重組DNA技術的基本工具課件高二下學期生物人教版選擇性必修31

第1節(jié)重組DNA技術的基本工具【本節(jié)聚焦】1、重組DNA技術所需的三種基本工具是什么?它們的作用分別是什么?2、基因工程載體需要具備什么條件?第3章

基因工程雜交育種：同種生物之間進行誘變育種：基因突變（不定向）

蘇云金桿菌中存在一種毒蛋白基因（Bt基因），編碼出的毒蛋白能殺死害蟲。~~~~~~~操作對象：操作水平：基因（DNA）原理：基因重組結果：意義：定向改造生物遺傳特性；克服遠緣雜交不親和障礙定向改造“分子手術刀”“分子縫合針”“分子運輸車”剪下來的基因不能直接把它導入到受體內多數生物會排斥外來的基因，若直接導入會被降解。不同生物的DNA分子能拼接起來原因①DNA分子的基本組成單位相同，都是4種脫氧核苷酸②空間結構相同，都是規(guī)則的雙螺旋結構。③都遵循堿基互補配對原則基因工程的基本過程：剪切→拼接→導入→表達為什么一種生物的基因可以在另一種生物細胞內表達？②遺傳信息的傳遞都遵循中心法則③生物界共用一套遺傳密碼①基因是控制生物性狀的獨立遺傳單位。相同的遺傳信息在不同生物體內表達出相同的蛋白質。閱讀教材P71思考以下問題并回答1.限制酶的概念、化學本質、來源、種類、位置、作用、作用部位2.限制酶在原核生物中的主要作用3.為什么限制酶不切割細菌本身的DNA分子？4.限制酶的組成、識別序列長度、切割結果5.黏性末端、平末端的概念6.限制酶識別的特定序列特點概念來源：可人工合成（蛋白質）種類：（限制酶不是一種酶，而是一類酶）位置：

作用：主要起到切割外源DNA使之失效，從而達到保護自身的目的為什么限制酶不切割細菌本身的DNA分子？原核細胞內DNA分子不具備這種限制酶的識別序列，或者甲基化酶將甲基轉移到了限制酶所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。限制酶不能切開RNA分子的作用部位拓展——限制酶的命名：1.兩種限制酶識別的特定序列特點特點1：都可以找到一條中心軸線；特點2：中軸線兩側的雙鏈DNA上的堿基是反向、對稱、重復排列的，稱為回文序列。總結：能被限制酶所識別的序列一般都有回文序列DNA兩條單鏈的切口處，伸出幾個核苷酸，剛好能互補配對切口處是平整的識別序列為GAATTC磷酸二酯鍵識別序列為CCCGGG同種限制酶切割的黏性末端一定相同嗎？不同DNA分子用同一種限制酶切割形成的黏性末端都相同（酶的專一性，識別的序列相同）限制酶切一次可斷開

個磷酸二酯鍵，產生

個游離的磷酸基團，產生

個黏性末端。222要想獲得某個特定性狀的目的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產生幾個黏性(平)末端2個從5’往3’讀【練習1】：寫出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ________EcoRⅠ________HindⅢ________BglⅡ________GATCAATTAGCTGATC思考：不同種限制酶切出的黏性末端一定不同嗎？不同的限制酶切割可能產生相同的黏性末端。（比如BamHⅠ、BglⅡ）【練習2】下面哪項不具有限制酶識別序列的特征（）DA．GAATTCCTTAAG

B．GGGGCCCCCCCCGGGG

C．CTGCAGGACGTCD．CTAAATCGATTTAG【練習3】右側黏性末端是由______種限制酶作用產生的。3完全互補的黏性末端能通過氫鍵暫時連接在一起，但并不穩(wěn)定。兩個黏性末端由同一種限制酶切割產生判斷方法一看游離的堿基是否互補配對二看兩條鏈切點是否相同技巧：將其中一個黏性末端旋轉180°，若倆黏性末端完全相同，則說明來源于同一種閱讀教材P72思考以下問題并回答1.什么是DNA連接酶、種類、作用、作用對象、結果2.DNA連接酶和RNA連接酶的異同點3.限制酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、DNA(水解)酶解旋酶各自作用部位作用：可連接雙鏈DNA中的兩條單鏈缺口，但不能連接單鏈DNA無特異性只能連接具有互補黏性末端的DNA片段(1)可連接有互補黏性末端的DNA片段(2)也可連接平末端，但效率相對較低作用對象完整的重組DNA分子作用結果：DNA連接酶DNA聚合酶相同點作用實質化學本質不同點模板作用對象作用結果用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復制在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵拓展：幾種相關酶的比較名稱作用部位作用結果限制酶

DNA連接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶磷酸二酯鍵堿基對之間的氫鍵將DNA切成兩個片段磷酸二酯鍵將兩個DNA片段連接為一個DNA分子磷酸二酯鍵將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈1.(2022·天津耀華中學高二期中)以下是幾種不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列敘述正確的是（）A.以上DNA片段是由4種限制酶切割后產生的B.②片段是在識別序列為的限制酶作用下形成的C.①和④兩個片段在DNA聚合酶的作用下可形成重組DNA分子D.限制酶和DNA連接酶作用的部位都是磷酸二酯鍵如何將外源基因運入細胞呢？①④是由同一種限制酶切割而成的CGDNA連接酶D閱讀教材P72思考以下問題并回答1.基因進入受體細胞的載體有哪些2.什么是質粒、質粒DNA分子作為載體的條件3.為什么病毒可作為載體作用：在受體細胞內對目的基因進行大量復制種類：1.條件①：條件②將外源基因導入大腸桿菌等受體細胞條件③：條件④：載體DNA必須是安全的，不會對受體細胞有害種類2：將外源基因導入動物細胞將外源基因導入植物細胞一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細胞沒有抵抗該抗生素的能力原因：能夠侵染正常的細胞，還能將自己的核酸整合到受體細胞染色體上最常用的載體終止子:轉錄的終點，在轉錄過程中起調控作用。有切割位點（酶切位點）DNA復制的起始位點，并帶著插入的目的基因一起復制有標記基因的存在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。不能被酶切破壞質粒DNA分子質量一般為擬核的0.5%~3%重組DNA的篩選…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶可能是剪切位點或連接位點選得不對，也可能是其他原因不能，因為基因的長度一般在100個堿基對以上HindIII和BamHI1.用圖中外源DNA和質粒構建重組質粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是

。2.使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶切割，而不用EcoRⅠ一種限制酶切割，是為了防止

。SmaⅠ會破壞抗性基因和外源DNA中的目的基因目的基因、質粒自身環(huán)化及反向連接下列操作中選用哪種限制酶切割來構建重組質粒？a、選目的基因兩端和運載體都有的酶切位點；b、所選酶切位點不能破壞目的基因以及標記基因選擇酶切位點的原則：圖1圖22.某實驗小組利用下圖所示質粒和目的基因來構建基因表達載體,將目的基因導入大腸桿菌細胞并表達。下列敘述正確的是()A.圖中的質粒用酶A切割后,會產生8個游離的磷酸基團B.在構建重組質粒時,可用酶A和酶C切割質粒和目的基因C.成功導入目的基因的大腸桿菌可在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中生長D.若用酶B和酶C切割,可以避免質粒的自身環(huán)化D限制酶DNA連接酶載體①能自我復制或能整合到宿主DNA上②有一個至多個限制酶切割位點③有特殊的標記基因④對受體細胞無害質粒、噬菌體、動植物病毒基因工程的基本工具作為載體的條件種類:磷酸二酯鍵來源：主要來源于原核生物特點：作用部位：具有專一性結果：形成黏性末端或平末端連接部位：磷酸二酯鍵種類：

E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶作用：把兩條雙鏈DNA片段拼接起來（能識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列）課堂小結實驗：DNA的粗提取與鑒定實驗原理溶解DNA沸水浴DNA含量相對較高的生物組織不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞，因為哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和線粒體，幾乎不含DNA。溶解并提取DNA析出DNA要現配現用豬血和雞血，哪個適合用作提取DNA的材料？雞血中紅細胞有核DNA，雞血中加入檸檬酸鈉，可防止血液凝固目的：裂解細胞，釋放DNADNA會被吸附到濾紙上而大量損失，影響最終提取的DNA量。不可用濾紙成分：DNA、RNA以及蛋白質、脂質、糖類等低溫抑制DNA水解酶活性，防止DNA水解使蛋白質等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。目的：不白：雜質：核蛋白，多糖等①可抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解；②抑制分子運動，使DNA易形成沉淀析出；③低溫有利于增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂。作用減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子目的現配現用！實驗組對照組水浴加熱空白對照：在等體積的NaCl溶液中加入二苯胺試劑，將試管置于同等沸水浴中加熱5min。評價結果：（1）DNA純度看提取物顏色（2）DNA的量看與二苯胺反應顏色的深淺不藍：所提取的DNA含量低，或者在實驗操作過程中出現了失誤等。課后訓練1.從目標生物提取分離DNA是進行基因工程操作的基礎。以洋蔥為材料進行“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法正確的是()A．將蒸餾水加入切碎的洋蔥中充分研磨以釋放核DNAB．洋蔥研磨后應該使用墊有濾紙的漏斗進行過濾C．將濾液靜置后，取下層溶液加入95%的冷酒精D．將粗提取的DNA用二苯胺試劑鑒定會呈現藍色D2.限制酶和DNA連接酶是重組DNA技術中常用的工具酶，限制酶可將DNA分子切割成帶有黏性末端的DNA片段，而DNA連接酶可連接帶有黏性末端的DNA片段。據圖分析錯誤的是()A．圖示三個黏性末端一定由兩種不同的限制酶切割產生B．圖示中共有兩種黏性末端，其中甲與乙黏性末端為同一種C．a處核苷酸之間通過磷酸二酯鍵連接，b處核苷酸之間通過氫鍵連接D．催化甲形成的限制酶有可能不識別由甲、乙形成的重組DNA分子A3.根據基因工程的有關知識，回答下列問題。(1)限制性內切核酸酶切割DNA分子后產生的片段，其末端類型有____________和____________。(2)用EcoRⅠ切割質粒運載體后產生的片段如下：AATTC…GG…CTTAA為使運載體與目的基因相連，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割