微生物檢驗理論課 14衣原體 學習資料

衣原體

chlamydia南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院檢驗科陳佑明電話62784781郵箱cym38432@163.com教學內容與要求衣原體的生物概念與生物特性衣原體的分類與命名衣原體發(fā)育周期及原體與始體的區(qū)別對人致病的主要衣原體有哪些對人致病的主要三種衣原體感染患者的取材、培養(yǎng)及微生物學診斷衣原體的生物概念專性細胞內寄生獨特發(fā)育周期能透過細菌濾器衣原體的主要生物特性有DNA和RNA兩種核酸，其DNA為雙鏈有細胞壁，由LPS和蛋白質組成含有核糖體有獨特的發(fā)育周期細胞間感染相原體(elementarybody)細胞內繁殖相網(wǎng)狀體(reticulatebody)行二分裂方式繁殖能量代謝酶系統(tǒng)不完善，表現(xiàn)嚴格的細胞內寄生對多種抗生素敏感衣原體的發(fā)育周期原體→吸附→吞噬體(空泡)→在吞噬體內形成始體→二分裂繁殖→形成包涵體→在包涵體內成熟為原體→釋放。

性狀原體始體

形態(tài)球形或橢圓網(wǎng)狀大?。é蘭）0.2－0.40.5－1.0細胞壁堅硬

柔韌核物質致密稀疏

RNA：DNA1：13：1代謝活性-+胞外穩(wěn)定性+-感染性+-繁殖能力-+染色性(Giemsa)紫色藍色原體與始體的區(qū)別1.培養(yǎng)特點專性細胞內寄生，可在雞胚卵黃囊，小鼠和培養(yǎng)細胞中繁殖2.抵抗力抵抗力弱，耐冷怕熱，對消毒劑敏感。3.抗原結構與分型

屬特異抗原－脂多糖（LPS），位于細胞壁種特異抗原－主要外膜蛋白（MOMP）型特異抗原－MOMP氨基酸可變區(qū)，分型依據(jù)

其他生物學性狀衣原體的致病物質與致病機理致病物質促進衣原體吸附易感細胞，侵入機體阻止吞噬體和包涵體融合，使衣原體得以生存類似革蘭陰性菌感染的炎癥反應和遲發(fā)性變態(tài)反應使細胞釋放IL-1類細胞因子，導致機體損傷蛋白質LPS致病機理入侵機體→吸附易感細胞→細胞內陷形成包涵體→衣原體分裂繁殖→破壞細胞→釋放→感染其它細胞衣原體的分類

沙眼生物變種沙眼衣原體

淋巴肉芽腫變種

C.trachomatis

鼠生物變種肺炎衣原體

C.pneumoniae鸚鵡熱衣原體

C.psittaci貓心衣原體

C.pecorum衣原體屬衣原體及其所致疾病自然宿主人、小鼠人鳥、低等哺乳牛、羊所致疾病沙眼肺炎鳥、人類肺炎呼吸道感染性病呼吸道感染呼吸道感染幼兒肺炎包涵體糖原＋－－－血清型221(TWAR)不明3磺胺敏感性敏感耐藥耐藥耐藥原體形態(tài)圓橢圓梨形圓、橢圓圓沙眼肺炎鸚鵡熱家畜衣原體衣原體衣原體衣原體人類是其主要宿主可引起多種疾病，其中以沙眼（能致盲）、泌尿生殖道感染（非淋病尿道炎）常見，還能引起性病淋巴肉芽腫。五十年代，湯飛凡首先用雞胚卵黃囊接種分離沙眼亞種14個血清型(A,B,Ba,C,D,Da,E,F,G,H,I,Ia,J,K)性病淋巴肉芽腫亞種(LGV)4個血清型（L1，L2，L2a，L3）鼠亞種

4個血清型，不侵犯人沙眼衣原體微生物特性原體較小，Giemsa染色呈紫色，呈圓形或橢圓形，細胞壁致密，具有特殊的發(fā)育周期。始體Giemsa染色呈紅色，二分裂增繁殖。包涵體具有多形性，碘染色后呈褐色。專性細胞內寄生，可接種雞胚卵黃囊中生長繁殖，也可以在組織細胞內培養(yǎng)。微量免疫熒光法根據(jù)型特異抗原把三種亞種不同的血清型區(qū)別。

形態(tài)染色：常用Giemsa染色

Giemsa染色：原體（紫色），0.25-0.35um,卵圓形，中央有一致密的擬核網(wǎng)狀體（藍色）,0.5-1.0um，圓形或不規(guī)則形,無致密擬核，包含體（深紫色），多見箭頭所指為包含體

原體被碘溶液染成棕褐色

致病性與免疫性致病性：

不僅可致眼部感染，而且可引起生殖泌尿系統(tǒng)感染、性病淋巴肉芽腫以及其他器官疾病。近年沙眼衣原體的感染率和危害性已超過淋球菌而居性傳播疾病之首，因而日益受到醫(yī)學界的重視，鼠生亞種不致病。沙眼：通過眼-手-眼途徑直接或間接密切接觸傳播，致盲首位。包涵體結膜炎：由沙眼生物變種引起，經(jīng)產道或污物而感染。非淋菌性泌尿生殖道炎：性接觸傳播，引起泌尿生殖道感染。性病淋巴肉芽腫亞種：侵犯腹股溝淋巴結，引起化膿性淋巴結炎和慢性淋巴肉芽腫。免疫性產生特異性抗體，抗體持續(xù)時間短。也可出現(xiàn)補體結合抗體。衣原體性宮頸炎衣原體性尿道炎沙眼性病性淋巴肉芽腫鸚鵡熱衣原體首先從鸚鵡中分離出來，引起的感染成為職業(yè)病。生物學性狀與沙眼衣原體相似。最適生長溫度為39℃，碘染色陰性，對磺胺耐藥。耐熱抗原與沙眼衣原體LGV亞種有交叉反應。鸚鵡熱衣原體通過氣溶膠經(jīng)呼吸道傳播，主要引起呼吸道感染和肺炎。肺炎衣原體1989年定名，系嚴格的人類病原體。生物學性狀與其它種衣原體相差較大，碘染色陰性，對磺胺耐藥。經(jīng)飛沫（呼吸道）傳播，也可引起院內感染。主要引起青少年急性呼吸道感染，以肺炎多見，也可致氣管炎、咽炎。早期研究發(fā)現(xiàn)，肺炎衣原體慢性感染可能與冠心病、腦血管意外有關，但最新研究否定這種關聯(lián)。

微生物學檢查標本采集沙眼衣原體

1)眼結膜標本：采集眼結膜拭子/刮片標本，采集后的標本如果在8h內接種，可放置在2～8℃，否則應冰凍在-70℃或以下。

2)尿道及宮頸標本：參見支原體標本采集。

3)盆腔炎患者：無菌穿刺或在腹腔鏡直視下采集受累輸卵管標本，也可采集子宮內膜刮屑物。

4)LVG患者：可采集淋巴結膿液、直腸拭子和活檢。

微生物學檢查標本采集鸚鵡熱衣原體經(jīng)典的鸚鵡熱患者標本包括痰和血標本。肺炎衣原體鼻、咽拭子或吸液/洗液標本。

以上各種標本在采集后也應置于運輸保護液內，如含抗生素的2SP。微生物學檢查法

直接涂片鏡檢

Giemsa、碘液或熒光抗體染色鏡檢，檢查上皮細胞內有無包涵體。用光學顯微鏡觀察包涵體有診斷意義，特別在眼結膜、尿道及子宮頸上皮細胞內發(fā)現(xiàn)典型包涵體更有沙眼衣原體感染的參考分離培養(yǎng)

接種雞胚卵黃囊或傳代細胞，再用直接免疫熒光法或酶聯(lián)免疫法檢測。

1.細胞培養(yǎng)將標本拭子，用含抗生素的稀釋液制成10％-20％懸液。分離的細胞有McCoy、Hela-229細胞等。置5％CO2下培養(yǎng)。初代分離培養(yǎng)72-96h后傳代或盲傳。有癥狀病人90％標本第1代即可見包涵體，而無癥狀病人需傳代后才得到陽性。敏感性為80％-90％，特異性100％，是目前確診最可靠的方法，而且是評價實驗室診斷法的標準。2.雞胚培養(yǎng)有細菌污染的臨床標本加適當?shù)目股?如鏈霉素、慶大霉素和制霉菌素等)肉湯，在室溫中作用lh后，接種3-4只孵育7天的雞胚卵黃囊，35℃孵育，觀察至13天，收獲卵黃囊涂片，作Gimenez染色，鏡檢原體。3.鑒定將細胞培養(yǎng)蓋片用Giemsa或碘染色鏡檢胞質內包涵體。Giemsa染色比碘染色敏感，可作為鑒別沙眼衣原體的參考?？捎眯吞禺愋詿晒庋彖b定其型別。對于卵黃囊和小鼠分離的材料可用免疫熒光法鑒定原體或補體結合抗原。

分離培養(yǎng)衣原體培養(yǎng)要求

沙眼衣原體及肺炎衣原體培養(yǎng)可在BSL2級實驗室進行，而鸚鵡熱衣原體培養(yǎng)則需要在BSL3級實驗室進行。

核酸檢測

1)核酸雜交：用I125標記的衣原體rDNA探針檢測宮頸標本的敏感性和特異性，與培養(yǎng)相比分別為82.8％和99.4％。2)PCR：具有高度敏感性和特異性。一般按沙眼衣原體7．5kb質粒、MOMP序列及SrRNA基因序列設計引物。

PCR

PCR屬于一種核酸體外擴增技術，用寡核苷酸指導的DNA合成的重復循環(huán)來實現(xiàn)對靶核酸序列的擴增。PCR每個循環(huán)包含變性、退火、延伸3個步驟，在不到2小時內，經(jīng)過30個循環(huán)，在理論上可將最初的靶DNA擴增109倍。最后可用凝膠電泳或探針雜交檢測擴增的DNA。由于先將標本中的核酸特異成分先行擴增復制再行檢出，其敏感性較直接檢測核酸大大提高。

目前國內外用于構建引物的衣原體DNA有7.5Kb質粒、MOMP基因（omp1）和16SrRNA基因。診斷試劑盒AMPLICORCtPCR已通過食品和藥品管理局(FDA)的審批，其擴增靶序列即為質粒DNA。許多研究都已表明，PCR較培養(yǎng)法和EIA法都要敏感，而且PCR對于有癥狀或無癥狀人群同樣敏感。但基于不同引物的PCR的敏感性仍有所不同。Roosendaal等的研究表明，質粒引物PCR最敏感，omp1引物PCR最不敏感，16SrRNA基因引物PCR介于兩者之間。這可解釋為在每個衣原體細胞中DNA拷貝數(shù)不同的緣故。

PCR

雖然omp1引物PCR敏感性較質粒PCR為差，但omp1引物PCR擴增的特異性好，而且Palmer等報道通過巢式PCR，經(jīng)過2輪擴增，同樣能夠達到質粒引物PCR的敏感性。并且omp1擴增后，利用限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）還可對衣原體進行基因分型，這對流行病學調查具有重要意義。

檢測標本常用尿道或宮頸拭子，也可以采用尿液標本進行檢測。但尿中可能存在擴增的抑制物，從而影響PCR的敏感性。Verkooyen等報道將標本進行預先的加熱處理或使用SP轉運培養(yǎng)基可顯著降低AMPLICORCtPCR對抑制因子的易感性。將臨床標本加熱處理后10倍稀釋亦可在很大程度上防止這種抑制。

注意：尿中的抑制物會降低PCR的敏感性，而出現(xiàn)假陰性結果；污染容易造成假陽性結果。

免疫學檢測1.抗原檢測a)免疫熒光檢查：用熒光抗體檢測上皮細胞內衣原體抗原。標記抗衣原體LPS抗體，可與所有衣原體反應；而抗MOMP抗體有種、型特異性?？稍?h內即作出診斷并可分型。b)酶免疫檢測：能在數(shù)小時內檢測出衣原體可溶性抗原，并適用于同時檢測大量標本。c)免疫膠體金檢測：雙抗體夾心法。在膠體金顆?；蛉槟z顆粒表面標記抗衣原體LPS抗體，可與所有衣原體反應。臨床實驗室最常用的檢驗方法。

免疫熒光檢查涂片冷丙酮或甲醇固定

免疫學檢測2.抗體檢測目前檢測抗體的血清學方法在常規(guī)臨床診斷中價值較小。原因是不易獲得雙份血清，而且性傳播疾病的高危人群多有慢性重復感染，原有的抗體水平較高，因而限制了血清學方法的診斷價值。方法有補體結合試驗(CF)、微量免疫熒光試驗(MIF)、酶免疫法等。其中CF敏感性和特異性較差，而MIF敏感性和特異性較高。

標本（鏈霉素處理）

直接涂片培養(yǎng)核酸檢測Mac-Gie-甲碘熒克乳單雞黃細小核Pchia-msa醛染光隆膠克胚囊胞白酸CVello染色固色標抗吸隆