)酶用量在0.1%～0.4%時(shí)，氨溶指數(shù)和水解度的上漲幅度都較大，但是繼續(xù)增加酶用量至0.7%時(shí)，氨溶指數(shù)和水解度都出現(xiàn)了一定程度的下降，整體上漲幅度低于酶用量在0.1%～0.4%的上漲幅度。這可能是因?yàn)樵诿赣昧枯^低的情況下，底物未出現(xiàn)酶飽和的現(xiàn)象，隨著酶用量的增加，底物與酶充分反應(yīng)。當(dāng)酶用量在0.5%～0.7%時(shí)，水解度增長(zhǎng)幅度高于氨溶指數(shù)，這可能是因?yàn)樵诟呙赣昧康臈l件下，具有可溶性的酶解產(chǎn)物會(huì)被剩余的酶繼續(xù)酶解，使水解度升高并產(chǎn)生苦味肽。經(jīng)過(guò)綜合分析，酶用量在0.4%時(shí)的氨溶指數(shù)和水解度與0.3%時(shí)接近，考慮成本因素，選擇最佳酶用量為0.3%。圖1酶用量對(duì)核桃蛋白溶解性的影響圖2.2料液比對(duì)核桃蛋白溶解性的影響在酶用量為0.3%、酶解溫度為50℃、酶解時(shí)間為30min的條件下，分析料液比對(duì)核桃蛋白溶解性的影響。由圖2可知，當(dāng)料液比從5∶1增加至9∶1時(shí)，氨溶指數(shù)逐漸增加，但是繼續(xù)增加料液比至15∶1時(shí)，氨溶指數(shù)呈下降趨勢(shì)，而水解度隨著料液比的增加一直呈增加趨勢(shì)，特別是當(dāng)料液比大于11∶1時(shí)，水解度近似為線性增長(zhǎng)的狀態(tài)，增加速度明顯。這可能是因?yàn)楫?dāng)分散液濃度較大時(shí)，底物與蛋白酶的接觸不充分，反應(yīng)不完全，從而導(dǎo)致氨溶指數(shù)以及水解度較低。但隨著料液比的增加，分散液濃度降低，使得底物與蛋白酶接觸更加充分，反應(yīng)更加完全，使不溶性蛋白水解成為可溶性蛋白。當(dāng)繼續(xù)提高料液比時(shí)，可溶性蛋白會(huì)繼續(xù)發(fā)生水解而形成小分子的肽，在此過(guò)程中會(huì)有部分疏水性肽形成而導(dǎo)致氨溶指數(shù)下降。因此，當(dāng)料液比為9∶1時(shí)，核桃蛋白粉的溶解性較好。圖2料液比對(duì)核桃蛋白溶解性的影響圖2.3酶解溫度對(duì)核桃蛋白溶解性的影響在酶用量為0.3%、料液比為9∶1、酶解時(shí)間為30min的條件下，分析酶解溫度對(duì)核桃蛋白溶解性的影響。由圖3可知，隨著酶解溫度的升高，氨溶指數(shù)先增加后減小，當(dāng)酶解溫度為40℃時(shí)，氨溶指數(shù)最大，而水解度隨著酶解溫度的增加呈現(xiàn)持續(xù)增加的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樵跍囟容^低的條件下，酶解溫度升高時(shí)蛋白酶的活性較高，反應(yīng)速度加快。但是當(dāng)酶解溫度達(dá)到一定值時(shí)，過(guò)高的溫度會(huì)加劇體系內(nèi)分子之間的運(yùn)動(dòng)，增加蛋白酶和底物之間的碰撞概率，反應(yīng)更加充分，蛋白質(zhì)水解速度更快。同時(shí)，過(guò)度水解會(huì)造成不溶性肽的產(chǎn)生。因此，需在氨溶指數(shù)以及水解度之間尋找平衡，當(dāng)酶解溫度為40℃時(shí)，溶解性較好。圖3酶解溫度對(duì)核桃蛋白溶解性的影響圖2.4酶解時(shí)間對(duì)核桃蛋白溶解性的影響在酶用量為0.3%、料液比為11∶1、酶解溫度為40℃的條件下，分析酶解時(shí)間對(duì)核桃蛋白溶解性的影響，詳見圖4。圖4酶解時(shí)間對(duì)核桃蛋白溶解性的影響圖由圖4可知，在10～40min時(shí)，隨著酶解時(shí)間的增加，氨溶指數(shù)以及水解度都明顯增加。這主要是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白酶與蛋白質(zhì)之間的作用更加充分，使核桃蛋白粉的溶解度增加。但是當(dāng)酶解時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，氨溶指數(shù)以及水解度的增加逐漸平緩，這主要是因?yàn)楫?dāng)酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，酶切位點(diǎn)會(huì)逐漸減少，會(huì)導(dǎo)致酶的活性減弱，從而導(dǎo)致核桃蛋白粉的氨溶指數(shù)以及水解度增長(zhǎng)變緩。綜上，當(dāng)酶解時(shí)間為40min