高三二輪復(fù)習(xí)生物：基因工程課件

二輪必備精品2025年高考生物

復(fù)習(xí)講練測第1講

基因工程專題八

生物技術(shù)與工程二輪一、重組DNA技術(shù)的基本工具1.限制酶：（1）來源及原因?（2）作用?（3）限制酶切割目的基因時需切割幾次?產(chǎn)生幾個末端?斷開幾個磷酸二酯鍵?2.DNA連接酶：（1）作用?（2）分類?來源?作用的差別?3.載體：（1）載體的種類?（2）載體的作用?（3）質(zhì)粒是什么?（4）作為載體必須具備的條件是什么？希望我們二輪復(fù)習(xí)能夠持續(xù)精進(jìn)！——自主梳理課本（選必三）3.11.基因工程(1)概念理解必備知識基因重組分子受體目的基因遺傳性狀(2)理論基礎(chǔ)必備知識拼接的基礎(chǔ)1.DNA的基本組成單位相同（四種脫氧核苷酸）表達(dá)的基礎(chǔ)2.都遵循堿基互補(bǔ)配對原則3.DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)1.基因是控制生物性狀的結(jié)構(gòu)與功能單位2.遺傳信息的傳遞都遵循中心法則基因在空間上轉(zhuǎn)移并成功表達(dá)3.生物界共用一套遺傳密碼。（相同的遺傳信息在不同的生物體內(nèi)表達(dá)出相同的蛋白質(zhì)）。DNA（基因）

轉(zhuǎn)錄翻譯mRNA蛋白質(zhì)磷酸二酯黏性基本工具基本工具AGTCATTCGATAGGATCATCATAT限制酶CCCGGGGGGCCCGGGCCCCCCGGG限制酶黏性末端平末端知能必備【教材拾遺】(1)[選擇性必修3P71旁欄]原核生物中限制酶的作用是

。(2)[選擇性必修3P74拓展應(yīng)用T1]限制酶來源于原核生物,不切割自己的DNA分子的原因是

。必備知識切割外源DNA以保證自身安全,防止外來病原物的危害原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾高考調(diào)頻考點(diǎn)——限制酶選取原則

①不破壞目的基因原則②保留標(biāo)記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)③確保出現(xiàn)相同黏性末端原則，切割質(zhì)粒的限制酶要與切割目的基因的限制酶相同④若質(zhì)粒上標(biāo)出T-DNA片段,則所選限制酶切割位點(diǎn)應(yīng)位于T-DNA片段中設(shè)切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ,則下圖中甲、乙、丁Ti質(zhì)粒均不宜選取,而丙Ti質(zhì)粒宜選取。高考調(diào)頻考點(diǎn)——限制酶選取原則

1.回答下列問題:已知在新霉素抗性基因內(nèi)部存在HindⅢ識別序列，質(zhì)粒的其他部位和目的基因內(nèi)部均無XbaⅠ、SacⅠ、HindⅢ三種限制酶的識別位點(diǎn)，假設(shè)tPA基因?yàn)?80bp，若只選擇SacⅠ對目的基因和質(zhì)粒進(jìn)行酶切，缺點(diǎn)是__________________________________________________；若選擇XbaⅠ、SacⅠ對目的基因和質(zhì)粒進(jìn)行酶切，缺點(diǎn)是___________________________；因此最好選用____________________對目的基因和質(zhì)粒進(jìn)行酶切。不能避免目的基因的自身環(huán)化和反向連接無法篩選空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒XbaⅠ、HindⅢ①防止目的基因和載體自身環(huán)化方法總結(jié)：雙酶切的優(yōu)點(diǎn)②防止目的基因與載體反向連接高考調(diào)頻考點(diǎn)——限制酶選取原則單酶切知識點(diǎn)二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的核心3.構(gòu)建過程：將同一種限制酶切割獲得的目的基因和質(zhì)粒混合后加DNA連接酶會出現(xiàn)的連接方式有:質(zhì)粒目的基因自身環(huán)化目的基因自身環(huán)化質(zhì)粒自身環(huán)化質(zhì)粒與目的基因反向連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接反向連接自身連接問題4:怎么改進(jìn)解決以上問題？高考調(diào)頻考點(diǎn)——限制酶限制酶HindⅡAluⅠBamHⅠSau3AⅠ識別序列及切割位點(diǎn)↓5'-GTYRAC-3'

↓5'-AGCT-3'

↓5'-GGATCC-3'

↓5'-GATC-3'【典例1】下表是幾種限制酶的識別序列及切割位點(diǎn)（Y=C或T，R=A或G）。下列相關(guān)敘述正確的是（）A．限制酶切割一次需切斷2個磷酸二酯鍵，增加2個游離的磷酸基團(tuán)B．一種限制酶只能識別一種核苷酸序列，并在特定位點(diǎn)切割C．AluⅠ切割后的DNA片段可用E.coliDNA連接酶連接D．BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的片段進(jìn)行重組后，BamHⅠ和Sau3AⅠ均不能識別并切割A(yù)一種限制酶不一定只識別一種核苷酸序列，如HindⅡ用AluⅠ切割得到的是平末端,E.coliDNA連接酶只能連接黏性末端Sau3AⅠ可識別并切割重組片段[2023湖北卷-T22]構(gòu)建重組質(zhì)粒需要使用DNA連接酶。下列屬于DNA連接酶底物的是

。高考調(diào)頻考點(diǎn)——DNA連接酶④考點(diǎn)一

基因工程的基本工具歸納提升與DNA有關(guān)的幾種酶的比較8.某同學(xué)擬用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA連接酶為工具，將目的基因（兩端含相應(yīng)限制酶的識別序列和切割位點(diǎn)）和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是（

）A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B．質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接C高考調(diào)頻考點(diǎn)——限制酶11題圖作業(yè)

生物二輪復(fù)習(xí)大本125頁

真題引領(lǐng)3127頁1、3題128頁10題第二張卷子（真題引領(lǐng)3）用氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、四環(huán)素抗性基因（TetR）作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如上圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體（重組質(zhì)粒），并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯誤的是（）A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落D高考調(diào)頻考點(diǎn)——限制酶第一步：目的基因的篩選與獲取，目的基因的獲取方法?第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的?2.5個組成？標(biāo)記基因的作用？復(fù)制原點(diǎn)的作用？啟動子：本質(zhì)？位置作用？什么是誘導(dǎo)型啟動子？終止子：本質(zhì)？位置？作用？3.構(gòu)建過程？(3條)雙酶切（兩種不同的限制酶）分別切割目的基因和質(zhì)粒，優(yōu)勢？第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.轉(zhuǎn)化的概念？導(dǎo)入的方法、受體細(xì)胞？2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法過程？(注意兩次拼接、兩次導(dǎo)入)、原理？第四步：目的基因的檢測與鑒定1.檢測與鑒定目的？分子水平檢測什么？檢測方法有？2.個體生物學(xué)水平的鑒定方法？二、基因工程的基本操作程序(2)構(gòu)建目的基因表達(dá)載體?？蒲腥藛T從構(gòu)建的GFP突變基因文庫中提取目的基因（均為突變基因）構(gòu)建表達(dá)載體，其模式圖如下所示（箭頭為GFP突變基因的轉(zhuǎn)錄方向）。圖中①為

；②為

，其作用是

；圖中氨芐青霉素抗性基因是一種標(biāo)記基因，其作用是

。高考調(diào)頻考點(diǎn)——基因表達(dá)載體的構(gòu)建終止子啟動子RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。(3)目的基因的表達(dá)?？蒲腥藛T將構(gòu)建好的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌有的發(fā)綠色熒光，有的發(fā)黃色熒光，有的不發(fā)熒光。請從密碼子特點(diǎn)的角度分析，發(fā)綠色熒光的可能原因是

（答出1點(diǎn)即可）。密碼子具有簡并性項(xiàng)目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)DNADNAmRNAmRNA位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號(編碼氨基酸)翻譯的結(jié)束信號(不編碼氨基酸)辨析：“啟動子與終止子”和“起始密碼子與終止密碼子”。細(xì)胞類型植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法____________法、____________法________技術(shù)受體細(xì)胞受精卵、體細(xì)胞________原核細(xì)胞使用最廣泛的是大腸桿菌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化花粉管通道顯微注射受精卵辨析農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的“兩個兩次”①兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA的中間部位；第二次拼接指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上。②兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌；第二次導(dǎo)入是指將含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。03將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞Ca2＋處理法轉(zhuǎn)化：指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程。04目的基因的檢測與鑒定雙標(biāo)記篩選方法：①將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌放在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含質(zhì)粒的細(xì)菌和含質(zhì)?！|(zhì)粒的細(xì)菌，如圖1、2、3、4、5菌落；②再利用滅菌的絨布影印到含四環(huán)素培養(yǎng)基上，不生長的即為含目的基因的菌落，如圖1、5。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)。篩選含目的基因的受體細(xì)胞（以大腸桿菌為例）——標(biāo)記基因的作用八省聯(lián)考關(guān)鍵能力提升：據(jù)圖分析抗蟲棉的培育過程。(1)該過程中的目的基因是

，載體是

。(2)基因工程中，往往使用兩種限制酶切割目的基因，這樣做的原因是什么？Bt基因Ti質(zhì)粒為了避免目的基因和載體的自身環(huán)化和反向連接。(3)為了保證目的基因在受體細(xì)胞中能正確表達(dá)，對目的基因在質(zhì)粒中的插入位點(diǎn)有什么要求？目的基因應(yīng)插入啟動子與終止子之間。(4)該實(shí)例中，導(dǎo)入目的基因的方法是

。為什么目的基因可以整合到染色體的DNA上？由于Ti質(zhì)粒上的T－DNA可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞且能整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，而目的基因又插入T－DNA，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(5)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞時，能否僅把目的基因整合到線粒體DNA或葉綠體DNA上？為什么？一般不能。如果僅把目的基因整合到線粒體DNA或葉綠體DNA上，由于細(xì)胞分裂可能導(dǎo)致目的基因丟失，無法穩(wěn)定遺傳。(6)該實(shí)例中，檢測目的基因是否成功表達(dá)的常見方法有哪些？

抗原—抗體雜交、用棉葉飼喂棉鈴蟲?？键c(diǎn)二

基因工程的基本操作程序三、實(shí)驗(yàn)：DNA的粗提取與鑒定1.DNA粗提取與鑒定的原理？2.不能選擇哺乳動物成熟的紅細(xì)胞的原因？3.研磨后過濾的方案是？4.4℃冰箱放置幾分鐘的作用？攪拌時應(yīng)輕緩、并沿一個方向的原因？

5.鑒定試劑？四、PCR及電泳鑒定1.DNA體外擴(kuò)增的原理？DNA片段電泳鑒定原理？2.DNA片段擴(kuò)增的具體過程。3.PCR：名稱、原理、儀器、條件、過程?緩沖溶液中添加Mg2+的作用?用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？引物的作用？DNA復(fù)制的方向?引物是什么？引物的種類？為何需要2種引物？擴(kuò)增n次需要多少個引物：至少需經(jīng)過幾次循環(huán)才能分離得到所需要的DNA區(qū)段？鑒定PCR產(chǎn)物的方法？希望我們二輪復(fù)習(xí)能夠持續(xù)精進(jìn)！——自主梳理課本（選必三）3.18．（2024·湖南）現(xiàn)發(fā)現(xiàn)某植物群體中有一植株，推測其Rubisco的編碼基因發(fā)生突變所致。Rubisco由兩個基因（包括1個核基因和1個葉綠體基因）編碼，這兩個基因及兩端的DNA序列已知。擬以該突變體的葉片組織為實(shí)驗(yàn)材料，以測序的方式確定突變位點(diǎn)。寫出關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)步驟：①_____________；②______________

；③________________；④基因測序；⑤_________________

。序列比對分析提取DNA設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)高考調(diào)頻考點(diǎn)——引物Q1：引物是什么？引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸。長度約為20~30個核苷酸。細(xì)胞中：一段單鏈RNA，PCR中：一段人工合成的單鏈DNA。Q2：為什么需要引物？DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸。Q3：引物的作用？使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸。Q4:設(shè)計(jì)引物的依據(jù)是？目的基因兩端的核苷酸序列。高考調(diào)頻考點(diǎn)——引物Q5:為什么延伸時需要加入兩種引物？

DNA是反向平行的雙鏈，DNA聚合酶只能從引物3′端延伸DNA鏈，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時被擴(kuò)增。Q6:兩種引物與模板鏈的哪一端配對？引物的5′端與模板鏈的3′端互補(bǔ)配對3’5’3’5’Q7:引物設(shè)計(jì)的要求（或引物失效的原因）？a.引物自身不能環(huán)化。b.兩種引物之間不能發(fā)生堿基互補(bǔ)配對。高考調(diào)頻考點(diǎn)——引物Q8:引物的3‘端和5‘端哪個能改造？引物的3‘端為結(jié)合模板DNA的關(guān)鍵堿基,一般不能改造，5'端無嚴(yán)格限制,可用于添加限制酶切割位點(diǎn)等序列?？稍谝锏?’端加上限制酶的識別序列。Q9:為了便于將擴(kuò)增的DNA片段與運(yùn)載體連接，可如何操作？使目的基因定向（正確）插入載體并避免目的基因自身環(huán)化。Q10:在兩種引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制酶識別序列,主要目的是？(3)在利用PCR技術(shù)擴(kuò)增R（抗旱）或r基因過程中，利用__________可尋找抗旱基因的位置并進(jìn)行擴(kuò)增。(4)設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的2組引物（圖5）都不合理，請分別說明理由。①第1組：________________________________________;②第2組：________________________________________。(4)科研過程中，可用PCR技術(shù)檢測受體細(xì)胞是否成功轉(zhuǎn)入了目的基因。提取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞的全部DNA分子，用目的基因的引物擴(kuò)增。擴(kuò)增完畢后，檢測發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物中除目的基因外，還有其他不同大小片段的非目的基因片段，可能的原因一般有：________。①模板受到污染；②退火溫度過高；③引物太短；④延伸溫度偏低。高考調(diào)頻考點(diǎn)——引物①③引物引物I和引物II局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對引物I自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對而失效[方法總結(jié)]1.設(shè)計(jì)引物的主要原則①引物長度通常為20~30個核苷酸,可防止隨機(jī)結(jié)合。②兩種引物之間不能互補(bǔ)配對③引物自身不能環(huán)化④為構(gòu)建合適酶切位點(diǎn),常常需要在2種引物的5'端添加不同的限制酶的識別序列。引物太短，錯配幾率大，特異性弱PCR基礎(chǔ)知識回顧全稱：原理：反應(yīng)條件：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制①緩沖溶液（含Mg2+）；②DNA模板；③2種引物（引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸）；④4種脫氧核苷酸；⑤耐高溫的DNA聚合酶；PCR基礎(chǔ)知識回顧擴(kuò)增過程：變性：雙鏈DNA解聚為單鏈；復(fù)性：兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合；延伸：4中脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈。PCR基礎(chǔ)知識回顧產(chǎn)物鑒定：PCR異常情況分析；擴(kuò)增不成功：擴(kuò)增結(jié)果不止一條條帶：瓊脂糖凝膠電泳；漏加了PCR的反應(yīng)成分；各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)；PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)?；引物設(shè)計(jì)不合理，與非目的序列有同源性，擴(kuò)增產(chǎn)生非目的序列；引物容易形成二聚體，形成短小條帶；復(fù)性（退火）溫度過低，引物與非目的序列結(jié)合；DNA聚合酶的質(zhì)量不好，在延伸過程中從模板脫落，產(chǎn)生不完整的短片段。(1)接種上述重組乙肝疫苗不會在人體中產(chǎn)生乙肝病毒，原因是

。(2)制備重組乙肝疫苗時，需要利用重組表達(dá)載體將乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）導(dǎo)入酵母細(xì)胞中表達(dá)。重組表達(dá)載體中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是

。能識別載體中的啟動子并驅(qū)動目的基因轉(zhuǎn)錄的酶是。

1．（2023·全國·統(tǒng)考高考真題）接種疫苗是預(yù)防傳染病的一項(xiàng)重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的傳播，降低乙型肝炎發(fā)病率。乙肝病毒是一種DNA病毒。重組乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技術(shù)獲得的乙肝病毒表面抗原（一種病毒蛋白）?；卮鹣铝袉栴}。高考調(diào)頻考點(diǎn)——綜合考查

重組乙肝疫苗成分為蛋白質(zhì)，無法獨(dú)立在宿主體內(nèi)增殖。

鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。RNA聚合酶高考調(diào)頻考點(diǎn)——綜合考查(3)目的基因?qū)虢湍讣?xì)胞后，若要檢測目的基因是否插入染色體中，需要從酵母細(xì)胞中提取

進(jìn)行DNA分子雜交，DNA分子雜交時應(yīng)使用的探針是

。(4)若要通過實(shí)驗(yàn)檢測目的基因在酵母細(xì)胞中是否表達(dá)出目的蛋白，請簡要寫出實(shí)驗(yàn)思路。核染色體DNA被標(biāo)記的目的基因的單鏈DNA片段實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路：通過使用相應(yīng)抗體，利用抗原-抗體雜交技術(shù)，檢測mRNA是否翻譯形成蛋白質(zhì)。注：F1－F3，R1－R3表示引物；T－DNA－LB表示左邊界；T－DNA－RB表示右邊界；Ori表示復(fù)制原點(diǎn)；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。10題圖6．（2024·福建·高考真題節(jié)選）(1)利用PCR技術(shù)獲取目的基因hCD46，復(fù)性溫度下發(fā)生的擴(kuò)增過程是________________________________________________。(4)利用PCR技術(shù)對子代小鼠進(jìn)行hCD46基因檢測，應(yīng)設(shè)置不加DNA模板的對照組，目的是_____________________________________________________。7．（2024·安徽·高考真題節(jié)選）(1)擴(kuò)增X基因時，PCR反應(yīng)中需要使用TaqDNA聚合酶，原因是_____________________

__________________________________________________________________________________。兩種引物分別與含hCD46基因的兩條模板鏈結(jié)合排除PCR體系中外源DNA的污染在PCR反應(yīng)中，需要利用高溫使DNA雙鏈解旋，普通的DNA聚合酶在高溫下會變性失活，而TaqDNA聚合酶能夠耐高溫,在高溫條件下依然具有活性。9．(2024·新課標(biāo)真題節(jié)選)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證某血液樣品中有HIV，簡要寫出實(shí)驗(yàn)思路和預(yù)期結(jié)果。思路:從樣品中提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄得DNA,用HIV核酸特異性引物進(jìn)行PCR,電泳檢測PCR產(chǎn)物。結(jié)果: