放射免疫分析技術(shù)

放射免疫分析技術(shù)摘要RIA是一種微量分析法,就是利用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體,然后與被測的抗體或抗原結(jié)合,形成抗原抗體復(fù)合物的原理來進(jìn)行分析的。它兼有放射性同位素的靈敏性和抗原、抗體反應(yīng)的特異性兩大特點(diǎn)。該法還具有準(zhǔn)確性高和精密度好,便于標(biāo)準(zhǔn)化以及操作簡便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。由于RIA具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，測量簡單，成本低等優(yōu)點(diǎn)，RIA在應(yīng)用方面具有一定的生命力。但是，又因?yàn)樗钪旅娜觞c(diǎn)就是使用放射性核素，此外標(biāo)記物有效使用時(shí)間短，難以實(shí)現(xiàn)操作和測量的自動(dòng)化等，它的進(jìn)一步發(fā)展受到一些局限?，F(xiàn)在免疫分析技術(shù)都在朝著非同位素標(biāo)記免疫分析的方向發(fā)展，自動(dòng)化儀器已經(jīng)投入到臨床常規(guī)項(xiàng)目的檢測中，使得傳統(tǒng)的RIA使用市場逐漸縮小。不過第五代RIA技術(shù)的出現(xiàn)，使得現(xiàn)在的RIA技術(shù)較其他方法在方法學(xué)有了更多的優(yōu)勢，尤其是納米磁性固相的應(yīng)用，為RIA自動(dòng)化的研制提供了很大幫助。此外，在生命科學(xué)的實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域，非放射標(biāo)記免疫技術(shù)始終不能代替RIA。關(guān)鍵字RIAIRIA基本原理第五代RIA技術(shù)1959年，美國科學(xué)家Berson和Yalow將放射性同位素測量的高靈敏度與抗原抗體的高特異性巧妙地結(jié)合起來，創(chuàng)立了放射免疫分析(radioimmuoassay，RIA)技術(shù)。RIA經(jīng)過半個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展，可以分析成百上千種物質(zhì)，包括激素、維生素、腫瘤相關(guān)抗原、抗體、藥物、病毒等。使那些曾認(rèn)為無法檢測的微量而又具有重要生物活性的物質(zhì)得以精確定量，為醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)的發(fā)展做出劃時(shí)代的貢獻(xiàn)。因此，1977年Yalow榮獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。隨后，各國學(xué)者發(fā)展了酶免疫分析(EIA)、熒光(FIA)、時(shí)間分辨熒光(TRFIA)和化學(xué)發(fā)光(CLIA)等非同位素標(biāo)記免疫分析技術(shù)。1.RIA基本原理放射免疫分析法的本質(zhì)是一種分子相同的被側(cè)物質(zhì)和同位素標(biāo)記物質(zhì),同另一種濃度有限的特異性結(jié)合試劑進(jìn)行的競爭性結(jié)合。當(dāng)同位素標(biāo)記化合物和特異性結(jié)合試劑的量保持一定時(shí),加入的被側(cè)物或標(biāo)準(zhǔn)物的量與標(biāo)記物的量之和多于特異性結(jié)合試劑有效結(jié)合的數(shù)目時(shí),被測物或標(biāo)準(zhǔn)物與標(biāo)記物一特異性結(jié)合試劑復(fù)合物之間就呈現(xiàn)一種函數(shù)關(guān)系。即被測物的量越多,則標(biāo)記物的被稀釋程度也就越大,使標(biāo)記物一特異性結(jié)合試劑復(fù)合物的量逐漸減少,放射性強(qiáng)度側(cè)定就越低。根據(jù)這種原理來對(duì)生物體內(nèi)的微量物質(zhì)進(jìn)行定量測定。以標(biāo)記化合物為P*.,非標(biāo)記化合物為P,特異性結(jié)合試劑為Q,其反應(yīng)式構(gòu)成了放射免疫分析法的理論基礎(chǔ)(圖1)。為了進(jìn)一步闡明放射免疫分析法的原理,我們再用圖2名加以說明。圖2為我們提供簡單的量的概念,圖名中黑圓點(diǎn)代表標(biāo)記抗原,空白圓點(diǎn)代表非標(biāo)記抗原,雙凹型符號(hào)代表抗體,A、B、C、D分別代表四種不同濃度的非標(biāo)記抗原?；跇?biāo)記抗原和非標(biāo)記抗原的理化性質(zhì)相同,與抗體具有相同的結(jié)合力,所以隨著非標(biāo)記抗原含量的增加,標(biāo)記抗原和抗體相結(jié)合的能力所受到的競爭抑制就越大,因而B/F或B/B+F的比值相應(yīng)愈小,呈相反的關(guān)系。圖2放射免疫分析原理示意圖因?yàn)闃?biāo)記抗原對(duì)抗體的結(jié)合被未標(biāo)記抗原的競爭結(jié)合所抑制,于是產(chǎn)生一條抑制曲線相抗體和標(biāo)記抗體同時(shí)反應(yīng),生成夾心狀的抗體-抗原-抗體復(fù)合物,然后去除游離的標(biāo)記抗體,測固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物的放射性計(jì)數(shù)。2.放射免疫技術(shù)發(fā)展雖然RIA具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，測量簡單，成本低等優(yōu)點(diǎn)，但是它最致命的弱點(diǎn)就是使用放射性核素，此外標(biāo)記物有效使用時(shí)間短，難以實(shí)現(xiàn)操作和測量的自動(dòng)化等，它的進(jìn)一步發(fā)展受到一些局限。早在1983年，Witherpoon就在《免疫分析--將來核醫(yī)學(xué)的地位會(huì)存在嗎》就談到了關(guān)于放射免疫技術(shù)的未來的發(fā)展方向，很有可能是被其他先進(jìn)的自動(dòng)化技術(shù)所取代。事實(shí)證明，現(xiàn)在免疫分析技術(shù)都在朝著非同位素標(biāo)記免疫分析的方向發(fā)展，自動(dòng)化儀器已經(jīng)投入到臨床常規(guī)項(xiàng)目的檢測中，使得傳統(tǒng)的RIA使用市場逐漸縮小。但是，RIA和其它放射示蹤技術(shù)仍處在不斷更新?lián)Q代發(fā)展階段。特別是第五代RIA技術(shù)的出現(xiàn)，使得現(xiàn)在的RIA技術(shù)較其他方法在方法學(xué)有了更多的優(yōu)勢，尤其是納米磁性固相的應(yīng)用，為RIA自動(dòng)化的研制提供了很大幫助。此外，在生命科學(xué)的實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域，非放射標(biāo)記免疫技術(shù)始終不能代替RIA。據(jù)李振甲等人的總結(jié)，RIA技術(shù)從開創(chuàng)至今，按照技術(shù)的進(jìn)步大可劃分為五代。第一代(1959～1964年)RIA技術(shù)及競爭結(jié)合蛋白分析法(CPBA)開創(chuàng)。第二代(1965～1970年)眾多學(xué)者對(duì)RIA技術(shù)進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)研究，將RIA和CPBA技術(shù)推進(jìn)到了臨床實(shí)用水平。1968年建立了利用核素標(biāo)記的抗體檢測抗原的放射分析法(IRMA)。第三代(1971～1980年)RIA技術(shù)廣泛的用于小分子化合物的檢測。第四代(1981～1995年)小鼠抗綿羊紅細(xì)胞的單克隆抗體(McAb)的出現(xiàn)為RIA提供了新型特異性抗體，使得放射免疫技術(shù)靈敏度、特異性提高。第五代RIA技術(shù),是目前正在研發(fā)并使用的，它是以磁性微粒子與RIA或IRMA相結(jié)合為特點(diǎn)的。磁性微粒子直徑小、表面連有活性基團(tuán)等特性，使其在包被均一性、反應(yīng)活性等方面都要優(yōu)于經(jīng)典的分析方法。3放射免疫技術(shù)的最新進(jìn)展第五代RIA技術(shù)出現(xiàn)后，相應(yīng)的出現(xiàn)了許多不同的的方法。3.1雙標(biāo)記液相IRMA技術(shù)它是五代RIA技術(shù)中最具推廣意義的。主要特征是將兩株高特異性單克隆抗體(McAb)分別標(biāo)記125I和異硫氰酸熒光素(FITC)共同作為標(biāo)記試劑，待測樣品在液相中生成雙標(biāo)記夾心免疫復(fù)合物，以抗FITC磁性微粒子固相作為分離劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：(1)雙標(biāo)記液相IRMA比普通的IRMA節(jié)省了時(shí)間。(2)對(duì)于中小化合物，雙標(biāo)記液相IRMA法的靈敏度明顯高于酶免疫法和化學(xué)發(fā)光法。(3)檢測量程寬，特異性強(qiáng)，適宜大量樣本檢測。3.2磁性微粒子二抗分離法和磁性微粒子固相一抗法其原理都是以磁性微粒子代替了原來的PR分離劑，免疫反應(yīng)和分離時(shí)間都有不同程度的縮短。兩種方法分析結(jié)果存在一定的系統(tǒng)誤差，由于兩種方法本身的差異以及檢測時(shí)不可避免的環(huán)境因素影響，但此誤差并不影響實(shí)際樣品的檢測及臨床診斷。4.放射免疫技術(shù)的應(yīng)用4.1激素類檢測：(1)在垂體性腺激素：卵泡刺激素(FSH)，黃體生成激素(LH)，睪丸酮(T)，雌二醇(E2)，孕酮(P)，催乳素(PRL)，人生長激素(HGH)，人絨毛膜促性腺激素(HCG)，人胎盤催乳素(HPL)等。(2)甲狀腺腺激素。4.2腫瘤類檢測：甲胎蛋白(AFP)，癌胚抗原(CEA)，糖蛋白抗原(CA19-9)，糖蛋白抗原(CA-125，CA15-3)，β2微球蛋白(β2-MG),鐵蛋白放射免疫分析(SF)，前列腺特意抗原(PSA)。4.3放射受體分析：受體是存在于細(xì)胞表面、胞漿或細(xì)胞核內(nèi)的生物活性物質(zhì)，其功能是和細(xì)胞外的信息分子(配體)特異性結(jié)合，將信息轉(zhuǎn)變?yōu)樯镄?yīng)。放射受體分析(radioreceptorassay，RRA)或受體的放射配體結(jié)合分析(radioligandbindingassay，RBA)是建立在放射性標(biāo)記配體與受體之間的結(jié)合反應(yīng)，它是目前對(duì)受體分子進(jìn)行定量和定位分析研究的靈敏、可靠的一項(xiàng)技術(shù)。臨床上最常見的就是TRAb放射受體分析，血清中TRAb對(duì)甲亢與甲減的病因診斷有重要的意義。此外，在生物設(shè)計(jì)、藥物作用機(jī)理、生物效應(yīng)及疾病的病因探討、診斷和治療等方面的應(yīng)用已有較大發(fā)展。參考文獻(xiàn)常新劍,任俊宏.放射免疫分析法原理及操作注意事項(xiàng).JPMT.2006,13(12):2172-2173鄭柳.放射免疫檢測技術(shù)面臨的現(xiàn)狀與前景.Cont