微專(zhuān)題基因工程熱點(diǎn)突破基因工程的基本操作程序課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

微專(zhuān)題：基因工程中幾個(gè)熱點(diǎn)分析①限制酶的選擇②

PCR影響因素分析③PCR熱點(diǎn)應(yīng)用問(wèn)題④基因編輯

(同源替換

、CRISPR/Cas9系統(tǒng)、Cre/loxP酶系統(tǒng)）⑤酶切片段長(zhǎng)度分析、酶切電泳遺傳學(xué)分析

（電泳圖譜分析）限制酶的選擇[限制酶的選擇原則概括]a.有其識(shí)別序列，且兩方能得到相同末端(相同酶或同尾酶)b.質(zhì)粒上該切點(diǎn)應(yīng)該位于啟動(dòng)子下游、終止子上游c.不破壞目的基因d.不破壞質(zhì)粒完整性（即不能同時(shí)有一種限制酶的多個(gè)切點(diǎn)）e.不破壞質(zhì)粒上的關(guān)鍵因子f.盡量雙酶切（避免自我成環(huán)和反向連接）(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶或同尾酶的切割位點(diǎn))。g.雙酶切點(diǎn)間盡量靠近，不丟失重要序列h.避免無(wú)效切割（即切割點(diǎn)內(nèi)含另一種酶的切割點(diǎn)）i.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，酶切點(diǎn)應(yīng)該位于T-DNA內(nèi)部限制酶的選擇技巧(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點(diǎn)確定限制酶的種類(lèi)①應(yīng)選擇切割位點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，且在質(zhì)粒上也存在該切點(diǎn)或同尾酶切點(diǎn)。如圖甲可選擇Pst。②不能破壞目的基因（切割位點(diǎn)不能位于目的基因內(nèi)部）

如圖甲乙丙丁都不能選擇SmaⅠ。限制酶的選擇技巧(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點(diǎn)確定限制酶的種類(lèi)③盡量使用雙酶切（為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和反向連接）(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切割位點(diǎn))。④避免無(wú)效切割（切割點(diǎn)內(nèi)含另一種同時(shí)使用的酶的切割點(diǎn)）★此時(shí)必須明確限制酶切割序列，參考啟動(dòng)子方向、目的基因上下游等綜合分析EcoRI和BamHI?避免無(wú)效切割【微專(zhuān)題】限制酶的選擇技巧(2)根據(jù)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)、功能特點(diǎn)確定限制酶的種類(lèi)①質(zhì)粒上該切點(diǎn)應(yīng)該位于啟動(dòng)子下游、終止子上游（還要考慮目的基因方向與啟動(dòng)子方向）②不破壞質(zhì)粒完整性（即不能同時(shí)有一種限制酶的多個(gè)切點(diǎn)）③不破壞質(zhì)粒上的關(guān)鍵因子④雙酶切點(diǎn)間盡量靠近，不丟失重要序列EcoRI和HindIII【微專(zhuān)題】限制酶的選擇技巧(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，酶切點(diǎn)應(yīng)該位于Ti質(zhì)粒的T-DNA內(nèi)部。如下圖中甲、乙、丁的Ti質(zhì)粒均不宜選取，而丙的Ti質(zhì)粒宜選取(設(shè)切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ)?！纠?】限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)分別是—CT↓TAAGC—和—G↓AATTC—,下圖表示目的基因和四種質(zhì)粒，其中，質(zhì)粒上箭頭所指部位為酶的識(shí)別位點(diǎn)，陰影部分表示標(biāo)記基因。適于作為圖示目的基因載體的質(zhì)粒是(

)A【例2】目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞之前，需構(gòu)建基因表達(dá)載體，圖甲、乙表示質(zhì)粒及目的基因所在DNA片段，圖中箭頭表示相關(guān)限制酶的切割位點(diǎn)。(1)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)需要使用的工具酶為_(kāi)_____________________。(2)用圖中質(zhì)粒和DNA構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，不能使用SmaⅠ切割，原因是_____________。限制酶和DNA連接酶SmaⅠ會(huì)破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因和外源DNA中的目的基因(3)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，可用EcoRⅠ同時(shí)切割質(zhì)粒和DNA，但會(huì)導(dǎo)致________________________________________________等問(wèn)題，為避免以上問(wèn)題出現(xiàn)，應(yīng)使用____________________________________________兩種限制酶。(4)構(gòu)建好的基因表達(dá)載體在目的基因前要加上________，其是______________識(shí)別和結(jié)合的部位。目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化、目的基因不能定向連接BamHⅠ和HindⅢ(或EcoRⅠ和HindⅢ)啟動(dòng)子RNA聚合酶【例3】(不定項(xiàng))某實(shí)驗(yàn)小組利用下圖所示的質(zhì)粒和目的基因來(lái)構(gòu)建基因表達(dá)載體，將目的基因?qū)氪竽c桿菌細(xì)胞并表達(dá)。下列敘述正確的是(

)A.圖中的質(zhì)粒用酶A切割后，會(huì)產(chǎn)生4個(gè)游離的磷酸基團(tuán)B.在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，可用酶A和酶C切割質(zhì)粒和目的基因C.成功導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌可在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)D.若用酶B和酶C切割，可以避免質(zhì)粒的自身環(huán)化AD【例4】基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，便于重組和篩選。已知限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)是—↓GATC—，根據(jù)圖示分析下列敘述正確的是(

)A.質(zhì)粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割B.用限制酶切割獲得目的基因時(shí)，有四個(gè)磷酸二酯鍵被水解C.限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后獲得的黏性末端不同D.質(zhì)粒中標(biāo)記基因的作用是便于篩選出目的基因已經(jīng)表達(dá)的細(xì)胞

B【例5】下面是幾種不同限制性?xún)?nèi)切核酸酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列敘述錯(cuò)誤的是（）A.以上DNA片段由4種限制酶切割后產(chǎn)生B.②片段是在識(shí)別序列為

的限制酶作用下形成的C.①和④兩個(gè)片段在T4DNA連接酶的作用下不能連接形成重組DNA分子D.限制酶、DNA連接酶和DNA聚合酶作用的部位都是磷酸二酯鍵BA.構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí),用MfeI、HindⅢ切割質(zhì)粒,用EcoRI、HindⅢ切割目的基因B.THP9基因有2個(gè)游離的磷酸基團(tuán),而且游離的磷酸基團(tuán)在3端C.利用PCR技術(shù)獲取THP9基因時(shí)應(yīng)選擇引物1和引物4D.為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米新品種的培育是否成功,需要在個(gè)體水平上檢測(cè)THP9基因是否表達(dá)出蛋白質(zhì)【例6】THP9基因是野生玉米中控制高蛋白含量的優(yōu)良基因,研究者利用基因工程技術(shù)將THP9基因轉(zhuǎn)到玉米細(xì)胞內(nèi),從而獲得轉(zhuǎn)基因高蛋白玉米新品種。已知圖中THP9基因轉(zhuǎn)錄的方向?yàn)閺淖笸?。下列相關(guān)敘述正確的是（

）A【例7】工業(yè)生產(chǎn)奶酪需要添加凝乳酶使牛奶中的蛋白質(zhì)凝聚固化。傳統(tǒng)的制備凝乳酶的方法是通過(guò)殺死未斷奶的小牛，然后將第四胃的黏膜取出來(lái)進(jìn)行提取，目前此法已不能滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。研究人員制備了一種膀胱生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)牛凝乳酶，下圖為所用載體及牛凝乳酶cDNA示意圖。(1)牛凝乳酶cDNA中P1的左側(cè)有RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，為實(shí)現(xiàn)牛凝乳酶基因與載體定向連接，PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)引物時(shí)需在引物的5’端添加相應(yīng)的限制酶識(shí)別序列。據(jù)圖分析，應(yīng)選擇的引物及其對(duì)應(yīng)的限制酶為:P2P3BamHI【例7】工業(yè)生產(chǎn)奶酪需要添加凝乳酶使牛奶中的蛋白質(zhì)凝聚固化。傳統(tǒng)的制備凝乳酶的方法是通過(guò)殺死未斷奶的小牛，然后將第四胃的黏膜取出來(lái)進(jìn)行提取，目前此法已不能滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。研究人員制備了一種膀胱生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)牛凝乳酶，下圖為所用載體及牛凝乳酶cDNA示意圖。（2）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，先用

切割質(zhì)粒，然后用

(填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”)進(jìn)行連接。(3)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)需要選擇的啟動(dòng)子是膀胱上皮細(xì)胞蛋白基因的啟動(dòng)子，目的是

。EcoRV和BamHIT4DNA連接酶能在膀胱上皮細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)【例8】用

DNA

連接酶把被限制酶

l(識(shí)別序列和切點(diǎn)是-↓GATC-)切割過(guò)的運(yùn)載體和被限制酶Ⅱ(識(shí)別序列和切點(diǎn)是-G↓GATC-)切割過(guò)的目的基因連接起來(lái)后,該重組

DNA

分子能夠再被限制酶Ⅱ切割開(kāi)的概率是:（

）A.1/2

B.7/16

C.1/16

D.1/4B2PCR影響因素分析【討論】若只復(fù)制某DNA中的某一段目標(biāo)片段1.引物間有互補(bǔ)序列，引物自身有回文結(jié)構(gòu)會(huì)造成什么結(jié)果？2.引物濃度低會(huì)造成什么影響？3.引物過(guò)短會(huì)造成什么影響？4.復(fù)性（退火）溫度對(duì)結(jié)果有什么影響？特異性差溫度過(guò)低，特異性差，出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物溫度過(guò)高，難結(jié)合，效率低、產(chǎn)量低效率低效率低，或失敗【能力拔高】PCR影響因素深度分析[思維拓展]變性、復(fù)性（退火）溫度對(duì)PCR的影響變性溫度過(guò)低，變性不徹底或迅速?gòu)?fù)性，降低產(chǎn)量變性溫度過(guò)高，DNA聚合酶活性降低甚至失活，降低產(chǎn)量復(fù)性溫度過(guò)低，引物與模板造成與其他基因的錯(cuò)配，特異性降低，出現(xiàn)分特異性擴(kuò)增產(chǎn)物復(fù)性溫度過(guò)高，引物不能與模板緊密結(jié)合，擴(kuò)增效率降低，降低產(chǎn)量[思維拓展]

PCR溫度、時(shí)間的選擇復(fù)性（退火）溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。引物長(zhǎng)度越短，引物中G+C的含量越低，所需的復(fù)性溫度越低。根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)復(fù)性（退火）溫度。引物的復(fù)性溫度可通過(guò)以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值（熔解溫度）=4（G+C）+2（A+T）變性溫度=Tm值ⅹ2復(fù)性溫度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。【討論】若只復(fù)制某DNA中的某一段目標(biāo)片段1.引物間有互補(bǔ)序列，引物自身有回文結(jié)構(gòu)會(huì)造成什么結(jié)果？2.引物濃度低會(huì)造成什么影響？3.引物過(guò)短會(huì)造成什么影響？4.復(fù)性（退火）溫度對(duì)結(jié)果有什么影響？特異性差溫度過(guò)低，特異性差，出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物溫度過(guò)高，難結(jié)合，效率低、產(chǎn)量低效率低效率低，或失敗5.Mg2+濃度對(duì)PCR結(jié)果有什么影響？反向PCR【能力拔高】PCR深度分析及變式應(yīng)用[提醒]練習(xí)中積累RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR（熒光定量PCR）、重疊延伸PCR、大引物PCR、不對(duì)稱(chēng)PCR等過(guò)低，效率低、產(chǎn)量低過(guò)高，特異性差，出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物6.如果沒(méi)有得到目的基因兩端的引物，如何設(shè)計(jì)能進(jìn)行完整的的PCR？3PCR熱點(diǎn)應(yīng)用問(wèn)題（含基因定位）1.擴(kuò)增DNA片段（從DNA分子中擴(kuò)增特定片段——引物的選取）2.DNA測(cè)序（分別以4對(duì)ddNTP、dNTP為原料，PCR得到特定堿基為末端的片段，電泳分析）3.DNA檢測(cè)（只檢測(cè)存在與否用熒光PCR，若檢測(cè)量進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR）RNA檢測(cè)（RT-PCR，只檢測(cè)存在與否用熒光PCR，若檢測(cè)量進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR）4.擴(kuò)增并在5’端修飾限制酶位點(diǎn)或啟動(dòng)子序列（需要設(shè)計(jì)引物，在兩種引物5’端加限制酶識(shí)別序列或啟動(dòng)子序列）5.擴(kuò)增未知序列（反向PCR，利用已有已知序列或修飾上已知片段后，對(duì)已知序列兩側(cè)的未知序列PCR）6.DNA片段拼接（重疊PCR）7.大分子擴(kuò)增（重疊PCR）8.定點(diǎn)突變（在引物對(duì)應(yīng)目的基因內(nèi)部區(qū)域，設(shè)計(jì)個(gè)別堿基與模板不配對(duì)堿基。引物5’端修飾、重疊延伸PCR、大引物PCR）9.重組DNA（交錯(cuò)延伸PCR）10.獲得大量單鏈探針（不對(duì)稱(chēng)PCR）11.提高產(chǎn)物特異性（遞減PCR、巢式PCR、降落傘PCR縮小范圍海選）12.基因定位（系列引物PCR，轉(zhuǎn)基因表達(dá)檢測(cè)）1.DNA片段擴(kuò)增獲取目的基因略2.DN測(cè)序PCR應(yīng)用類(lèi)型簡(jiǎn)介（含基因定位）5’

3’AGCTTCAGTC……TCGTCGAAGTCGAAGTCAG電泳分離PCR應(yīng)用類(lèi)型簡(jiǎn)介（含基因定位）dGTPddGTPTCGTCGAAGdGTPddGTPTCGAAGTCAGdGTPddGTP5’

3’子鏈5’3’TCGAAGTAGC被測(cè)5’CCTGACTTCGATGAAGGTCAAGCTTCAGTCPCR應(yīng)用類(lèi)型簡(jiǎn)介（含基因定位）PCR應(yīng)用類(lèi)型簡(jiǎn)介（含基因定位）1.DNA片段擴(kuò)增獲取目的基因略2.DNA測(cè)序分4組PCR，都含有4種dNTP，每組一種ddNTP，即每組4+1原料得到特定堿基為末端的片段電泳分析，或電泳后檢測(cè)熒光圖譜【進(jìn)一步拓展】1.化學(xué)法DNA測(cè)序DNA末端標(biāo)記，再對(duì)某種堿基進(jìn)行化學(xué)處理（如甲基化、N化、環(huán)化、去除）等，使DNA序列在特定部位斷裂（類(lèi)似于ddNTP處理)2.自動(dòng)化測(cè)序原理同PCR鏈終止法，只是用不同顏色熒光標(biāo)記不同ddNTP，在一個(gè)泳道中直接得到四色圖譜曲線(xiàn)3.芯片測(cè)序PCR應(yīng)用類(lèi)型簡(jiǎn)介（含基因定位）[例]基因檢測(cè)是指通過(guò)檢測(cè)生物體中的DNA序列,以了解生物體基因狀況的技術(shù)于段。Sanger雙脫氧鏈終止法是DNA測(cè)序的基本方法,其原理是:核酸模板在核酸聚合酶、帶有3'-OH末端的單鏈核苷酸引物、四種dNTP存在的條件下復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時(shí),如果在反應(yīng)系統(tǒng)中分別引人單一種類(lèi)的ddNTP(即2,3雙脫氧核苷三磷酸,在脫氧核糖的3'位置缺少一個(gè)羥基,故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵),只要ddNTP參入鏈端,該鏈就停止延長(zhǎng),鏈端摻入dNTP的片段可繼續(xù)延長(zhǎng)。通過(guò)電泳將不同長(zhǎng)度的片段分開(kāi),DNA片段越小,距離起點(diǎn)越遠(yuǎn),根據(jù)末端核苷酸可得到原始序列信息。具體流程如圖。(1)若待測(cè)核酸模板為雙鏈DNA,首先要作

處理,與引物結(jié)合后,在DNA聚合酶作用下子鏈沿

方向(填“5"端向3'端”或“3'端向S'端”)進(jìn)行延伸反應(yīng)。若待測(cè)核酸模板為RNA,則需要在

酶的幫助下合成DNA單鏈片段。(2)ddNTP為2,3-雙脫氧核苷三磷酸,只要ddNTP接入鏈端,該鏈就停止延長(zhǎng)的原因是

.

(3)假設(shè)某反應(yīng)體系中,待測(cè)DNA單鏈序列3‘-GTACCCTA-5’,加人4種dNTP和ddATP,經(jīng)過(guò)雙脫氧鏈終止法處理,會(huì)得到

種片段,其中最短的片段序列是

。

(4)假設(shè)某次Sanger雙脫氧鏈終止法測(cè)序得到的電泳圖如上圖所示,則待測(cè)DNA序列從5‘端到3’端為_(kāi)

。

新鏈：3‘-TACCAGTAGT-5‘變性

5'端向3'端逆轉(zhuǎn)錄3號(hào)碳上不是羥基，不能與下一個(gè)脫氧核苷酸的磷酸基團(tuán)形成磷酸二酯鍵3CddA5‘-ATGGTCATCA-3‘[思維拓展]

如何鑒定DNA分子結(jié)構(gòu)的改變(基因突變)？DNA測(cè)序DNA分子雜交PCR+電泳CT值大小，反映測(cè)定初始的核酸濃度3.DNA檢測(cè)、RNA檢測(cè)PCR應(yīng)用類(lèi)型簡(jiǎn)介（含基因定位）DNA檢測(cè)：只檢測(cè)存在與否用電泳檢測(cè)，若檢測(cè)量進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR）RNA檢測(cè)：RT-PCR，只檢測(cè)存在與否電泳檢測(cè)，若檢測(cè)量進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR）重要應(yīng)用：檢測(cè)表達(dá)水平[例]實(shí)時(shí)熒光RT-PCR可用于RNA病毒的核酸檢測(cè),其原理是:在PCR復(fù)性過(guò)程中探針和引物一起與模板結(jié)合，探針兩側(cè)分別帶有熒光基團(tuán)和抑制熒光發(fā)岀的淬滅基團(tuán)，新鏈延伸過(guò)程中,DNA聚合酶會(huì)破壞探針，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離而發(fā)岀熒光。利用RT-PCR進(jìn)行核酸檢測(cè)的相關(guān)過(guò)程如圖所示。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是()A.RT-PCR技術(shù)需要用到逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶

B.PCR過(guò)程中需加入兩種引物和4種dNTPC.引物和探針都需與目的基因進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)

D.若檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有熒光發(fā)岀，說(shuō)明被檢測(cè)者感染了病毒D4.擴(kuò)增并在5’端修飾限制酶位點(diǎn)或啟動(dòng)子序列PCR應(yīng)用類(lèi)型簡(jiǎn)介（含基因定位）需要設(shè)計(jì)引物，在兩種引物5’端加限制酶識(shí)別序列或啟動(dòng)子序列或做首端突變）①②鏈完成[例](多選)通過(guò)設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用PCR技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)目的基因的定點(diǎn)突變。如圖為基因工程中獲取突變基因的過(guò)程，其中引物1序列中含有一個(gè)堿基T不能與目的基因片段配對(duì)，但不影響引物與模板鏈的整體配對(duì)，反應(yīng)體系中引物1和引物2的5′端分別設(shè)計(jì)增加限制酶a和限制酶b的識(shí)別位點(diǎn)。有關(guān)敘述正確的是(

)A.引物中設(shè)計(jì)兩種限制酶識(shí)別位點(diǎn)有利于目的基因定向插入B.在PCR反應(yīng)體系中還需要加入4種游離核苷酸、解旋酶、Taq酶等C.第3輪PCR，引物1能與圖中②結(jié)合并且形成兩條鏈等長(zhǎng)的突變基因D.第3輪PCR結(jié)束后，含突變堿基對(duì)且兩條鏈等長(zhǎng)的DNA占1/2AC5.擴(kuò)增未知序列——反向PCRPCR應(yīng)用類(lèi)型簡(jiǎn)介（含基因定位）（利用已有已知序列，對(duì)已知序列兩側(cè)的未知序列PCR）【素材】反向PCR——與已知片段的引物相反，擴(kuò)增未知序列片段（因?yàn)镈NA聚合酶必須從引物3’端開(kāi)始延伸子鏈DNA）★此法也可以對(duì)未知目的基因末端序列情況下對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增（在其中部插入已知片段進(jìn)行反向PCR），但不如兩端修飾已知序列更簡(jiǎn)單。★此法PCR直接產(chǎn)物不是原來(lái)順序，需要進(jìn)一步測(cè)序分析或酶切恢復(fù)復(fù)原來(lái)順序待測(cè)未知序列同種酶A剪切連接成環(huán)已知序列插入已知序列連接為將來(lái)設(shè)計(jì)引物同種酶B剪切兩端3’5’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’設(shè)計(jì)引物當(dāng)初各切點(diǎn)序列都已知，可以再切割、連接得到大量未知序列的拷貝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’引物a5’3’引物b3’5’引物b3’5’引物a5’3’5’3’5’3’引物b3’5’引物a5’3’PCR[例]反向PCR可擴(kuò)增已知序列兩端的未知序列。如圖所示，在一段未知序列的突變體DNA片段中，插入了已知序列的T-DNA，要想對(duì)T-DNA兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增，下列做法正確的是(

)A.用引物①和引物④直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增

B.用限制酶酶切后連接成環(huán)狀DNA，再用引物①④進(jìn)行PCR擴(kuò)增C.用引物②和引物③直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增

D.用限制酶酶切后連接成環(huán)狀DNA，再用引物②③進(jìn)行PCR擴(kuò)增C6.

DNA片段拼接——重疊PCRPCR應(yīng)用類(lèi)型簡(jiǎn)介（含基因定位）互為引物末端修飾①④②③7.大分子DNA擴(kuò)增——重疊PCRPCR應(yīng)用類(lèi)型簡(jiǎn)介（含基因定位）【素材】重疊PCR——分子過(guò)大PCR很難成功，需要分成兩段分別PCR，只要存在一定互補(bǔ)序列（搭橋），可以最后再連接成完整大片段?；蜻M(jìn)行定點(diǎn)突變或目的基因修飾酶切位點(diǎn)修飾。兩個(gè)反應(yīng)體系[例]重疊延伸PCR技術(shù)是一種通過(guò)寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板,通過(guò)多次PCR擴(kuò)增，從而獲得目的基因的方法。該技術(shù)在擴(kuò)增較長(zhǎng)片段的DNA、不同來(lái)源的DNA片段拼接、基因的定點(diǎn)突變等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。如圖是利用重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增某目的基因的過(guò)程。下列分析不正確的是(

)A.第一階段過(guò)程中的產(chǎn)物是依賴(lài)引物1、2和引物3、4擴(kuò)增的結(jié)果B.引物2和引物3上不能含有與模板鏈不能互補(bǔ)的堿基C.PCR過(guò)程中需要先加熱至90℃以上再冷卻至50℃左右D.第三階段需要利用引物1和引物4獲得目的基因B

8.定點(diǎn)突變1——引物修飾PCR應(yīng)用類(lèi)型簡(jiǎn)介（含基因定位）（在引物對(duì)應(yīng)目的基因內(nèi)部區(qū)域，設(shè)計(jì)個(gè)別堿基與模板不配對(duì)堿基的引物）（4中引物5’端修飾，就是使基因末端序列突變）（1）——引物5’端修飾8.定點(diǎn)突變PCR應(yīng)用類(lèi)型簡(jiǎn)介（含基因定位）（2）——重疊延伸PCR兩個(gè)PCR體系混合雜交互為引物延伸普通PCR該技術(shù)要使用四條引物。其中引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點(diǎn)，而這兩條引物有部分堿基（包括突變位點(diǎn)）是可以互補(bǔ)的。①分別利用引物F和Rm，引物Fm和R進(jìn)行PCR②得到的DNA片段可以通過(guò)引物互補(bǔ)的堿基雜交在一起，③再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成為一條完整的DNA片段。④最后，用引物F和R進(jìn)行擴(kuò)增得到含有突變位點(diǎn)的DNA片段。通過(guò)測(cè)序可以檢驗(yàn)定點(diǎn)突變是否成功。8.定點(diǎn)突變PCR應(yīng)用類(lèi)型簡(jiǎn)介（含基因定位）（在引物對(duì)應(yīng)目的基因內(nèi)部區(qū)域，設(shè)計(jì)個(gè)別堿基與模板不配對(duì)堿基的引物）（3）——大引物PCR大引物PCR需要用到三條引物（兩條原備，一條PCR獲得）進(jìn)行兩輪PCR，這三條引物分別是突變上游引物、常規(guī)上游引物和常規(guī)下游引物。該技術(shù)的流程如圖所示。①第一輪PCR利用突變上游引物和常規(guī)下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到不完整的含有突變位點(diǎn)的DNA片段（即獲得下游大引物）；②第二輪PCR利用第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物中的一條DNA鏈作為下游大引物，它與常規(guī)上游引物一起擴(kuò)增得到完整的含有突變位點(diǎn)的DNA片段。非PCR定點(diǎn)突變不依賴(lài)PCR的定點(diǎn)突變技術(shù)的核心是人工合成帶有突變位點(diǎn)的寡核苷酸片段，再借助在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變。這類(lèi)技術(shù)中比較成熟的有盒式突變、寡核苷酸引導(dǎo)的突變等。盒式突變的原理是，利用一段人工合成的含有突變位點(diǎn)的雙鏈寡核苷酸片段來(lái)替換目的基因中相應(yīng)的片段，從而在目的基因中引人突變位點(diǎn)。寡核苷酸引導(dǎo)的突變的技術(shù)流程如圖3-11所示。[2]首先人工合成一段含有特定突變位點(diǎn)的單鏈寡核苷酸片段(除突變位點(diǎn)外，該片段的其他部分可以與目的基因互補(bǔ)配對(duì));然后將該寡核苷酸片段與帶有目的基因的單鏈載體(通常由M13噬菌體衍生而來(lái))進(jìn)行雜交;繼而在DNA聚合酶和DNA連接酶的作用下分別進(jìn)行DNA鏈的合成和連接反應(yīng)，得到含有突變位點(diǎn)的雙鏈載體;最后將雙鏈載體引人宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制，并進(jìn)行選和鑒定9.重組DNA——交錯(cuò)延伸PCRPCR應(yīng)用類(lèi)型簡(jiǎn)介（含基因定位）交錯(cuò)延伸(staggerextensionprocess,StEP)是在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，以?xún)蓚€(gè)以上相關(guān)的DNA片段（即同源性DNA）為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物先在一個(gè)模板鏈上延伸，隨之進(jìn)行多輪變性、短暫復(fù)性的過(guò)程。在每一輪PCR循環(huán)中，之前延伸的小片段均會(huì)隨機(jī)的與一個(gè)模板堿基互補(bǔ)配對(duì)繼續(xù)延伸，由于模板的轉(zhuǎn)換而實(shí)現(xiàn)不同模板間的重組，最終實(shí)現(xiàn)全長(zhǎng)基因片段的獲得。（每一輪只復(fù)制一段就停止）基本步驟為：1）變性模板鏈與引物結(jié)合2）短暫延伸形成小片段3）另一循環(huán)時(shí)，小片段與模板隨機(jī)結(jié)合作為引物（templateswitching）并繼續(xù)延伸（退火溫度應(yīng)該稍低，畢竟特異性在降低）4）重復(fù)上述過(guò)程直至全長(zhǎng)基因形成即最終得到新組合的基因得到大量突變體組合體10.獲得大量DNA單鏈探針——不對(duì)稱(chēng)PCRPCR應(yīng)用類(lèi)型簡(jiǎn)介（含基因定位）【素材】不對(duì)稱(chēng)PCR正常的PCR反應(yīng)需要一對(duì)相對(duì)配置的引物同時(shí)擴(kuò)增的兩條模板鏈。如果只加入一條引物，那么將會(huì)只擴(kuò)增一條模板鏈。像這種加入一條引物擴(kuò)增的PCR反應(yīng)叫不對(duì)稱(chēng)PCR，主要只擴(kuò)增一條模板鏈。通常用于獲得大量的單鏈模板。實(shí)際操作時(shí)，為了增加模板量，也可以加入一對(duì)引物，只是兩條引物在濃度上應(yīng)存在差異?？芍苽鋯捂淒NA片段用于序列分析或核酸雜交的探針。假設(shè)反應(yīng)體系中原來(lái)有a個(gè)模板DNA，最初10個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)生雙鏈DNA，后20個(gè)循環(huán)均只擴(kuò)增一條鏈，則需要限制性引物

______個(gè)，需要非限制性引物

個(gè)。因?yàn)殡p鏈DNA和單鏈DNA的

不同，可通過(guò)電泳方法將其分離。（210-1）a

（

21?210-1）a

相對(duì)分子質(zhì)量（分子大小）[例]不對(duì)稱(chēng)PCR是利用不等量的一對(duì)引物來(lái)產(chǎn)生大量單鏈DNA的方法。這兩種引物分別為限制性引物與非限制性引物，其最佳比例一般為1：50～1：100，在PCR反應(yīng)的最初10-15個(gè)循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物最初主要是雙鏈DNA，但當(dāng)限制性引物消耗完后，非限制性引物引導(dǎo)的PCR就會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈DNA。假設(shè)反應(yīng)體系中原來(lái)有a個(gè)模板DNA，最初10個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)生雙鏈DNA，后20個(gè)循環(huán)均只擴(kuò)增一條鏈，則需要限制性引物

__

___個(gè)，需要非限制性引物

______

個(gè)。因?yàn)殡p鏈DNA和單鏈DNA的

______

不同，可通過(guò)電泳方法將其分離。（

21?210-1）a

相對(duì)分子質(zhì)量（堿基數(shù)量）（210-1）a11.提高產(chǎn)物特異性——降落傘PCR（遞減PCR）、巢式PCRPCR應(yīng)用類(lèi)型簡(jiǎn)介（含基因定位）2.巢式PCR先用一對(duì)引物（位于模板外側(cè)）完成15~20個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，將產(chǎn)物稀釋后作為模板進(jìn)行第二輪PCR，所用引物位于第一對(duì)引物的內(nèi)側(cè)。即巢式PCR共使用的兩對(duì)引物，進(jìn)行了兩輪PCR。第二次擴(kuò)增可以減少或排除第一次擴(kuò)增中出現(xiàn)的非特異性產(chǎn)物，所以該操作可以提高PCR的特異性和靈敏度。可用于極少量DNA模板的擴(kuò)增1.遞減PCR開(kāi)始先設(shè)定一個(gè)比較高的復(fù)性溫度，每個(gè)循環(huán)復(fù)性溫度下降1℃，到一個(gè)較低溫度以后每個(gè)循環(huán)的復(fù)性溫度保持不變直到結(jié)束。在剛下降到特異性結(jié)合可以進(jìn)行的最高溫度時(shí)，可以達(dá)到最高的特異性。這樣在起初的幾個(gè)循環(huán)中，特異性擴(kuò)增序列可以相對(duì)非特異性序列多擴(kuò)增若干倍，從而減輕非特異性擴(kuò)增對(duì)結(jié)果的干擾。這種方法可用于省去多次試驗(yàn)最佳復(fù)性溫度的工作。12.基因定位PCR應(yīng)用類(lèi)型簡(jiǎn)介（含基因定位）（系列引物PCR，分片段PCR，分析堿基對(duì)的增添[例]亞洲棉的突變型光籽和野生型毛籽是一對(duì)相對(duì)性狀，研究發(fā)現(xiàn)，亞洲棉某突變體的光籽表型與8號(hào)染色體的～880kb至～903kb區(qū)間相關(guān)，研究人員根據(jù)野生型毛籽棉的該區(qū)間設(shè)計(jì)連續(xù)的重疊引物進(jìn)行PCR，產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果如圖所示，下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是（

）A.應(yīng)提取該突變體和野生型亞洲棉的8號(hào)染色體的～880kb至～903kb區(qū)間DNA進(jìn)行PCRB.上圖中PCR產(chǎn)物的鑒定是通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)進(jìn)行的C.據(jù)圖分析可知，分子量較大的擴(kuò)增產(chǎn)物與點(diǎn)樣處的距離較小D.該突變體出現(xiàn)的原因是第6對(duì)引物對(duì)應(yīng)區(qū)間發(fā)生了基因突變的替換類(lèi)型DPCR應(yīng)用類(lèi)型簡(jiǎn)介（含基因定位）[例]下圖用F1—F7和R多組引物，確定啟動(dòng)子中某關(guān)鍵作用序列4基因編輯簡(jiǎn)介（

同源替換

、CRISPR/Cas9系統(tǒng)、Cre/loxP酶系統(tǒng)）1.同源重組法同源重組法替換、敲除基因、基因修飾編輯。是基于基因在自然界中的重組現(xiàn)象——交叉互換，利用目標(biāo)片段兩端與替換序列兩端存在同源序列，發(fā)生交叉互換成功插入利用特定復(fù)合物CRISPR/Cas9系統(tǒng)，通過(guò)RNA與特定DNA片段結(jié)合，由蛋白質(zhì)（相當(dāng)于限制酶，只不過(guò)不是它識(shí)別特定序列，而是由我們?cè)O(shè)計(jì)的RNA執(zhí)行）切割，以達(dá)到替換、敲除、修飾、修復(fù)原有基因序列的目的。2.

CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯3.

Cre/loxP酶系統(tǒng)編輯Cre與特定啟動(dòng)子結(jié)合發(fā)揮作用，誘導(dǎo)剪切，方便可控特定刪除兩個(gè)loxP序列之間的DNA序列。選擇性表達(dá)(1)一個(gè)Loxp位點(diǎn)被Cre重組酶切割后會(huì)水解2個(gè)磷酸二酯鍵。請(qǐng)畫(huà)出載體A被Cre重組酶切割后產(chǎn)生的黏性末端【對(duì)位練】Cre重組酶最早于1981年在P1菌體中發(fā)現(xiàn)，該酶由343個(gè)氨基酸組成，除了擁有催化活性外,同時(shí)還可以識(shí)別特定序列Loxp位點(diǎn),該位點(diǎn)同樣在P1菌體中被發(fā)現(xiàn)，序列長(zhǎng)度為34bp。【對(duì)位練】Cre重組酶最早于1981年在P1菌體中發(fā)現(xiàn)，該酶由343個(gè)氨基酸組成，除了擁有催化活性外,同時(shí)還可以識(shí)別特定序列Loxp位點(diǎn),該位點(diǎn)同樣在P1菌體中被發(fā)現(xiàn)，序列長(zhǎng)度為34bp。A兩個(gè)末端互補(bǔ)但不相同A’A’AA’AA’A’(2)在目的基因兩端加上Loxp序列后,有助于將目的基因與載體重組。利用PCR技術(shù)對(duì)目的基因B改造，關(guān)鍵是引物的設(shè)計(jì)，引物的作用是_。其中途徑_(填寫(xiě)“①”或“②”)，得到的改造后的目的基因能與載體A進(jìn)行重組。①【對(duì)位練】Cre重組酶最早于1981年在P1菌體中發(fā)現(xiàn)，該酶由343個(gè)氨基酸組成，除了擁有催化活性外,同時(shí)還可以識(shí)別特定序列Loxp位點(diǎn),該位點(diǎn)同樣在P1菌體中被發(fā)現(xiàn)，序列長(zhǎng)度為34bp。(3)利用上述方法構(gòu)建目的基因B與載體A的重組載體需要使用的酶是_。這與使用同一種限制酶構(gòu)建基因表達(dá)載體相比，前者具有的優(yōu)點(diǎn)是防止質(zhì)粒與目的基因反向鏈接不能防止自我成環(huán)A兩個(gè)末端互補(bǔ)但不相同A’A’AA’AA’A’5酶切電泳遺傳學(xué)分析酶切片段長(zhǎng)度分析【例1】（不定項(xiàng)）苯丙酮尿癥（PKU）是一種由致病基因決定的氨基酸代謝病，常造成新生兒神經(jīng)系統(tǒng)損害而智力低下，下圖1是某家族中該病的遺傳系譜圖。為避免再生下患兒，該家族成員去醫(yī)院進(jìn)行了基因檢測(cè)，已知被檢測(cè)的PKU基因?yàn)?42bp（bp表示堿基對(duì)）。檢測(cè)人員用特定限制酶酶切部分家庭成員（Ⅲ1、Ⅲ2、III3）的PKU基因，產(chǎn)生了大小不同的幾種片段。結(jié)果如圖2所示。下列敘述正確的是（)A.苯丙酮尿癥是單基因遺傳病，由一個(gè)基因決定B.若III2與III3近親結(jié)婚，生一個(gè)患病孩子的概率是0C.III1的每個(gè)PKU基因中均有2個(gè)該特定限制酶的酶切位點(diǎn)D.該致病等位基因的出現(xiàn)是因?yàn)榘l(fā)生堿基對(duì)的缺失

PCR應(yīng)用類(lèi)型簡(jiǎn)介（含基因定位）PKU基因142bp隱性遺傳aa42100Aa504250504250a1004210042AA504250aIII1III2III3【例1】（不定項(xiàng)）苯丙酮尿癥（PKU）是一種由致病基因決定的氨基酸代謝病，常造成新生兒神經(jīng)系統(tǒng)損害而智力低下，下圖1是某家族中該病的遺傳系譜圖。為避免再生下患兒，該家族成員去醫(yī)院進(jìn)行了基因檢測(cè)，已知被檢測(cè)的PKU基因?yàn)?42bp（bp表示堿基對(duì)）。檢測(cè)人員用特定限制酶酶切部分家庭成員（Ⅲ1、Ⅲ2、III3）的PKU基因，產(chǎn)生了大小不同的幾種片段。結(jié)果如圖2所示。下列敘述正確的是（)A.苯丙酮尿癥是單基因遺傳病，由一個(gè)基因決定B.若III2與III3近親結(jié)婚，生一個(gè)患病孩子的概率是0C.III1的每個(gè)PKU基因中均有2個(gè)該特定限制酶的酶切位點(diǎn)D.該致病等位基因的出現(xiàn)是因?yàn)榘l(fā)生堿基對(duì)的缺失

BCaaAAAa用限制酶EcoRV、Mbol單獨(dú)或聯(lián)合切割同一種質(zhì)粒，得到的DNA片段長(zhǎng)度如下圖(1kb即1000個(gè)堿基對(duì))，請(qǐng)?jiān)诖痤}卡的指定位置畫(huà)出質(zhì)粒上EcoRV、Mbol的切割位點(diǎn)?！纠?】甲型血友病是由X染色體上的隱性基因?qū)е碌倪z傳病(H對(duì)h為顯性)。圖1中兩個(gè)家系都有血友病發(fā)病史,Ⅲ2和Ⅲ3婚后生下一個(gè)性染色體組成是XXY的非血友病兒子(Ⅳ2),家系中的其他成員性染色體組成均正常。0(1)根據(jù)圖1,

(填“能”或“不能”)確定Ⅳ2兩條X染色體的來(lái)源;Ⅲ4與正常女子結(jié)婚,推斷其女兒患血友病的概率是

。不能(2)兩個(gè)家系的甲型血友病均由凝血因子Ⅷ(簡(jiǎn)稱(chēng)F8,即抗血友病球蛋白)基因堿基對(duì)缺失所致。為探明Ⅳ2的病因,對(duì)家系的第Ⅲ、Ⅳ代成員F8基因的特異片段進(jìn)行了PCR擴(kuò)增,其產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2所示,結(jié)合圖1,推斷Ⅲ3的基因型是

。請(qǐng)用圖解和必要的文字說(shuō)明Ⅳ2非血友病XXY的形成原因?！纠?】甲型血友病是由X染色體上的隱性基因?qū)е碌倪z傳病(H對(duì)h為顯性)。圖1中兩個(gè)家系都有血友病發(fā)病史,Ⅲ2和Ⅲ3婚后生下一個(gè)性染色體組成是XXY的非血友病兒子(Ⅳ2),家系中的其他成員性染色體組成均正常。XHXh在Ⅲ3形成卵細(xì)胞過(guò)程中的減數(shù)第二次分裂后期，帶有基因H的姐妹染色單體移向細(xì)胞同一極，形成XHXH的卵細(xì)胞．XHXH的卵細(xì)胞與正常精子結(jié)合形成XHXH的受精卵．【例2】甲型血友病是由X染色體上的隱性基因?qū)е碌倪z傳病(H對(duì)h為顯性)。圖1中兩個(gè)家系都有血友病發(fā)病史,Ⅲ2和Ⅲ3婚后生下一個(gè)性染色體組成是XXY的非血友病兒子(Ⅳ2),家系中的其他成員性染色體組成均正常。(3)現(xiàn)Ⅲ3再次懷孕,產(chǎn)前診斷顯示胎兒(Ⅳ3)細(xì)胞的染色體為46,XY;F8基因的PCR檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。由此建議Ⅲ3

。終止妊娠【例3】A基因中含兩種限制酶BamHI和MspI（5'C↓CGG3’）的酶切位點(diǎn)，HpaⅡ和MspI酶切位點(diǎn)相同，酶切位點(diǎn)處的胞嘧啶可能被甲基化，HpaⅡ?qū)Π奏ぜ谆舾校床荒芮懈罴谆拿盖形稽c(diǎn)），而MspI則對(duì)胞嘧啶甲基化不敏感。某種小鼠（Aa）有兩種表型，用每種表型的小鼠A基因分別做了三組的酶切實(shí)驗(yàn)：第一組單獨(dú)使用BamHI，第二組使用BamHI+MspI，第三組使用BamHI+HpⅡ；每組完全酶切產(chǎn)物（每一個(gè)酶切位點(diǎn)均被切割）通過(guò)電泳分離并使用探針得到雜交帶，如圖所示。下列敘述錯(cuò)誤的是（

）A.第一組處理后均可得到包含探針的8.9kb基因片段B.若表型1中的A基因經(jīng)過(guò)第二組和第三組處理后的酶切結(jié)果分別是3.5kb和8.9kb，說(shuō)明表型1中的A基因中四個(gè)MspI酶切位點(diǎn)均被甲基化C.若表型2中A基因第三組酶切結(jié)果介于3.5kb和8.9kb之間，說(shuō)明A基因中至少有2個(gè)HpaⅡ酶切位點(diǎn)被甲基化D.該種小鼠（Aa）有兩種表型可能是因?yàn)锳基因甲基化程度不同影響了基因的表達(dá)C【例4】下圖是構(gòu)建基因表達(dá)載體示意圖，請(qǐng)回答問(wèn)題：(1)通過(guò)①過(guò)程獲得的重組質(zhì)粒含有4.9kb個(gè)堿基對(duì)，其中manA基因含有1.8kb個(gè)堿基對(duì)?，F(xiàn)將該重組質(zhì)粒成功導(dǎo)入受體細(xì)胞后，經(jīng)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)約有50%的細(xì)胞能正常表達(dá)目的基因產(chǎn)物，原因是

.(2)若用BamHI和EcoRI聯(lián)合酶切割其中一種重組質(zhì)粒，只能獲得1.7kb和3.2kb兩種DNA片段，若用上述聯(lián)合酶切割同等長(zhǎng)度的另一種重組質(zhì)粒，則可獲得

kb長(zhǎng)度兩種的DNA片段。目的基因與質(zhì)粒連接時(shí)，有正向連接和反向連接兩種結(jié)果1.4和3.5【典例5】回答下列有關(guān)遺傳信息傳遞與表達(dá)的問(wèn)題。在圖所示的質(zhì)粒PZHZ11（總長(zhǎng)為3.6kb，1kb=1000對(duì)堿基因）中，lacZ基因編碼β-半乳糖苷酶，后者催化生成的化合物能將白色的大腸桿菌染成藍(lán)色。（1）若先用限制酶BamHI切開(kāi)pZHZ11，然后滅活BamHI酶，再加DNA連接酶進(jìn)行連接，最后將連接物導(dǎo)入足夠數(shù)量的大腸桿菌細(xì)胞中，則含3.1kb質(zhì)粒的細(xì)胞顏色為

；含3.6kb質(zhì)粒的細(xì)胞顏色為

。白色白色和藍(lán)色/白色或藍(lán)色

（2）若將兩端分別用限制酶BamHI和BglHI切開(kāi)的單個(gè)目的基因片段置換pZHZ11中0.5kb的BamHI酶切片段，形成4.9kb的重組質(zhì)粒，則目的基因長(zhǎng)度為

kb。1.8【典例5】回答下列有關(guān)遺傳信息傳遞與表達(dá)的問(wèn)題。（3）上述4.9kb的重組質(zhì)粒有兩種形式，若用BamHI和EcoRI聯(lián)合酶切其中一種，只能獲得1.7kb和3.2kb兩種DNA片段；那么聯(lián)合酶切同等長(zhǎng)度的另一種重組質(zhì)粒，則可獲得

kb和

kb兩種DNA片段。1.43.5【典例5】回答下列有關(guān)遺傳信息傳遞與表達(dá)的問(wèn)題。（4）用限制酶EcoRV、Mbol單獨(dú)或聯(lián)合切割同一種質(zhì)粒，得到的DNA片段長(zhǎng)度如下圖(1kb即1000個(gè)堿基對(duì))，請(qǐng)?jiān)诖痤}卡的指定位置畫(huà)出質(zhì)粒上EcoRV、Mbol的切割位點(diǎn)。pIJ702是一種常用質(zhì)粒，其中tsr為硫鏈絲菌素（一種抗生素）抗性基因，mel是黑色素合成基因，其表達(dá)能使白色的鏈霉菌菌落變成黑色菌落；而限