慢病毒載體構建、病毒包裝實驗操作手冊

慢病毒載體構建、病毒包裝實驗操作手冊

一、簡介

慢病毒(Lentivirus)載體是以人類免疫缺陷型病毒(HIV)為基礎發(fā)展起來的基因治

療載體,它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，并可以在體內較長期的表達且安全

性高。我們提供的慢病毒為復制缺陷型病毒，即病毒感染目的細胞后不會再感染其他細胞，

也不會利用宿主細胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。慢病毒中的毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的

基因所取代,屬于假型病毒。但該病毒仍然具有可能的潛在的生物學危險，我們建議不要

使用編碼已知或可能會致鹿的基因的假型病毒，除非已經(jīng)完全公認某個基因肯定沒有致癌

性，否則均不建議采用彳鯉病毒進行生物學實驗。

復百澳公司所用的慢病毒載體是在Clonetech公司的慢病毒包裝系統(tǒng)上改進而來。包

括載體質粒(PFV：PLVX)、輔助質粒psPAX2(pHelper1)和輔助質粒pMD2G(pHelper2)

三種質粒組成。載體質粒PFV載體中含有HIV的基本元件5'LTR和3'LTR以及其他輔

助元件。通常根據(jù)不同的實驗目的針對載體質粒進行改造來進行啟動子活性研究、基因表

達研究?口RNA干擾等研究。pHelper1載體中含有HIV病毒的gag基因，編碼病毒主要的

結構蛋白；pol基因，編碼病毒特異性的酶；rev基因，編碼調節(jié)gag和pol基因表達的調

節(jié)因子。pHelper2載體中含有單純皰疹病毒來源的VSV-G基因,提供病毒包裝所需要的

包膜蛋白。

本手冊為復百澳公司慢病毒載體的構建和病毒包裝的通用操作流程，目的是為了方便大家

交流使用,部分細節(jié)內容未能做到一詳述,敬請諒解.同時希望大家能夠針

對手冊中的錯誤和問題，提出寶貴的意見。

服務及實驗流程

1.病毒包裝服務流程圖

客戶提供公司服務

呼酒潘.德

2.病毒包裝實驗操作流程圖

三質粒共轉病毒上清液超速

293T細胞離心濃縮純化

24H第一次收毒換液慢病毒質檢

48H第二次收毒

三、實驗材料

1.細胞株：293T細胞，用于病毒包裝。

2.大腸桿菌菌株：TOP10,用于擴增慢病毒載體和輔助包裝載體質粒。

3.病毒載體質粒：載體質粒、pHelper1質粒和pHelper2質粒

4.試劑：

試劑名稱試劑來源-

胎牛血清胎牛血清Sh30084.03

DMEM（高糖）HycloneSh30022.01B

胰酶HycloneSH30042.01

Lipofectamine2000Invitrogen11668-500

限制性內切酶NEB

NEBLife15224-041

5.儀器

儀器名稱儀器來源cat.No.

熒光顯微鏡LeicaDMILLED

C02培養(yǎng)箱力康生物醫(yī)療科技控股有限公司HF90

生物安全柜力康生物醫(yī)療科技控股有限公司HFsafe-1200TE

超速離心機beckmanoptimal-90K

微量高速離心機ThermoPICO17

四、質粒構建

1.目的基因合成和干擾序列設計

示例1.過表達基因克隆構建：EPO基因（human）的全基因合成。

MCS_ATGGGGGTGCACGMTGTCCTGCCTGGCTGTGGCTTCTCCTGTCCCTGCTGTCGCTCCCT

CTGGGCCTCCCAGTCCTGGGCGCCCCACCACGCCTCATCTGTGACAGCCGAGTCCTGGAGAGGT

ACCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAATATCACGACGGGCTGTGCTGAACACTGCAGCTTGA

ATGAGAATATCACTGTCCCAGACACCAAAGTTAATTTCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTCGG

GCAGCAGGCCGTAGAAGTCTGGCAGGGCCTGGCCCTGCTGTCGGAAGCTGTCCTGCGGGGCCA

GGCCCTGTTGGTCAACTCTTCCCAGCCGTGGGAGCCCCTGCAGCTGCATGTGGATAAAGCCGTC

AGTGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAGGAAGCCATCTCCC

CTCCAGATGCGGCCTCAGCTGCTCCACTCCGAACAATCACTGCTGACACTTTCCGCAAACTCTTC

CGAGTCTACTCCAATTTCCTCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCCTGCAGGACA

GGGGACAGAGGTATGGACTACAAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAG

GACTATAAGGATGATGACGACAAAGCTAGCTAA-MCS-

示例2:基因干擾克隆構建：nucleolin基因干擾腺病毒設計

1）干擾序歹！J設計:shRNA:GGATGAAGATGAAGAGGATGA

2)合成shRNAoligo

ShRNA-1

CCGGGGATGMGATGMGAGGATGACTCGAGTCATCCTCTTCATCTTCATCCTTTTTTG

shRNA-2

AATTCAAAAAAGGATGAAGATGAAGAGGATGACTCGAGTCATCCTCTTCATCTTCATCC

3)退火體系：

名稱體積

Oligo1(100pM)1ul

Oligo2(100pM)1ul

10XT4LigationBuffer(NEB)2ul

ddH2015ul

T4PNK(NEBM0201S)1ul

total20ul

37℃30分鐘，95℃5分鐘，然后按照5℃/分鐘的速度降至25℃。

2.教體前切：

名稱體積

ddH2OXpL

10Xbuffer1ML

純化的DNA質粒載體1Mg

NEB內切酶I0.5|JL

NEB內切的II0.5|jL

Total20ul

3.載體和目的片段鏈接

按摩爾比配制連接體系:目的片段：載體=3:1

名稱體積

酶切回收質粒Xul

稀釋后退火引物（或合成Yul

的目的基因）

5XT4DNALigaseBuffer2ul

T4D\ALigase(5U/ML)1ul

total10ul

4.質粒轉化

1）50ulDH5a感受態(tài)放冰上融化，取2ul連接產(chǎn)物和感受態(tài)細胞混勻；

2）冰浴30min,42°C水浴熱擊90sec,冰浴2min;

3）轉化產(chǎn)物轉移到含500ul無抗性LB液體培養(yǎng)基的EP管中，置于搖床中，37℃,250

轉/分，培養(yǎng)30分鐘；

4）將含有轉化菌的EP管,16000G離心Imin;

5）在超凈臺中倒去上清，將沉淀均勻涂于LB培養(yǎng)平板（Amp+）;

6）將平板倒扣置于37℃細菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜（12~16H）。

2.單克隆培養(yǎng)與鑒定

1）從上述平板中擬微單克隆菌落于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃,250

轉/分，培養(yǎng)過夜（12~16H）;

2）質粒提?。ò凑仗旄|粒提取試劑盒說明書提?。?/p>

3）質粒測序鑒定，將測J序結果與設計序列進行比對鑒定。鑒定結果正確的質粒,進行后

續(xù)病毒包裝實驗。

五、病毒生產(chǎn)部分

（-）病毒包裝

1.24h,用胰蛋白酶消化又擻生長期的293T細胞,重新接種于10cm細胞培養(yǎng)皿，

37℃、5%CO2培箱g內培養(yǎng)，待細胞密度達70%~80%時即可用于轉染；

2.轉染前2h將更換細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)基；

3.向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液（載體質粒10pg,pHelper1.0載體5p

g,pHelper2.0載體5pg）,與相應體積的Opti-MEM混合均勻,調整總體積為0.5

ml,在室溫下溫育5分鐘。

4.取50ulLlpofectamlne2000試劑與450ulOptl-MEM混合,在室溫下溫育5分鐘c

5.把稀釋后的DNA與稀釋后的轉染試劑混合，輕輕地顛倒混勻，不要振蕩。

6.混合后，在室溫下溫育10分鐘。

7.將上述轉染混合物滴加到293T細胞培養(yǎng)液中，搖勻，于37°C,5%C02

8.細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

9.培養(yǎng)6-8h后倒去含有轉染混和物的培養(yǎng)基,每盤細胞更換10ml的10%FBS完全

培養(yǎng)基,37°C、5%C02培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)。

10.轉染后24H,用顯微潦觀察含標簽熒光（GFP/RFP）細胞的數(shù)量判定轉染效率。

11.確定轉染成功后（熒光細胞比例70%），進行第一次收毒操作。收集細胞培養(yǎng)基于一

個無菌50ml離心管中，4。（：保存。更換新鮮的10%FBS培養(yǎng)基10ml,繼續(xù)培養(yǎng)24HO

12.轉染后48H,進行二次收毒操作。收獲含病毒培養(yǎng)基于無菌50ml離心管，4。（：保存。

（二）病毒濃縮純化

1.將收獲的含病毒顆粒的培養(yǎng)基，經(jīng)過0.22um濾膜過濾并收集于無菌超速離心管中，

配平、密封；

2.超速離心80,000g,離心4H;

3.棄去離心后上清，用Virusstorebuffer（復百澳?）重懸沉淀；

4.收集重懸液,再次經(jīng)過0.22um濾膜過濾除菌，分裝于無菌病毒管中；

5.每個病毒管上貼好相應的標簽，轉于-80℃冰箱保存，

（=）滴度檢測

1.實驗前24H,接種HEK293T細胞于96孔板中,約1*103個/孔，503/孔,于37℃,

5%C02條件下培養(yǎng)；

2.實驗前在顯微鏡下，對實驗用細胞進行觀察，確定細胞飽滿、分部均勻、無污染后再

進行后續(xù)實驗。

3.病毒梯度稀釋：

1）準備1個新的96孑飯，由