維血寧顆粒論文

沈陽(yáng)藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要~611μgmL1(r=0.9997),6.38～63.8μgmL1(r=0.0.9996)范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為99.6(r=0.9997),12.9~1.29μgmL1(r=0.9996),0.422~4.220.9998),6.60～66.0μgmL1(r=0.9997)范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為101.4%(RSD=1.6%)、98.0%(RSD=1.1%);建立了大黃素和大黃素甲醚μg·mL1(r=0.9997)范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為98.2%(r=0.9997)范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率×4.6mm,5μm)色譜柱，以乙腈-水(20:80,v/v)為流動(dòng)相，柱溫為35℃,流速為≥0.9960),日內(nèi)、日間精密度RSD值均小于7.7%,提取回收率為72.3~77.9%,內(nèi)標(biāo)物=(0.403±0.063)h,Cmax=(1.715±0.097)g,t12p=(2.484±1.624)h?1,AUCo→t沈陽(yáng)藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文2±0.550)mg·L?1·h,AUCo=(1.955±0.765)mg·L?1·h。結(jié)果顯示，虎杖苷在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程符合二室模型，所建立的方法符合生物樣品分析要求。關(guān)鍵詞：維血寧顆粒；指標(biāo)成分；質(zhì)量控制；藥物動(dòng)力學(xué)；高效液相色譜法3Hong-minZhu(pharmaceuticalaWeixueninggranules,includedinMinisterialStandardofthePeople'sRepublicofChinawascomposedofeightChineseherbs:RhizomaetRadixPolygoniCuspidat,RadixPaeoniaeAlba,HerbaAgrimoniae,RadixRehmanniae,CaulisSpatholobi,RadixRehmanniaePraeparata,HerbaEcliptae,RadixPseudostellariae.Itiswidelyusedctothetreatmentofthrombocytopeniaandbleedingoriginatedbyheatinblood.Inthispaper,RP-HPLCwasemployedinqualitycontrolofindexcomponentsinWeixueninggraanHPLC-UVmethodwasdevelopedforstudyiRP-HPLCmethodwasestablishedtosimulpolydatin,verbascosideandresveratrol.Thecalibrationcurveswerelinearwithintherangeof22.3-223μgmL1(r=0.9999),61.1-611μgmL1(r=0.9997),6.38-63.8μg·mL1(r=0.9996),4.88-48.8μg:mL1(r=0.9996)respectively,andtherecoveriseweAnotherRP-HPLCmethodwasestablishedtosimultaneouslydeterminethecontentofqercetin,lteolin,gnisteinandformononetin.Thecalibrationcurveswerelinearwrangeof2.65-26.5μg·mL1(r=0.9997),12.9-1.29μgmL1(r=0.9996),0.422-4.22μg:mL1(r=0.9995),1.21-12.1μg:mL1(r=0.9996)respectively,andtherecoverisewererespectively.ThethirdRPcontentofcatechinandepicatechin.Thecalibrationcurves3.33-33.3μg·mL1(r=0.9998),6.60-66.0μg·mL1(r=0.9997)respectively,andtrecoveriseweRP-HPLCmethodwereestaphyscione.Thecalibrationcurveswerelinearwithintherangeof5.30-53.0μg·mL1(r=0.9998),0.988-9.88μgmL-1(r=0.9997)respectively,andthe沈陽(yáng)藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文4todeterminethecontentofcatalpol.Thecalibrationcurvewaslinearwithintherangeof7.60-76.0μg:mL1(r=0.9997),andtherecoveriThemethodofdeterminethecontentofpolydatininratplasmawasdevelopedbyusingHPLC-UV,andwasusedtostudythepharmacokineticsofpolydatininratsafteri.g.C18(200mm×4.6mm,5μm)columnwiththemobilephaseconsdetectionwavelengthwassetat303nm.LinearcRSDwerebothlessthan7.7%.TheextractionThemainpharmacokineticparametersshowthis:Tmaxwas(0.403±0.063)h,Cmaxwas(1.715±0.097)g,ti?pwas(2.484±1.624)h1,AUCo→twas(1.511±0.550)mg·L-1·h,AUCo→0was(1.955±0.765)mg·L-1·h.ThepharmacokineticsofPolydatinwasconsistentwithKeywords:Weixueninggranules,indexcomponents,qualitycontrol,pharmacokinetics,5中藥的應(yīng)用以中醫(yī)藥學(xué)理論為基礎(chǔ)，有著獨(dú)特的理論體系和應(yīng)用形式，充分反映了我國(guó)自然資源、歷史及文化等方面的特點(diǎn)。習(xí)慣上，凡是以中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥理論指導(dǎo)采收、加工、炮制、制劑、說(shuō)明作用機(jī)制、指導(dǎo)臨床應(yīng)用的藥物統(tǒng)稱為中藥。簡(jiǎn)而言之，中藥就是指在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，用以預(yù)防、治療疾病及康復(fù)保健等方面的物質(zhì)，包括中藥材、中藥飲片和中藥成方制劑。中藥復(fù)方是適應(yīng)現(xiàn)代藥物學(xué)對(duì)多成分藥物的認(rèn)識(shí)范疇，是對(duì)多組分化學(xué)特征的中醫(yī)方劑通稱，也是中醫(yī)治法、治則在組方用藥上的具體運(yùn)用，顯示了傳統(tǒng)醫(yī)藥防病治病的特色，是中醫(yī)藥的精髓所在，其君臣佐使等配伍的獨(dú)特規(guī)律及效用的優(yōu)越性已為數(shù)千年臨床實(shí)踐所證明。用現(xiàn)代科學(xué)方法研究中藥，發(fā)展中藥，毫無(wú)疑問(wèn)必須著眼于中藥復(fù)方的研究。雖然中藥獨(dú)到的防病治病效果得到世界醫(yī)學(xué)界的認(rèn)同，但是由于中藥復(fù)方化學(xué)成分的復(fù)雜性，使得在揭示其配伍的科學(xué)內(nèi)涵及作用機(jī)制上存在很多困難1,2]。長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)的中藥基礎(chǔ)性研究薄弱，再加上中藥的生產(chǎn)過(guò)程中存在著工藝粗放，設(shè)備落后，自動(dòng)化水平低，質(zhì)量控制方法落后、標(biāo)準(zhǔn)低等問(wèn)題，導(dǎo)致中成藥外形粗糙，服用劑量大，質(zhì)量不穩(wěn)定，可控性差13,這些都制約了現(xiàn)代中藥的發(fā)展。在繼承和發(fā)揚(yáng)中醫(yī)藥優(yōu)勢(shì)和特色的基礎(chǔ)上，充分利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的方法和手段，研究開發(fā)能夠正式進(jìn)入國(guó)際醫(yī)藥市場(chǎng)的中藥產(chǎn)品，初步建立我國(guó)中藥研究開發(fā)和生產(chǎn)的規(guī)范體系，并爭(zhēng)取使之成為國(guó)際傳統(tǒng)藥物研究開發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化和國(guó)際化，已成為人們的共識(shí)4。如何將傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論及經(jīng)驗(yàn)與現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)理論相結(jié)合，如何應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)研究、挖掘中醫(yī)藥學(xué)的科學(xué)內(nèi)涵，是當(dāng)前非常緊迫的課題5]。為了不斷完善和豐富祖國(guó)中醫(yī)藥，保證中藥的安全性和有效性，更好地為人類的健康服務(wù)，我們有必要在中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面進(jìn)行深入的研究。目前對(duì)中藥的作用機(jī)制以及中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)還沒有完全弄清[61,對(duì)中藥復(fù)方質(zhì)量控制也進(jìn)行了多方向的研究：指紋圖譜技術(shù)研究，是對(duì)中藥物質(zhì)基礎(chǔ)整體特征的一種量化表達(dá)和解析手段，是中藥走向世界的關(guān)鍵技術(shù)之一[7;定量組效關(guān)系研究，在中藥化學(xué)組分的多變量空間和中藥藥6高低來(lái)控制藥物質(zhì)量的模式，是現(xiàn)階段對(duì)中藥及其復(fù)方的質(zhì)量控制方法研究的熱點(diǎn)之主要包括整體觀念和系統(tǒng)生物學(xué)的思考方法。整體觀念是中醫(yī)臨床的兩大經(jīng)驗(yàn)總結(jié)之單味中藥即可視為一個(gè)小復(fù)方，若干味中藥組成的復(fù)方就能視為一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，成分眾多，不同種類的成分可能對(duì)應(yīng)不同的藥理效應(yīng)，且成分之間存在復(fù)雜的交互作用，究竟哪一個(gè)或哪一類成分能代表中藥復(fù)方的整體作用，目前被采納的標(biāo)準(zhǔn)有：A、藥效7相關(guān)成分及其代謝產(chǎn)物可視為可行的監(jiān)測(cè)指標(biāo)；B、所選擇的指標(biāo)盡量與藥效密切相關(guān)；C、要能體現(xiàn)中藥復(fù)方組分在數(shù)量及其之間相互比例的動(dòng)態(tài)變化[15]。如何選擇復(fù)方中某一合適的成分作為藥動(dòng)學(xué)研究目標(biāo)，目前仍存在很多爭(zhēng)議和問(wèn)題，有待進(jìn)一步深入系統(tǒng)的研究加以解決。由于中藥復(fù)方由多味藥組成，每味藥又含有多種有效成分，其成分復(fù)雜，干擾因素多，因此，藥動(dòng)學(xué)研究比起西藥有較大的難度。采用何種方法來(lái)研究中藥復(fù)方藥代動(dòng)力學(xué)，才能更準(zhǔn)確、更完整、更科學(xué)地揭示中藥復(fù)方的藥動(dòng)學(xué)特征，仍在不斷探索中。目前主要用于中藥復(fù)方藥代動(dòng)力學(xué)研究的方法有兩大類：生物效應(yīng)法和體內(nèi)藥物濃度法。生物效應(yīng)法是指以藥效為指標(biāo)進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究的理論方法。此研究認(rèn)為體內(nèi)藥量與藥物的效應(yīng)有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，從藥效的變化可推知不同時(shí)間體內(nèi)藥量的變化。從中藥的生物效應(yīng)看，有效成分和毒性成分是中藥復(fù)方成分的主要部分，可針對(duì)性地分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，推算其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。在方法學(xué)上采用了效一量轉(zhuǎn)換的方法，把藥效學(xué)的時(shí)一效數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成藥動(dòng)學(xué)所需的時(shí)一量數(shù)據(jù)，從而得以推算有關(guān)藥動(dòng)參數(shù)。常用的生物效應(yīng)體內(nèi)藥物濃度法是藥動(dòng)學(xué)研究的經(jīng)典方法，其原理是利用藥物在血、尿或其它體液、組織中的濃度與其藥理效應(yīng)大體呈平行關(guān)系，測(cè)定給藥后體內(nèi)的血(尿)藥濃度，建立藥動(dòng)學(xué)模型，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，了解藥物在體內(nèi)的變化規(guī)律。體內(nèi)藥物濃度法一般是以中藥復(fù)方中一種或幾種藥理作用明確，結(jié)構(gòu)已知的有效成分作為觀測(cè)指標(biāo)，通過(guò)化學(xué)分析方法檢測(cè)動(dòng)物給藥后，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清、尿液或其他組織液中指標(biāo)成分的濃度，應(yīng)用藥動(dòng)學(xué)計(jì)算公式對(duì)測(cè)得的藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。常用的生物樣品濃度測(cè)定方法有：分光光度法、化學(xué)發(fā)光法、薄層色譜法、液相色譜法、高效毛細(xì)管電泳、酶免疫測(cè)定法、同位素標(biāo)記法等。其中最常用的是高效液相色譜法(HPLC法),1.3維血寧顆粒處方方解與各藥味研究概況維血寧顆粒收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第五冊(cè)中，以虎杖、白芍(炒)、仙鶴草、地黃、雞血藤、熟地黃、墨旱蓮、太子參8味中藥材水提醇沉精制而成。諸藥合用，有滋補(bǔ)肝腎，補(bǔ)血活血，清熱涼血之效。用于氣血不足引起的8維血寧顆粒方中雞血藤既補(bǔ)血又活血，為君藥；熟地黃、生地黃、白芍滋陰補(bǔ)血，兼清血熱，虎杖清熱涼血，化瘀散滯，以上藥扶正氣益陰血，涼血熱，能止出血，共為臣藥；仙鶴草收斂止血，墨旱蓮涼血止血，太子參益氣生血，三者共為佐使藥。本方諸藥協(xié)同，有補(bǔ)血活血，清熱涼血，滋補(bǔ)肝腎，涼血清熱之效。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)該制劑的性狀及顆粒劑通則進(jìn)行檢驗(yàn)，而含量測(cè)定項(xiàng)則有文獻(xiàn)報(bào)道的大黃素，芍藥苷及白藜蘆醇的單項(xiàng)含量測(cè)定[23-27],有待進(jìn)一步完善。雞血藤本品為豆科植物密花豆SpathoiobussuberectusDunn.的干燥藤莖，此藥味苦，甘，性溫，入心、脾二經(jīng)?！毒V目拾遺》載：活血，暖腰膝，已風(fēng)癱?！侗静菰傩隆分^：補(bǔ)中燥胃?！讹嬈聟ⅰ吩唬喝ヰ鲅卵骼?jīng)脈。治暑痧，風(fēng)血痹癥。2005版藥典載雞血藤有補(bǔ)血，活血，通絡(luò)之效，用于月經(jīng)不調(diào)，血虛萎黃，麻木癱瘓，風(fēng)濕痹痛。本藥成分復(fù)雜，主要含有：黃酮類化學(xué)成分：大豆黃素(daidzein),毛蕊異黃酮(calycosin),8-甲雷杜辛(8-0-methylreyusi),染料木素(genistein),芒柄花素(formononetin),(pseudobaptigenin),阿弗洛莫生(afromosin),呋喃黃酮(lanceolatin),5-甲氧基呋喃黃酮(pinnatin),等；兒茶素類成分：(+)-兒茶素[(+)-catechin],(-)-表兒茶素[(-)等；擬雌內(nèi)酯類化合物：苜蓿內(nèi)酯(medinlagol),白芷內(nèi)酯(angelicin)等；木脂素類：南五味子素(kadsurin),南五味子寧(kadsuranin),南五味子酯(kadsutherin)等；萜類化合物：表木栓醇(epifriedelanol),木栓酮(friedelin),羽扇豆酮(lupeone),等；甾醇類化合物：胡蘿卜苷(daucosterol),蕓苔甾醇(campesterol)等；此外，還含有醇和酚類化合物和多種微量雞血藤?gòu)V泛應(yīng)用于血液及心血管系統(tǒng)疾病，如貧血、風(fēng)濕性心臟病、白細(xì)胞和血小板減少等，具有補(bǔ)血作用，能使血細(xì)胞增加，血紅蛋白增高等，多成分特別是兒茶素類成分有刺激骨髓祖細(xì)胞增殖活性的作用，同時(shí)還具有抗血栓形成作用133~34]。除此外，雞血藤也應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如血管痙攣性頭痛、頑固性失眠等；以及外科、婦科疾病[35]。另外，雞血藤提取物具有抗輻射作用，還可通過(guò)清除體內(nèi)自由基，起到抗氧化作用白芍本品為毛莨科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根，味苦，酸，性微寒，歸肝、脾經(jīng)?！侗窘?jīng)》載：味苦，平。《別錄》謂：酸，平微寒，有小毒?！侗静萁?jīng)疏》曰：手足太陰引經(jīng)藥，入肝、脾血分。2005版藥典載白芍有平肝止痛，養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰9止汗之效，用于頭痛眩暈，脅痛，腹痛，四肢攣痛，血虛萎黃，月經(jīng)不調(diào)，自汗，盜汗。白芍含有單萜及其苷類化合物：芍藥苷(paeoniflorin),羥基芍藥苷苯甲酰芍藥苷(benzoylpaeoniflorin),苯甲酰羥基芍藥苷(benzoyloxypaeoniflorin),白芍苷(albiflorin),芍藥苷元酮(paeoniflorifenone),β-10-落烯基-β-巢菜苷[(Z)-(1S,5R)-β-pinen-10-yl-β-vicianoside],芍藥新苷(lactiflorin),palbinone,6-0-β-glucopuranosyl等；3β-hydroxy-11a,12α-epoxy-olean-28-13β-olide,betulinicacid,23-hydroxy-betulinicacid白芍總苷具有多途徑自身免疫調(diào)節(jié)作用，雙向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，可減輕自身免疫性炎癥，如風(fēng)濕免疫性疾病的治療，并有鎮(zhèn)痛、免疫抑制、和抗炎作用[40,41]。同時(shí)，白芍還能抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[42]。此外，白芍還有肝臟保護(hù)作黃味甘、苦；生地黃味甘，性寒，均歸心、肝、腎經(jīng)?！侗窘?jīng)》載：味甘，寒；《湯液本草》載：入手太陽(yáng)、少陰經(jīng)；《雷公炮制藥性解》記：入心、肝、脾、肺四經(jīng)。2005版藥典載鮮地黃清熱生津，涼血，止血；用于熱風(fēng)傷陰、舌絳煩渴、發(fā)斑發(fā)疹、吐血、衄血、咽喉腫痛；生地黃清熱涼血，養(yǎng)陰，生津；用于熱病舌絳煩渴、陰虛內(nèi)熱、骨蒸勞熱、內(nèi)熱消渴、吐血、衄血、發(fā)斑發(fā)疹。地黃的主要成分為苷類、糖類及氨基酸，并以苷類為主，在苷類中又以環(huán)烯醚萜苷為主，如梓醇(catalpol),地黃苷A、B、C、D(rehmanniosideA,B,C,D),桃葉珊瑚苷(aucubin),麥角甾苷(verbascoside),京尼平苷(geniposide),益母草苷(leonuride),美利妥雙苷(melittoside),地黃素A,D(rehmanninA,D),地黃氯化臭蟻醛苷(glutinoside)等；還含焦地黃素A,B,C(jioglutinA,B,C),焦地黃內(nèi)酯(jioglutolide),地黃苦苷元(rehmapicrogenin)等單萜類成分；另含有野孤酸(aegineticacid),5-羥基野孤酸(sec-hydroxyaegineticacid),5-羥甲基糠酸(5-hydroxymethylfuroicacid),尿核苷(uridine)等氨基酸和生物堿類物質(zhì)，和大量多、單糖。另含有β-谷甾醇(β-sitesterol)及菜油甾醇(campesterol),及少量豆甾醇(stigmasterol)、菜油甾醇(campesterol)等其他化合物地黃的藥理作用主要表現(xiàn)在血液系統(tǒng)，具有止血和促進(jìn)白細(xì)胞增殖的藥理活性，增強(qiáng)造血祖細(xì)胞的增殖，同時(shí)可以通過(guò)影響白血球和血小板來(lái)抗炎；地黃可通過(guò)抑制Ca2+,Mg2+-ATP酶活力，保護(hù)新腦組織避免ATP耗竭和缺血損傷，并對(duì)高血壓具有雙向調(diào)節(jié)作用。其次則是對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能，顯著提高機(jī)體的免疫能力[48-50]。地黃在中醫(yī)藥中一直用來(lái)治療糖尿病，具有顯著的降糖作用。另外，地黃還具有保護(hù)胃黏膜，補(bǔ)腎，抗衰老，抗癌，益智等多種藥理作用51]。熟地黃本品為生地黃的酒燉法或蒸法炮制加工品，味甘，性微溫，歸肝、腎經(jīng)?！侗静菪戮帯份d：味甘，性溫?！侗静輳男隆吩唬喝胱闳幗?jīng)?！毒V目》載：甘微苦，微溫。2005版藥典載熟地黃有滋陰補(bǔ)血，益精填髓之效。用于肝腎陰虛，腰膝酸軟，骨蒸潮熱，盜汗遺精，內(nèi)熱消渴，血虛萎黃，心悸怔忡，月經(jīng)不調(diào)，崩漏下血，眩暈，耳鳴，須發(fā)早白。量有所下降，而單糖含量明顯增大，梓醇發(fā)生大幅度降解，若以鮮地梓醇含量為100%計(jì)算，則生地含量為60%,熟地僅余20%I?2]。氨基酸含量普遍下降。炮制過(guò)程中環(huán)烯醚熟地黃的藥理作用與地黃類似，但有細(xì)微差別。其藥性在炮制過(guò)程中由寒轉(zhuǎn)為微溫。同樣具有抗衰老、益智作用，能增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能和紅細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，增強(qiáng)大鼠紅細(xì)胞變形性5SS]。其多糖可拮抗血虛模型小鼠胸腺及脾臟的萎縮，促進(jìn)機(jī)體的造血功能[56]。另有研究顯示，熟地黃的抑酸作用強(qiáng)于地黃[57]?；⒄缺酒窞檗た浦参锘⒄萈olugonumcuspidatumSieb.etZucc.的干燥根莖及根，味微苦，性微寒，歸肝、膽、肺經(jīng)?！端幮哉摗吩唬何陡?，平，無(wú)毒?！兜崮媳静荨份d：苦微澀，微寒?！夺t(yī)林纂要》載：甘苦辛，溫，入肝、膽、肺三經(jīng)。2005版藥典載虎杖有祛風(fēng)利濕，散瘀定痛，止咳化痰之效。用于關(guān)節(jié)痹痛，濕熱黃疸，經(jīng)閉，廠瘕，水火燙傷，跌撲損傷，癰腫瘡毒，咳嗽痰多。虎杖中主要含有的化學(xué)成分分為以下幾個(gè)類型：蒽醌及蒽醌苷類化合物：大黃素(emodin),大黃素-6-甲醚(physcion),大黃酚(chrysophanol),蒽苷A,B(anthraglycosideA,B);芪類化合物：白藜蘆醇(resveratrol),虎杖苷(polydain);酚性成分；迷人醇(pallacinol),6-羥基蘆薈大黃素(citreorosein),大黃素-8-單甲醚(questin),6-羥基蘆薈大黃素-8-單甲醚(questinol),2,5-二甲基-7-羥基色原酮(2,5-dimethyl-7-hydroxychromone),7-羥基-4-甲氧基-5-甲基香豆精(7-hydroxy-4-methoxy-5-methylcoumarin);其他：研究表明虎杖中含有一種分子量約6000的多糖，其中含38個(gè)單糖，由D-葡萄糖，D-半乳糖，D-甘露糖，L-鼠李糖，L-阿拉伯糖構(gòu)成，一種萘醌，即2-甲氧基-6-乙?；?7-甲基胡桃醌(2-methoxy-6-acetyl-7-methyljuglone),游離氨基酸，Cu,Fe,等微量元素及鞣質(zhì)58-60]?；⒄鹊乃幚碜饔弥饕憩F(xiàn)在：對(duì)心血管系統(tǒng)的影響，有強(qiáng)心擴(kuò)血管作用，能夠降低血液粘度，抗動(dòng)脈粥樣硬化，抑制血小板聚集及抗血栓形成，同時(shí)能改善微循環(huán)及抗休克，對(duì)組織缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[61-63;對(duì)呼吸系統(tǒng)的影響，具有止咳平喘的作還能抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)過(guò)氧化脂亦有一定的清除能力，同時(shí)對(duì)肝細(xì)胞有保護(hù)作用[6,66;另外，虎杖還有抗菌抗病毒、抗癌抗氧化，止血消炎作用，特別是在民族藥中也有廣泛墨旱蓮本品為菊科植物鱧腸EcliptaprostrataL.的干燥地上部分，味甘、酸，性寒，歸心、肝、腎經(jīng)?！短票静荨份d：主血痢。針灸瘡發(fā)，洪血不可止者敷之；汁涂發(fā)眉，生速而繁；《日華子本草》記：排膿，止血，通小腸，敷一切益腎陰。2005版藥典載墨旱蓮有滋補(bǔ)肝腎，涼血止血之效，用于牙齒松動(dòng)，須發(fā)早白，眩暈耳鳴，腰膝酸軟，陰虛血熱，吐血，衄血，尿血，血痢，崩漏下血，外傷出血。目前，已分離出的墨旱蓮含有的化學(xué)成分包括：黃酮類化合物：芹菜素(apogenin),木犀草素(luteolin),槲皮素(quercetin),apigenin-7-0-glucoside,luteolin-7-O-gluc旱蓮苷A,三萜皂苷類化合物：eclalbasaponinsI,Ⅱ,Ⅲ,XI和XI,旱蓮苷A,B,C和D,刺囊酸(echinocysticacid)等；香豆草醚類化合物：嘭菊內(nèi)酯(wedeblactone),去甲彭菊內(nèi)酯(isodemethywedeblactone),及其糖豆甾醇-3-氧葡萄糖苷(stigmaste抗炎作用，其抗炎機(jī)理與其降低毛細(xì)血管通透性，抑制PGE的合成或釋放，直接對(duì)抗炎介質(zhì)的作用及抑制白細(xì)胞的游走有關(guān)[73];其水提液和醇提液均有明顯的激活絡(luò)氨酸酶活性的作用[74];具有毛細(xì)血管收縮作用，能縮短出血與凝血時(shí)間，應(yīng)用于尿血、便血、仙鶴草本品為薔薇科植物龍芽草AgrimoniapilosaLedeb.的干燥地上部分，味苦，澀，性平，歸心，肝經(jīng)?！堵膸f巖本草》謂其：味辛澀，溫，無(wú)微溫，味苦澀。《生草藥性備要》錄：味甜，性平。2005版藥典載仙鶴草有收斂止血，截虐，止痢之效，用于咳血，吐血，崩漏下血，瘧疾，血痢，脫力勞傷，癰腫瘡毒，陰癢帶下。仙鶴草中主要含有如下化學(xué)成分：酚類化合物：鶴草酚(agrimophol),偽綿馬素(pseudoaspidin),仙鶴草酚A,B,C,D,E(agrimolA,B,C,D,E),(R)-(-)-仙鶴草酚B[(R)-(-)-(1β,2a,3β,19a-tetrahydroxy-12-eN-28-ursolicacid),1β,2β,3β,19α-四羥基-12-烯-28-熊果酸喃葡萄糖苷[2a,19a-dihydroxy-ursolicacid-(28-1)-B-D-glucopyranoside]等；黃酮類及糖苷等；此外，仙鶴草含有復(fù)雜的揮發(fā)油成分，及豐富的微量元素[76-77]。仙鶴草的藥理作用主要表現(xiàn)在：止血作用，能增加血小板，促進(jìn)血液凝固，抗血栓形成；通過(guò)調(diào)劑NO合成與釋放，起到抗心律失常的作用[78,79;抗菌、抗病毒、消炎止痛作用[80];可促進(jìn)胰島素釋放和產(chǎn)生類似胰島素的降糖作用，特別是醇提物更為明顯81];增強(qiáng)免疫功能作用，對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)，進(jìn)一步能發(fā)揮抗癌的作用；另外，仙鶴草還具有較強(qiáng)的驅(qū)蟲作用[82]。太子參本品為石竹科植物孩兒參Pseudostellatiaheterophylla(Miq.)PaxexPaxetHoffm.的干燥塊根，味甘，微苦，性平，歸脾、肺經(jīng)?！侗静菰傩隆份d：味甘，性溫，無(wú)毒?！吨兴幹尽蜂洠焊士?，微寒。2005版藥典載太子參有益氣健脾，生津潤(rùn)肺之效，用于脾虛體倦，食欲不振，病后虛弱，氣陰不足，自汗口渴，肺燥干咳。太子參的化學(xué)成分包括：皂苷類化合物：太子參皂苷A(pseudostellarinosideA),尖葉絲石竹皂苷D(acutifolisideD),此兩物質(zhì)為廣泛接受的太子參有效活性成分；糖類化等；氨基酸類化合物：包括賴氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸等人體必需氨基酸；油脂類化合物：1-甘油單硬脂酸酯(glecerlo1-monolinolate),吡咯-2-羧酸-3'-呋喃甲醇酯(3'-furfurylpyrrole-2-car-boxylate)等；磷脂類化合物：磷脂酸膽堿、磷脂酸、磷脂酸肌醇等；環(huán)肽類化合物：太子參環(huán)肽A(heterophyllinA),太子參環(huán)肽B(heterophyllinB)等；并含有胡蘿卜苷(daucosterine),太子參的藥理作用主要體現(xiàn)在滋補(bǔ)和調(diào)理方面，具體有：抗疲勞、抗應(yīng)激作用，能改善脾虛癥狀，有增強(qiáng)免疫作用[85-871;具有穩(wěn)定的非酶類清除超氧自由基的SOD樣作用[88;另外，太子參還有鎮(zhèn)咳，抗菌抗病毒，延緩衰老等作用[89]。1.4本論文的主要研究?jī)?nèi)容本文計(jì)劃建立維血寧顆粒中芍藥苷、虎杖苷、麥角甾苷和白藜蘆醇；槲皮素、木犀草素、染料木素和芒柄花素；兒茶素和表兒茶素；大黃素和大黃素甲醚含量同時(shí)測(cè)定，以及梓醇含量單獨(dú)測(cè)定的高效液相色譜方法，為維血寧顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供初步定性定量分析依據(jù)。并計(jì)劃在建立大鼠血漿中虎杖苷的高效液相色譜含量測(cè)定方法的基礎(chǔ)上，初步研究大鼠灌胃給予維血寧顆粒后，虎杖苷的藥物動(dòng)力學(xué)行為。為維血寧顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，作用機(jī)制、藥效學(xué)評(píng)價(jià)等進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。沈陽(yáng)藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第二章維血寧顆粒指標(biāo)成分的含量測(cè)定LC-10ATVP高效液相色譜泵2010色譜工作站HT-230A柱溫箱甲醇(色譜純)乙腈(色譜純)磷酸(分析純)三乙胺(分析純)乙酸乙酯(分析純)沈陽(yáng)市東興試劑廠天津市大茂化學(xué)試劑廠RE-85Z型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀HH-4電熱恒溫水浴鍋上海青浦滬西科學(xué)儀器廠國(guó)華科學(xué)儀器廠芍藥苷(批號(hào)110736-200630)虎杖苷(批號(hào)111575-200502)麥角甾苷(批號(hào)111530-200706)白藜蘆醇(批號(hào)111535-200502)槲皮素(批號(hào)100081-200406)木犀草素(批號(hào)111520-200504)染料木素(批號(hào)111704-200501)芒柄花素(批號(hào)111703-200501)兒茶素(批號(hào)977-20001)表兒茶素(批號(hào)110878-200102)大黃素(批號(hào)110756-200110)大黃素甲醚(批號(hào)110758-200610)梓醇(批號(hào)110808-200305)虎杖藥材白芍藥材地黃藥材雞血藤藥材熟地黃藥材仙鶴草藥材墨旱蓮藥材太子參藥材維血寧顆粒中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所中國(guó)藥品生物制品檢定所沈陽(yáng)成大方圓藥房沈陽(yáng)成大方圓藥房沈陽(yáng)成大方圓藥房沈陽(yáng)成大方圓藥房沈陽(yáng)成大方圓藥房沈陽(yáng)成大方圓藥房沈陽(yáng)成大方圓藥房沈陽(yáng)成大方圓藥房江蘇某藥廠2.2維血寧顆粒中芍藥苷、虎杖苷、麥角甾苷和白藜蘆醇的含量測(cè)定流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度程序見Tab2-1柱溫：35℃進(jìn)樣量：20μL0精密稱定，分置10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度分別為0.93,燒瓶中，加20mL水充分震蕩溶解。加入乙酸乙酯100mL,振搖3min萃取后，超聲2和58.5min,四種成分色譜峰與相鄰峰的分離度均大于1.5,理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算不低于3000,按虎杖苷峰計(jì)算不低于6000,按麥角甾苷峰計(jì)算不低于5000,按白藜蘆醇峰計(jì)算不低于3000,陰性對(duì)照對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果見圖2-1。A沈陽(yáng)藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第二章維血寧顆粒指標(biāo)成分的含量測(cè)定CDEPaeoniaeAlbaD:samplewithoutRhizomaetRadixPolygoniCuspidatiE:samplewithoutRadix1.paeoniflorin2.poly儲(chǔ)備液5.5mL、白藜蘆醇儲(chǔ)備液3.3mL,置同一25mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品混合溶液V(4種成分濃度分別為：芍藥苷223μg:mL1,虎杖苷20μL注入色譜儀，記錄色譜圖。以色譜峰面積Y對(duì)對(duì)照品濃度X(μg·mL1)進(jìn)行線性回虎杖苷、麥角甾苷和白藜蘆醇峰面積的RSD(n=6)分別為0.45%,0.65%,1.2%和0.71%。重復(fù)性試驗(yàn)取批號(hào)為061248的樣品，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法操作，白藜蘆醇含量的RSD(n=6)分別為1.3%,0.79%,1.3%和1.7%。穩(wěn)定性試驗(yàn)取批號(hào)為061248的同一供試品溶液，室溫靜置，分別于0,2,4,8,1.4%,1.2%,0.80%和1.3%。結(jié)果表明供試品溶液室溫放置24h內(nèi)基本穩(wěn)定。回收率試驗(yàn)取已知含量的樣品(批號(hào)061213)約0.5g共9份，精密稱定。平均分為3組。各組分別按樣品中成分含有量與加入成分量比例為1:0.5,1:1,1:1.5,分別精按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析。結(jié)果見表2-2。43.9上述結(jié)果表明，所建立的維血寧顆粒中芍藥苷、虎杖苷、麥角甾苷和白藜蘆醇含量同沈陽(yáng)藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第二章維血寧顆粒指標(biāo)成分的含量測(cè)定時(shí)測(cè)定的分析方法符合有關(guān)規(guī)定要求，可用于維血寧顆粒中此四種成分的含量測(cè)定。2.2.6樣品測(cè)定取3批樣品，每批取3份，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)方法制備供試品溶液。精密吸取各供試品溶液及對(duì)照品混合溶液Ⅲ各20μL,注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰面積，外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量。結(jié)果見表2-3。2.3維血寧顆粒中槲皮素、木犀草素、染料木素和芒柄花素的含量測(cè)定流動(dòng)相：甲醇：乙腈：0.15%磷酸水溶液(35:10:55,vv/v)流速：1.0mL·min?1柱溫：35℃進(jìn)樣量：20μL對(duì)照品溶液的制備分別稱取槲皮素、木犀草素、染料木素和芒柄花素對(duì)照品適量，精密稱定，分置10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度分別為0.51,0.67,0.23,0.35mg·mL1的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。燒瓶中，加入100mL甲醇和30mL鹽酸，90℃水浴回流1h,放冷，過(guò)濾，取續(xù)濾液，加入20gNaHCO?,振搖充分溶解。中和后上清液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，減壓蒸至無(wú)醇味。余液轉(zhuǎn)移至分液漏斗，以100mL,100mL,150mL乙酸乙酯提取3次。合并乙酸乙酯和47.1min,理論塔板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算不低于3000,按木犀草素峰計(jì)算不低于4000,按染料木素計(jì)算不低于4000,按芒柄花素峰計(jì)算不低于3000;槲皮素、木犀草素、染料木素和芒柄花素與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5;樣品中其他成分對(duì)槲皮素、木犀AB沈陽(yáng)藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第二章維血寧顆粒指標(biāo)成分的含量測(cè)定CDDSpatholobiD:samplewithoutYerbadetajoHerb1.quercetin2.Iteolin3.gnistein4.合溶液VI1,2,4,6,8mL,分置10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系虎杖苷、麥角甾苷和白藜蘆醇峰面積的RSD(n=6)分別為0.37%,0.62%,1.0%和0.82%。重復(fù)性試驗(yàn)取批號(hào)為061223的樣品，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法操作，和芒柄花素含量的RSD(n=6)分別為1.1%,0.68%,0.79%和0.47%。穩(wěn)定性試驗(yàn)取批號(hào)為061223的同一供試品溶液，室溫靜置，分別于0,2,4,8,為1.1%,1.2%,0.88%和0.53%。結(jié)果表明供試品溶液室溫放置24h內(nèi)基本穩(wěn)定。為3組。各組分別按樣品中成分含有量與加入成分量比例為1:0.5,1:1,1:1.5,分別精沈陽(yáng)藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第二章維血寧顆粒指標(biāo)成分的含量測(cè)定上述結(jié)果表明，所建立的維血寧顆粒中槲皮素、木犀草素、染料木素和芒柄花素含量同時(shí)測(cè)定的分析方法符合有關(guān)規(guī)定要求，可用于維血寧顆粒中此四種成分的含量測(cè)定。2.3.6樣品測(cè)定取3批樣品，每批取3份，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)方法制備供試品溶液。精密吸取各供試品溶液及對(duì)照品混合溶液Ⅲ各20μL,注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰面積，外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量。結(jié)果見表2-5。/μg:gRSD/%2.4維血寧顆粒中兒茶素和表兒茶素的含量測(cè)定沈陽(yáng)藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第二章維血寧顆粒指標(biāo)成分的含量測(cè)定流動(dòng)相：乙腈：0.15%磷酸水溶液：三乙胺(37:210:1,vv/v)柱溫：35℃進(jìn)樣量：20μL對(duì)照品溶液的制備分別稱取兒茶素和表兒茶素對(duì)照品適量，精密稱定，分置10單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。供試品溶液的制備取維血寧顆粒適量混勻研細(xì)。取細(xì)粉5g,精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入100mL甲醇，密塞，超聲提取20min。過(guò)濾，取濾液，35℃減壓旋轉(zhuǎn)3000,按表兒茶素峰計(jì)算不低于2000;兒茶素和表兒茶素與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5;樣品中其他成分對(duì)兒茶素和表兒茶素的測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果見圖2-3。ABC4,6,8mL,分置10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列濃度的對(duì)照品混譜儀，記錄色譜圖。以色譜峰面積Y對(duì)對(duì)照品濃度X(μg·mL)進(jìn)行線性回歸。求得兒茶分別為0.69%和0.40%。重復(fù)性試驗(yàn)取批號(hào)為061223的樣品，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法操作，平行制備供試品溶液6份，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析。兒茶素和表兒茶素含量的RSD(n=6)分別為1.0%和1.7%。穩(wěn)定性試驗(yàn)取批號(hào)為061223的同一供試品溶液，室溫靜置，分別于0,2,4,8,12,24h進(jìn)樣分析。兒茶素和表兒茶素峰面積的RSD(n=6)均為1.8%。結(jié)果表明供試品溶液室溫放置24h內(nèi)基本穩(wěn)定?；厥章试囼?yàn)取已知含量的樣品(批號(hào)061223)約2.5g共9份，精密稱定。平均分為3組。各組分別按樣品中成分含有量與加入成分量比例為1:0.5,1:1,1:1.5,分別精各0.5mL,1.0mL和1.5mL,揮干后，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作，在上述色有關(guān)規(guī)定要求，可用于維血寧顆粒中此二種成分的含量測(cè)定。2.4.6樣品測(cè)定取3批樣品，每批取3份，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)方法制備供試品溶液。精密吸取各供試品溶液及對(duì)照品混合溶液Ⅲ各20μL,注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰面積，外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量。結(jié)果見表2-7。2.5維血寧顆粒中大黃素和大黃素甲醚的含量測(cè)定流動(dòng)相：甲醇：0.2%磷酸水溶液(90:10,v/v)柱溫：35℃進(jìn)樣量：20μL對(duì)照品溶液的制備分別稱取大黃素和大黃素甲醚對(duì)照品適量，精密稱定，分置50mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度分別為98.2和38.0μg·mL?1的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。供試品溶液的制備取維血寧顆粒適量混勻研細(xì)。取細(xì)粉2g,精密稱定，置圓底燒瓶中，加入100mL三氯甲烷和100mL2.5molmL1硫酸，80℃回流2h。靜置，冷卻，分取三氯甲烷層。水層以100mL三氯甲烷二次萃取。合并三氯甲烷層，減壓旋轉(zhuǎn)對(duì)照溶液。A)BCWC#件)Fig.2-16A:referencesubstancesB:WeixueninggranulessampleC:sampleRadixPolygoniCuspidati1.emodin2.physcion標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密吸取大黃素儲(chǔ)備液13.5mL、大黃素甲醚儲(chǔ)備液6.5mL,置同Y=5.192×10?x-4.224×102r=Y=2.945×10?X+1.657×102r=0.9997結(jié)果表明，大黃素濃度在5.30～53.0μgmL1,大黃素甲醚濃度在0.988～9.88μgmL1),在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次。計(jì)算大黃素和大黃素甲醚峰面積的RSD(n=6)分別為0.71%和0.42%。重復(fù)性試驗(yàn)取批號(hào)為061227的樣品，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法操作，平行制備供試品溶液6份，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析。兒茶素和表兒茶素含量的RSD(n=6)分別為0.92%和0.76%。穩(wěn)定性試驗(yàn)取批號(hào)為061227的同一供試品溶液，室溫靜置，分別于0,2,4,8,12,24h進(jìn)樣分析。兒茶素和表兒茶素峰面積的RSD(n=6)分別為1.5%和0.97%。結(jié)果回收率試驗(yàn)取已知含量的樣品(批號(hào)061227)約1g共9份，精密稱定。平均分為3組。各組分別按樣品中成分含有量與加入成分量比例為1:0.5,1:1,1:1.5,分別精密沈陽(yáng)藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第二章維血寧顆粒指標(biāo)成分的含量測(cè)定上述結(jié)果表明，所建立的維血寧顆粒中大黃素和大黃素甲醚含量同時(shí)測(cè)定的分析方法符合有關(guān)規(guī)定要求，可用于維血寧顆粒中此二種成分的含量測(cè)定。2.5.6樣品測(cè)定取3批樣品，每批取3份，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)方法制備供試品溶液。精密吸取各供試品溶液及對(duì)照品混合溶液Ⅲ各20μL,注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰面積，外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量。結(jié)果見表2-9。2.6維血寧顆粒中梓醇的含量測(cè)定流動(dòng)相：乙腈：水(2:98,v/v)柱溫：35℃進(jìn)樣量：20μL供試品溶液的制備取維血寧顆粒適量混勻研細(xì)。取細(xì)粉2g,精密稱定，置具塞殘?jiān)?5mL水溶解，以50mL乙酸乙酯萃取二次，棄去乙酸乙酯層。精密量取水層4保留時(shí)間約為9.6min,理論塔板數(shù)按梓醇峰計(jì)算不低于3000;梓醇峰與相鄰色譜峰的分離度大于1.5;樣品中其他成分對(duì)梓醇的測(cè)定無(wú)千擾。結(jié)果見圖2-5。ABC標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0mL,分置10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列濃度的對(duì)照品混合溶液I、Ⅱ、Y=8.436×103X-7.899×10r=復(fù)進(jìn)樣6次。計(jì)算梓醇峰面積的RSD(n=6)為0.50%。重復(fù)性試驗(yàn)取批號(hào)為061227的樣品，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法操作，平行制備供試品溶液6份，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析。梓醇含量的RSD(n=6)為穩(wěn)定性試驗(yàn)取批號(hào)為061227的同一供試品溶液，室溫靜置，分別于0,2,4,8,12,24h進(jìn)樣分析。梓醇峰面積的RSD(n=6)為0.85%。結(jié)果表明供試品溶液室溫放置回收率試驗(yàn)取已知含量的樣品(批號(hào)061227)約1g共9份，精密稱定。平均分為3組。各組分別按樣品中成分含有量與加入成分量比例為1:0.5,1:1,1:1.5,分別精密2.6.6樣品測(cè)定取3批樣品，每批取3份，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)方法制備供試擇盡量減少結(jié)構(gòu)破壞的提樣方法，將其與虎杖苷同時(shí)測(cè)定能更準(zhǔn)確體現(xiàn)兩者含量，故此四個(gè)成分同時(shí)測(cè)定。槲皮素、木犀草素、染料木素和芒柄花素為黃酮類成分，提取方法近似，且均為有效成分，選為含量測(cè)定的指標(biāo)成分；兒茶素和表兒茶素是同類物質(zhì)，且為君藥雞血藤的有效成分之一，選為含量測(cè)定的指標(biāo)成分；大黃素和大黃素甲醚是虎杖的活性成分，含量水平便于測(cè)定，選為含量測(cè)定的指標(biāo)成分。梓醇為地黃和熟地黃中的主要有效成分，故為含量測(cè)定的指標(biāo)成分。由于白藜蘆醇的熱穩(wěn)定性不佳，而且加熱可能導(dǎo)致虎杖苷水解轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，首選超聲法901。分別選擇不同濃度甲醇水溶液(60%,80%,100%)進(jìn)行不同時(shí)間(20,30,40min)的超聲提取。結(jié)果顯示水-甲醇提取效果優(yōu)于甲醇提取，但顆粒劑型輔料含量大，水-甲醇提取所得樣品雜質(zhì)多。因此考慮選擇與待測(cè)成分極性相近，且與水不相混溶的有機(jī)溶劑萃取去除水溶性雜質(zhì)?？疾炝苏〈?，乙酸乙酯，氯仿進(jìn)行萃取，最后確定乙酸乙酯效果最佳。如此確定樣品制備方法，需經(jīng)超聲、除醇、萃取、濃縮多步，操作復(fù)雜，損失較大。由于本待測(cè)藥品為顆粒劑，可與水形成均勻溶液(除少量混懸物外)。綜合考慮，最終將提取方法改進(jìn)為：樣品水溶后，直接以共12.5倍體積的乙酸乙酯進(jìn)行3次萃取，合并濃縮乙酸乙酯層得供試品溶液。提取完全，且雜質(zhì)干擾低。槲皮素、木犀草素、染料木素和芒柄花素均為黃酮類化合物，存在形式有游離態(tài)和糖苷結(jié)合態(tài)兩種。因此在提取過(guò)程中采用了水解法，并參考文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)考查確定了水解在制備過(guò)程中引入水則會(huì)產(chǎn)生大量水溶性輔料雜質(zhì)。因此在提取過(guò)程中加入了萃取步驟。水解完畢后，樣品溶液為較強(qiáng)酸性狀態(tài)，待測(cè)成分呈離子態(tài)不易被萃取至有機(jī)相中。因此萃取之前在溶液中加入碳酸氫鈉中和酸性，使萃取在弱酸至中性的環(huán)境中進(jìn)行，提兒茶素和表兒茶素的提取溶劑考察了甲醇，甲醇-水不同比例的混合溶劑，結(jié)果表明甲醇提取率較混合提取溶劑效率高，且引入雜質(zhì)少，確定其為提取溶劑。兒茶素和表兒茶素為同分異構(gòu)體，文獻(xiàn)報(bào)道在加熱條件下二者容易發(fā)生差向立體異構(gòu)化反應(yīng)，表兒茶素向兒茶素轉(zhuǎn)化93]。因此提取過(guò)程中注意溫度的控制。在提取較完全的前提下，設(shè)定超聲時(shí)間為20分鐘，旋蒸時(shí)設(shè)定溫度為35℃,盡量減少因轉(zhuǎn)化帶來(lái)的誤差。梓醇的含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)中分別考察了甲醇，甲醇-水混合溶劑和水進(jìn)行樣品中梓醇的提取，提取效果無(wú)太大差異。但是由于本藥劑型為顆粒劑，水提取或混合溶液提取液均較為渾濁，雜質(zhì)多，因此選擇甲醇作為提取溶劑。梓醇極性極大，實(shí)驗(yàn)采用乙酸乙酯對(duì)樣品溶液進(jìn)行萃取，去除樣品液中存在的很多極性相對(duì)小的雜質(zhì)，優(yōu)化樣品溶液[94]。以乙酸乙酯對(duì)水溶液進(jìn)行萃取易發(fā)生乳化，本實(shí)驗(yàn)水溶液有少量混懸物使此情況較為明顯。乳化現(xiàn)象嚴(yán)重降低萃取率且引入雜質(zhì)。實(shí)驗(yàn)考察了冰凍法，溫水浴法，超聲法，破乳劑法(飽和硫酸鈉溶液，異丙醇，乙醇)進(jìn)行破乳。結(jié)果顯示，超聲法簡(jiǎn)便效率高效果好。最后確定樣品超聲2min并輔以輕輕振搖破乳，達(dá)到良好的破乳效果。檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇方法：將相應(yīng)對(duì)照品配制為單一儲(chǔ)備液(盡量以流動(dòng)相中有機(jī)相為溶劑),進(jìn)行紫外掃描確定最大吸收波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。同時(shí)測(cè)定時(shí)，則兼顧含量較小的成分，以盡量減小待測(cè)成分的峰面積差別為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行選擇。甲醇和乙腈為有機(jī)相，醋酸水溶液(1%,2%)和磷酸水溶液(0.05%,0.1%,0.15%),進(jìn)行雙相組合篩選。結(jié)果顯示，有機(jī)相為乙腈時(shí)峰形好，理論塔板數(shù)高；水相為磷酸水溶液時(shí)峰形更佳，尤以麥角甾苷最為明顯。磷酸水溶液0.05%濃度效果較差，而0.1%與0.15%濃度效果無(wú)明顯差異?？紤]色譜柱的保護(hù)，最終流動(dòng)相選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)。同時(shí)測(cè)定槲皮素、木犀草素、染料木素和芒柄花素時(shí)，因待測(cè)物均為弱酸性物質(zhì)，水相中加入少量酸調(diào)節(jié)pH值，減少拖尾提高靈敏度。隨酸濃度增大效果更好?？紤]到對(duì)柱子的保護(hù)選擇了0.15%磷酸。有機(jī)相選擇甲醇時(shí)，染料木素和木犀草素不能很好分離，而選擇乙腈時(shí)，則槲皮素和木犀草素分離狀態(tài)不佳。最后采用甲醇-乙腈-磷酸水溶液三相系統(tǒng)，四個(gè)成分能夠達(dá)到基線分離。文獻(xiàn)中報(bào)道兒茶素和表兒茶素的測(cè)定多采用枸櫞酸水溶液-N,N-二甲基甲酰胺-四氫呋喃系統(tǒng)或者梯度洗脫系統(tǒng)97,98],本文就相對(duì)簡(jiǎn)單的色譜條件進(jìn)行了考察。因待測(cè)物為弱酸性物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)考慮利用有機(jī)相-酸水系統(tǒng)。僅采用酸性水溶液峰形一直不佳，兩物質(zhì)出峰時(shí)間早，與前段雜質(zhì)峰分離不佳。且兩物質(zhì)保留時(shí)間相差大，不適宜同時(shí)測(cè)定。嘗試添加四氫呋喃，三乙胺改善條件。結(jié)果顯示添加一定量的三乙胺，調(diào)節(jié)pH值為5.5~6.0之間時(shí)，二物質(zhì)峰形最佳，且保留時(shí)間大幅推后。在此基礎(chǔ)上增大有機(jī)相比例，縮短保留時(shí)間同時(shí)進(jìn)一步優(yōu)化峰形，達(dá)到較好測(cè)定效果。第三章維血寧顆粒中虎杖苷的藥物動(dòng)力學(xué)研究TGL-16G型離心機(jī)XW-80A渦旋混和器龍膽苦苷(批號(hào)110770-200510)其他同第二章2.1項(xiàng)下健康雄性Winstar大鼠，體重180～200g,沈陽(yáng)藥科大學(xué)動(dòng)物中心提供。試驗(yàn)期間對(duì)照品溶液：取虎杖苷對(duì)照品適量，精密稱定，置50mL量瓶中，用甲醇溶解并維血寧顆粒灌胃液：由于本藥為顆粒劑，輔料用量大，不能滿足大鼠灌胃給藥需要。故按照《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第五冊(cè)收載維血寧顆粒標(biāo)準(zhǔn)，按處方比例稱取各藥材，以標(biāo)準(zhǔn)制備方法，制成濃縮浸膏。取適量浸膏，以水稀釋制成虎杖苷濃度為3.14mg·mL1的混懸液備用。精密吸取大鼠血漿100μL,甲醇和內(nèi)標(biāo)溶液各20μL,共置1mL離心管中，渦旋混合30s。加入甲醇200μL,渦旋混合1min后，以10000r·min1離心10min,取上流動(dòng)相：乙腈：水(20:80,v/v)柱溫：35℃進(jìn)樣量：20μL在上述色譜條件下，虎杖苷色譜峰，內(nèi)標(biāo)色譜峰與相鄰峰的分離度均大于1.5,理論塔板數(shù)按虎杖苷峰計(jì)算不低于5000。內(nèi)標(biāo)龍膽苦苷的保留時(shí)間約為5min,虎杖苷的保留時(shí)間約為11min。對(duì)大鼠空白血漿色譜圖，模擬血漿樣品色譜圖和給藥后大鼠血漿樣品色譜圖進(jìn)行比較，在選定的色譜條件下，血漿內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)虎杖苷測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果見圖3-1。取空白大鼠血漿100μL,加入內(nèi)標(biāo)溶液與虎杖苷標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各20μL,分別制成模擬血漿樣品，按3.2.2項(xiàng)下自“渦旋混合30s”開始的方法操作，記錄色譜圖。以虎杖苷濃度為橫坐標(biāo)，虎杖苷峰面積與龍膽苦苷峰面積比為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(w=1/2)最小范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?；⒄溶斩肯孪?LLOQ)為0.0986μgmL1。結(jié)果見表3-1。r123取空白血漿100μL,按3.2.6項(xiàng)下的方法操作，分別制成低(0.1971μgmL1)、中(0.986μgmL1)、高(7.885μg:mL)三濃度的質(zhì)量控制(QC)樣品，每一濃度進(jìn)行6樣本分析，連續(xù)測(cè)定三天。以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算虎杖苷濃度，求得方法準(zhǔn)確度與精密度。本分析方法的日間精密度RSD≤3.6,日內(nèi)精密度RSD≤7.1,RE在±5之間，均符合生物樣品分析方法指導(dǎo)原則有關(guān)規(guī)定。結(jié)果見表3-2。10.205023n沈陽(yáng)藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第三章維血寧顆粒中虎杖苷的藥物動(dòng)力學(xué)研究取空白血漿100μL,按3.2.6項(xiàng)下的方法制備虎杖苷低(0.1971μgmL)、中析。另取相應(yīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各20μL,共置1mL離心管中，于37℃水浴中按3.2.2項(xiàng)下自“渦旋混合30s”開始的方法操作，將獲得的上清液轉(zhuǎn)移至上文所述含藥離心管中，渦旋混合30s,制備為未經(jīng)提取血漿樣品，每一濃度進(jìn)行3樣本分析，低、中、高三濃度各獲得相應(yīng)峰面積(三份樣品測(cè)定的平均值)。以每一濃度兩種處理沈陽(yáng)藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第三章維血寧顆粒中虎杖苷的藥物動(dòng)力學(xué)研究放置4h,考察室溫穩(wěn)定性；反復(fù)凍融3次，考察凍融穩(wěn)定性；-20℃放置6天，考察長(zhǎng)期穩(wěn)定性。將含藥血漿按3.2.7項(xiàng)下方法制備為質(zhì)控樣品，低、高濃度各三份，室溫下放置12h,考察樣品處理后穩(wěn)定性。結(jié)果見表3-4,3-5,3-6和3-7。四項(xiàng)穩(wěn)定性考察結(jié)果表明在測(cè)定條件下，樣品穩(wěn)定性良好。n36.433.9 n3333n33沈陽(yáng)藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第三章維血寧顆粒中虎杖苷的藥物動(dòng)力學(xué)研究n33健康雄性Vistar大鼠6只，給藥前禁食12h,自由飲水。灌胃給予維血寧顆粒灌胃大鼠灌胃后，分別于7,10,15,20,25,30,45,60,90,120,150,180,240min,3-8,平均血藥濃度一時(shí)間曲線見圖3-2。二室開放模型，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為：Tmaμg·mL1,t12a=(0.202±0.142)h1,AUCo→t=(1.511±0.550)mg·L1·h,沈陽(yáng)藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第三章維血寧顆粒中虎杖苷的藥物動(dòng)力學(xué)研究0(123456沈陽(yáng)藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第三章維血寧顆粒中虎杖苷的藥物動(dòng)力學(xué)研究3.5小結(jié)與討論流動(dòng)相系統(tǒng)考察，選擇甲醇，乙腈為有機(jī)相，不同比例磷酸，醋酸水溶液和水為水相。結(jié)果顯示乙腈條件下峰形較佳，且與雜質(zhì)峰分離好。而水相是否添加酸對(duì)峰形并無(wú)太大影響。最后采用乙腈-水流動(dòng)相，條件簡(jiǎn)單，效果好。內(nèi)標(biāo)的選擇，考察了紫丁香苷、淫羊藿苷、橙皮苷、龍膽苦苷、卡馬西平等多個(gè)物質(zhì)。最后確定龍膽苦苷保留時(shí)間適中，且與其他物質(zhì)分離較好。確定其為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。樣品提取方法，考察了液-液萃取法和沉淀蛋白法。液-液萃取法考察了乙酸乙酯，乙醚，正己烷，效果均不佳。沉淀蛋白法考察了甲醇，乙腈，高氯酸，結(jié)果顯示，酸性條件沉淀蛋白將導(dǎo)致虎杖苷部分分解，不利于測(cè)定。而乙腈沉淀蛋白后，樣品溶液分析時(shí)峰形差，而且雜質(zhì)峰多。最后選擇了甲醇沉淀蛋白作為樣品處理方法。首次研究了大鼠口服給予維血寧顆粒后，虎杖苷在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程。以DAS2.0藥動(dòng)學(xué)軟件的對(duì)血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果表明虎杖苷在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程符合二室開放模型?；⒄溶盏奈瞻胨テ诙蹋?5min左右血藥濃度即達(dá)峰值，分布半衰期和消除半衰期值均較小，表明虎杖苷在大鼠消化道內(nèi)被快速吸收入血，分布和消除過(guò)程速度也較為迅速，不易蓄積中毒。本文研究結(jié)果僅為單個(gè)復(fù)方所獲得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，所獲得的結(jié)論還不能全面地描述虎杖苷的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過(guò)程特點(diǎn)，而且在虎杖苷的體內(nèi)組織分布情況，以及與其它藥味或化學(xué)成分的相互作用等方面，均有待進(jìn)一步深入和廣泛的研究。第四章結(jié)果與討論本文對(duì)維血寧顆粒中多個(gè)指標(biāo)成分的含量測(cè)定方法進(jìn)行研究，建立了同時(shí)測(cè)定芍藥苷、虎杖苷、麥角甾苷和白藜蘆醇含量的高效液相色譜方法；建立了同時(shí)測(cè)定槲皮素、木犀草素、染料木素和芒柄花素含量的高效液相色譜方法；建立了同時(shí)測(cè)定兒茶素和表兒茶素含量的高效液相色譜方法；建立了同時(shí)測(cè)定大黃素和大黃素甲醚含量的高效液相色譜方法，以及建立了單獨(dú)測(cè)定梓醇含量的高效液相色譜方法。本研究為維血寧顆粒的質(zhì)量控制提供了初步的定性、定量分析依據(jù)。本文采用反相高效液相色譜法建立了大鼠血漿中虎杖苷濃度的測(cè)定方法，以龍膽苦苷為內(nèi)標(biāo)。方法專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)便。在此基礎(chǔ)上，研究了大鼠給予維血寧顆粒灌胃液后，虎杖苷血藥濃度隨時(shí)間的變化規(guī)律，并采用DAS2.0實(shí)用藥物動(dòng)力學(xué)程序軟件，對(duì)血藥濃度-時(shí)間曲線進(jìn)行隔室模型擬合，計(jì)算其相應(yīng)藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示，虎杖在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程符合二室模型，且吸收、代謝速度均較快，表觀分布容積大。本研究為深入分析維血寧顆粒作用機(jī)理，指導(dǎo)臨床用藥，以及進(jìn)一步開發(fā)該中藥品種提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。但本研究?jī)H對(duì)方中虎杖中單一成分進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究，顯然不夠全面。應(yīng)進(jìn)一步研究其它有效成分在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，全面闡明維血寧顆粒的作用機(jī)制。參考文獻(xiàn)[1]張志芬.淺談天然藥物的發(fā)展與中藥研究[J].中國(guó)中藥雜志，2005,30(2):1375-1376,1389[2]邵進(jìn)明，梁光義.中藥復(fù)方研究方法綜述[J].貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007,29(4):56-57[3]沈雪梅，何偉.中藥現(xiàn)代化發(fā)展的思考[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2005,21(2):200-202[4]肖培根，肖小河.21世際與中藥現(xiàn)代化[J].中國(guó)中藥雜志，2000,25(2):67-70[5]范穎.中藥復(fù)方現(xiàn)代化研究的現(xiàn)狀與基本思路[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2007,13(6):63-65[6]蔣文躍.尋找物質(zhì)基礎(chǔ)非當(dāng)前中藥現(xiàn)代化關(guān)鍵[J].中草藥，2003,34(1):1-3[7]孫彩華.指紋圖譜在中藥研究領(lǐng)域的應(yīng)用[J].中國(guó)藥業(yè)，2006,15(17):25-27[8]賈曉斌，陳彥，李霞，等.中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)研究新思路和方法[J],中華中醫(yī)藥雜志.[9]黃瑛.中藥復(fù)方質(zhì)量控制方法研究進(jìn)展[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2008,26(1):11-13,37[10]王智民.中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的系統(tǒng)研究是中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵[J].中國(guó)中藥雜志，2003,28(12):[11]王躍生.中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)代化發(fā)展現(xiàn)狀與思考[J].中國(guó)中藥雜志，2003,28(12):1108-1110[12]鐘國(guó)躍，于超，趙志禮.中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法新探一“有限成分組合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”論[J].中國(guó)中[13]王欣，謝鳴.中藥質(zhì)量控制面臨的問(wèn)題及其研究[J].中國(guó)試驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2003,9(1):60-61[14]張鏢.中藥復(fù)方研究現(xiàn)狀與思路探析[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007,23(2):104-106[15]劉瑩瑩，馬越鳴.中藥復(fù)方藥代動(dòng)力學(xué)研究新進(jìn)展[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008,22(1):76-78[16]張英豐，董宇，朱曉新.中藥復(fù)方藥代動(dòng)力學(xué)研究的方法與思考[J].中國(guó)天然藥物，[17]周麗娟，許利平，陳慧娟，等.中藥復(fù)方藥代動(dòng)力學(xué)常用研究方法評(píng)價(jià)[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，[18]周莉玲，李銳.中藥制劑的動(dòng)力學(xué)研究探討[J].中成藥研究，1986,8(1):3-5[19]殷文光，李曼玲，劉淑芝.中藥復(fù)方藥動(dòng)學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，[20]張秀娟，蔣琳蘭.中藥復(fù)方藥動(dòng)學(xué)研究思路及方法探討[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，[21]趙興紅，王光輝，劉國(guó)安.高效液相色譜技術(shù)(HPLC)在中藥研究中的應(yīng)用[J].中華臨床醫(yī)學(xué)衛(wèi)生雜志，2006,4(1):34-36[22]中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)[S].WS3-B-1031-91[23]顧崢嶸，承晨.HPLC法測(cè)定維血寧顆粒中大黃素的含量[J].江蘇藥學(xué)與臨床研究，2005,13(4):[24]李建忠，朱文學(xué).維血寧顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥業(yè)，2005,14(5):41-42[25]華新農(nóng)，吳文英.維血寧糖漿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].國(guó)際中醫(yī)中藥雜志，006,28(3):159-161[26]鄭錦輝，張偉娟.HPLC法測(cè)定維血寧中芍藥苷的含量[J].海峽藥學(xué)，2008,20(6):80-82[27]楊小月，周熙.RP—HPLC法測(cè)定維血寧糖漿中芍藥苷的含量[J].中華臨床醫(yī)學(xué)研究雜志，[28]FengJie,LiangHong,ZhaoYu-ying,et.FlavonoidsfromMillettianititavar.hirsutissima[J],JournofChinesePharmaceuticalSciences.200[29]高玉瓊，劉建華，趙德剛，等.不同產(chǎn)地雞血藤揮發(fā)性成分研究[J].中成藥，2006,2[30]嚴(yán)啟新，李萍，胡安明.雞血藤的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2003,34(10):876-878[31]馮潔，向誠(chéng)，梁鴻，等.豐城雞血藤異黃酮類成分的研究[J].中[32]羅霞，陳東輝，余夢(mèng)瑤，等.雞血藤煎劑對(duì)小鼠紅細(xì)胞增殖的影響[J].中國(guó)中藥雜志，[33]鄧家剛，梁寧，林啟云.雞血藤總黃酮對(duì)血虛模型小鼠造血功能的影響[J].中草藥，[34]韋麟，潘炳堂，黃禮周，等.雞血藤臨床應(yīng)用概述[J].中國(guó)民間療法，2007,15(5):63-64[35]劉屏，穆麗華，韓亞亮，等.雞血藤活性化合物兒茶素結(jié)構(gòu)修飾及抗輻射作用研究[J].解放[36]余燕影，章麗華，曹樹穩(wěn).豐城雞血藤黃酮提取物清除自由基活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與[37]高小榮，田庚元.白芍化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志，2006,15(6):416-418[38]王巧，郭洪祝，霍長(zhǎng)虹，等.白芍化學(xué)成分研究[J].中草藥，2007,38(7):972-976[3