高三生物二輪復(fù)習(xí)課件PCR中的引物

生物技術(shù)與工程基因工程高中生物二輪復(fù)習(xí)微專題·PCR引物

PCR技術(shù)中“引物”歸類分析新舊教材對比增：①DNA的粗提取與鑒定；②DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定；③基因工程在食品工業(yè)方面的應(yīng)用。改：①PCR技術(shù)內(nèi)容更充實(shí)；②DNA重組技術(shù)改為重組DNA技術(shù)；③關(guān)注生物技術(shù)的倫理問題改為關(guān)注生殖性克隆人。淡化：①從基因文庫中獲取目的基因精減為一句話；②農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法變?yōu)橘Y料卡考點(diǎn)由高考知核心知識點(diǎn)預(yù)測基因工程的基本工具和基本操作程序考點(diǎn)一：重組DNA技術(shù)的基本工具（3年12考，全國卷3年1考）2024·貴州（選擇題）、2024·湖南（選擇題）2024·江西（解答題）、2023·湖北（選擇題）2022·湖南（選擇題）題型：選擇題、解答題內(nèi)容：考基因工程是選修教材中的重點(diǎn)考察內(nèi)容之一，基因工程的基本操作程序、蛋白質(zhì)工程的原理是重高頻考點(diǎn)，山東卷北京卷廣東卷兼顧了實(shí)驗(yàn)“DNA的粗提取與鑒定”?？键c(diǎn)二：基因工程的基本操作程序（3年40考，全國卷3年3考）2024·福建（選擇題）、2024·海南（解答題）2024·重慶（解答題）、2024·貴州（解答題）2024·江西（解答題）、2024·北京（解答題）2024·浙江（解答題）、2024·湖南（解答題）2024·吉林（解答題）、2024·全國（選擇題）2024·寧夏（解答題）、2024·安徽（解答題）2023·江蘇（選擇題）、2023·廣東（選擇題）2022·北京（選擇題）、2022·山東（選擇題）考點(diǎn)三：DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的

擴(kuò)增與電泳鑒定（3年9考，全國卷3年0考）考情分析高中生物二輪復(fù)習(xí)微專題·PCR引物

PCR技術(shù)中“引物”歸類分析01引物存在的必要性02引物的設(shè)計0304PCR循環(huán)時與引物相關(guān)的計算引物的選擇和互補(bǔ)鏈的判斷PCR技術(shù)中“引物”歸類分析05引物與PCR反應(yīng)時復(fù)性溫度和時間的關(guān)系1.1DNA的復(fù)制需要引物

DNA聚合酶只能催化脫氧核糖核苷酸加至已有核酸鏈的游離3'-羥基上，而不能使脫氧核糖核苷酸自身發(fā)生聚合，即它需要引物鏈的存在。引物是一小段DNA或RNA，它能與DNA母鏈的一段堿基互補(bǔ)配對。細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制以RNA作引物，從新合成的岡崎片段上發(fā)現(xiàn)含有一短暫存在的小的RNA片段附著在5'端這一事實(shí)，可說明DNA復(fù)制時需要RNA引物，這些引物長5~10bp，現(xiàn)已知RNA引物的合成是由一種特殊的RNA合成酶——引物酶所催化的。PCR反應(yīng)以DNA作引物。1.引物存在的必要性DNA的復(fù)制需要引物例1（2011年江蘇卷）請回答基因工程方面的有關(guān)問題;PCR反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下面的表達(dá)式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因?yàn)開_____________。1.引物存在的必要性答案：DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能將單個脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合至雙鏈DNA片段的引物鏈上。引物的作用DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從3'端延伸DNA鏈。當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3'端開始延伸DNA鏈。不同的引物可結(jié)合不同的目的基因并進(jìn)行擴(kuò)增。例2.請回答基因工程方面的有關(guān)問題：（1）若用PCR技術(shù)擴(kuò)增psy基因和crtI基因，需要分別在不同的PCR擴(kuò)增儀中加入__種引物，其作用是_________________________。（2）在利用PCR技術(shù)擴(kuò)增R（抗旱）或

r

基因過程中，利用_______可尋找抗旱基因的位置并進(jìn)行擴(kuò)增。（3）通過PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性的擴(kuò)增出Wx基因的cDNA,原因是_________________________。1.引物存在的必要性答案∶（1）2；引物與DNA模板鏈通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合，使DNA聚合酶從引物的3‘端開始連接脫氧核苷酸，從而延伸DNA子鏈；（2）引物。（3）引物是根據(jù)Wx基因的一段已知序列設(shè)計合成的

2.引物的設(shè)計例1.引物的結(jié)合方向（二輪復(fù)習(xí)資料P124）如圖為X蛋白的部分基因序列，所示序列為引物結(jié)合的部分，據(jù)圖分析：擴(kuò)增X蛋白基因所需的引物序列是_________________________________；______________________________。5′-ATGCCGTAAGTCCTAC-3′5′-TGATCTACGGCTTACA-3′書寫引物序列，一般從引物的5′端向3′端書寫，避免誤判。圖中位于上方的模板鏈5′端磷酸基團(tuán)在左側(cè)，3′端羥基在右側(cè)，可知與上方模板鏈配對的引物5′端在右側(cè)，3′端在左側(cè)，引物序列為5′-TGATCTACGGCTTACA-3′。同理推測另外一條引物的序列。例2.引物的修飾（二輪復(fù)習(xí)資料P124）(1)(2022·山東，25節(jié)選)某種類型的白血病由蛋白P引發(fā)，蛋白UBC可使P被蛋白酶識別并降解，藥物A可通過影響這一過程對該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機(jī)理，需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，F(xiàn)LAG是一種短肽，連接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合，但不影響P或PΔ的功能。①為構(gòu)建重組載體，需先設(shè)計引物，通過PCR特異性擴(kuò)增P基因。用于擴(kuò)增P基因的引物需滿足的條件是_________________________________________________________，為使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，需在引物上添加相應(yīng)的限制酶識別序列，該限制酶識別序列應(yīng)添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。能與P基因模板鏈3′端的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸5′端②PCR擴(kuò)增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個融合基因，如圖所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后，融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同。據(jù)圖分析，出現(xiàn)該問題的原因是__________________________________________________________________________________________________。修改擴(kuò)增P基因時使用的帶有EcoR

Ⅰ識別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是__________________________________________。P基因編碼鏈的第一個堿基與EcoRⅠ識別序列的最后兩個堿基編碼一個氨基酸，導(dǎo)致mRNA的密碼子被錯位讀取在引物中的EcoRⅠ識別序列3′端添加1個堿基引物的處理由于引物延伸從3'端開始，3'端不能進(jìn)行任何修飾，引物5'端對擴(kuò)增特異性影響不大，因此，可給予修飾而不影響擴(kuò)增特異性。引物5'端修飾包括加酶切位點(diǎn)、標(biāo)記生物素、熒光等。為了使經(jīng)PCR擴(kuò)增的目的基因能與運(yùn)載體正常結(jié)合，需要在2種引物的5'端添加不同的限制酶的識別序列。在2種引物的5'端上添加不同的限制酶識別序列，是為了保證目的基因定向插入運(yùn)載體并可避免目的基因自身環(huán)化。2.引物的設(shè)計例5（2018年江蘇卷）為生產(chǎn)具有特定性能的α-淀粉酶，研究人員從某種海洋細(xì)菌中克隆了α-淀粉酶基因（1656個堿基對），利用基因工程大量制備α-淀粉酶。為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的____端加上限制性酶切位點(diǎn)，且常在2條引物上設(shè)計加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，主要目的是________________。使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連。5'3.引物的選擇和互補(bǔ)鏈的判斷DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于2個引物之間的DNA序列，引物5'端的堿基與DNA母鏈3'端的堿基進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對，可作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，DNA子鏈的合成方向是從引物的5'端向3'端延伸?？衫眠@一特點(diǎn)判斷引物及引物的互補(bǔ)鏈。例8（2016年江蘇卷）為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素，平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖7中的

。引物甲和引物丙例9.下圖是為了擴(kuò)增某目的基因所用引物的分布示意圖（圖8），已知引物組合1和2、3和4可擴(kuò)增相關(guān)的目的基因，則引物1、3與______（填α鏈或β鏈）形成堿基互補(bǔ)配對關(guān)系。β鏈

4.引物的數(shù)量計算(二論復(fù)習(xí)資料P124)(1)如圖：一個DNA分子n次擴(kuò)增，則：①子代DNA分子中等長鏈的DNA分子數(shù)為________個；②子代DNA分子中不等長鏈的DNA分子數(shù)為_____個；③子代DNA分子中含模板鏈DNA分子數(shù)為_____個；④子代DNA分子中含引物A(或B)的DNA分子數(shù)為________個；⑤復(fù)制過程中共需引物________個；⑥第n次復(fù)制需要引物______個。2n－2n2n22n－12n＋1－22n(2)已知引物1及引物2之間的序列為目的序列，若引物與DNA的結(jié)合位點(diǎn)如圖所示，在第_____輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條單鏈等長的目的片段。24.引物的數(shù)量計算(2)引物用PCR技術(shù)將DNA分子中的A1片段進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)計了引物Ⅰ、Ⅱ，其連接部位如圖所示，X為某限制酶識別序列。擴(kuò)增后得到的絕大部分DNA片段是圖中的在第一次PCR循環(huán)結(jié)束后，得到以引物Ⅱ延長得到的單鏈。在以后的PCR循環(huán)中，以引物Ⅱ所形成的單鏈為模板在引物Ⅰ的作用下合成DNA時，引物Ⅱ上的X片段也被作為模板合成子鏈。因?yàn)閮蓷l引物間的片段以指數(shù)倍數(shù)擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)結(jié)束得到的絕大部分DNA片段是選項中的D?！?.引物與PCR反應(yīng)時復(fù)性溫度和時間的關(guān)系PCR的每次循環(huán)可分為3步：變性（90~95℃）復(fù)性（55~60℃）延伸（70~75℃）變性的溫度與目的基因中G+C含量有關(guān)；變性時間的長短與目的基因的長短有關(guān)，目的基因越長，變性的時間就越長。復(fù)性是讓2種引物通過堿基互補(bǔ)配對與2條單鏈DNA結(jié)合，復(fù)性的溫度與引物中G+C含量有關(guān)，G-C堿基對間有3個氫鍵，A-T堿基對間只有2個氫鍵，引物中G+C含量較高，復(fù)性時溫度就較高;復(fù)性時間的長短與引物的長短有關(guān)，引物越長，復(fù)性的時間就越長。延伸的溫度不能太高，以防止新合成的子鏈DNA與母鏈DNA解聚為單鏈，延伸的溫度也不能太低，是為了保證Taq酶的活性;延伸所需要的時間長短與目的基因的長短有關(guān)，目的基因越長，延伸所需要的時間就越長。(2)(經(jīng)典高考題節(jié)選)設(shè)計引物時需要避免引物之間發(fā)生_____________，而造成引物自連。同理也要避免引物之間的互補(bǔ)。復(fù)性溫度的設(shè)定與引物長度、堿基組成有關(guān)，長度相同且____________的引物需要設(shè)定更高的復(fù)性溫度。P124堿基互補(bǔ)配對G、C含量高5.引物與PCR反應(yīng)時復(fù)性溫度和時間的關(guān)系(3)科學(xué)設(shè)計引物是PCR能否成功的關(guān)鍵，若引物的堿基過多或引物的G、C含量過高，會造成PCR的效率偏低，收獲的目的基因較少，原因是_______________________________________________________________。若對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有兩個或多個條帶，從引物角度分析，原因可能是_____________________________。P124引物與模板鏈結(jié)合過于緊密，變性時引物不易與模板鏈脫離(影響變性)引物過短導(dǎo)致引物的特異性下降5.引物與PCR反應(yīng)時復(fù)性溫度和時間的關(guān)系拓展

引物與復(fù)性溫度P124(1)復(fù)性溫度：復(fù)性溫度高，擴(kuò)增特異性強(qiáng)；復(fù)性溫度低，擴(kuò)增效率高。(2)引物：①引物長度越長，越容易形成氫鍵，為避免出現(xiàn)錯配，需要適當(dāng)提高復(fù)性溫度；②引物GC含量越高，容易出現(xiàn)非特異性結(jié)合，需要適當(dāng)提高復(fù)性溫度。5.引物與PCR反應(yīng)時復(fù)性溫度和時間的關(guān)系例10（2008年江蘇卷）將動物致病菌的抗原基因?qū)腭R鈴薯制成植物疫苗，飼喂轉(zhuǎn)基因馬鈴薯可使動物獲得免疫力。以下是與植物疫苗制備過程相關(guān)的圖和表。PCR過程中退火（復(fù)性）溫度必須根據(jù)引物的堿基數(shù)量和種類設(shè)定。表1為根據(jù)模板設(shè)計的2對引物序列，圖9為引物對與模板結(jié)合示意圖。請判斷哪一對引物可采用較高的退火溫度？例11，請回答PCR擴(kuò)增時與退火溫度、延伸溫度與延伸時間有關(guān)的問題∶（1）（2018年江蘇卷）進(jìn)行PCR擴(kuò)增時